李 軍 馬慶華 劉懷秀 宋 濤 滕洪明 朱 婷 劉 欣韓英倫 李慶偉

(1. 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 七鰓鰻研究中心, 大連 116081; 2. 遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院, 遼寧省水生動(dòng)物病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼陽(yáng) 111000)

七鰓鰻(Lamprey)是圓口綱無(wú)頜類脊椎動(dòng)物,現(xiàn)存脊椎動(dòng)物中最古老的類群[1]。由于重要的進(jìn)化地位, 七鰓鰻已成為研究發(fā)育生物學(xué)的關(guān)鍵物種[2,3]。七鰓鰻早期發(fā)育主要分為胚胎、卵黃囊仔魚和幼魚三個(gè)發(fā)育時(shí)期[3]。研究七鰓鰻早期發(fā)育可以了解胚胎、卵黃囊期仔魚和幼魚發(fā)育過(guò)程, 為七鰓鰻的發(fā)育學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料[4]。目前對(duì)七鰓鰻胚胎發(fā)育和卵黃囊期仔魚的生長(zhǎng)發(fā)育已有一些研究報(bào)道, 如Lampetra fluviatilis[5]、海七鰓鰻(Petromyzon marinus)[6]、Entosphenus tridentatus[7]和日本七鰓鰻(Lampetra japonica)[8]等。研究表明, 七鰓鰻胚胎和卵黃囊期仔魚的發(fā)育過(guò)程相似; 七鰓鰻胚胎具有與模式動(dòng)物胚胎(爪蟾和斑馬魚)相似的生物學(xué)特性, 是開展發(fā)育生物學(xué)研究的良好實(shí)驗(yàn)材料[9,10]。而七鰓鰻幼魚的生長(zhǎng)發(fā)育研究卻鮮有報(bào)道, 這與七鰓鰻幼魚不易采捕以及野外樣本的不確定性[11]有關(guān)。

東北七鰓鰻(Lampetra morii)是我國(guó)特有種[12,13]。相對(duì)于其他七鰓鰻, 東北七鰓鰻作為發(fā)育生物學(xué)的動(dòng)物模型更具優(yōu)勢(shì): (1)易于養(yǎng)殖, 東北七鰓鰻終生棲息于淡水環(huán)境[1,13], 易于采捕, 易于進(jìn)行增養(yǎng)殖研究;(2)個(gè)體較小, 東北七鰓鰻成體大小為160—250 mm,對(duì)比日本七鰓鰻(300—500 mm)[1,14]和海七鰓鰻(114—1200 mm)[15]等洄游型種類個(gè)體較小, 屬小型七鰓鰻, 易于實(shí)驗(yàn)操作; (3)生長(zhǎng)周期短, 東北七鰓鰻生長(zhǎng)周期為4—5年[1,13], 相對(duì)于日本七鰓鰻(6—7年)[1,13]和海七鰓鰻(5—8年)[16]等生長(zhǎng)周期短, 易于實(shí)現(xiàn)人工養(yǎng)殖; (4)懷卵量大, 東北七鰓鰻?wèi)崖蚜考s10萬(wàn)粒[13], 可為試驗(yàn)提供充足的胚胎和仔魚。東北七鰓鰻的生物學(xué)特點(diǎn)使其成為七鰓鰻研究中一個(gè)優(yōu)良物種, 而目前尚未有東北七鰓鰻胚胎發(fā)育、卵黃囊期仔魚和幼魚的生長(zhǎng)發(fā)育的報(bào)道。本研究開展東北七鰓鰻胚胎、卵黃囊期仔魚和幼魚發(fā)育研究, 較為系統(tǒng)地描述東北七鰓鰻的早期發(fā)育形態(tài)特征和生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律, 以期為七鰓鰻發(fā)育學(xué)研究提供基礎(chǔ)資料, 推進(jìn)七鰓鰻的模式化進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 材料

東北七鰓鰻親本[雌性: (22.78±2.37) g, (22.76±1.85) cm; 雄性: (27.08±5.03) g, (22.51±1.26) cm]采捕于鴨綠江水豐水庫(kù)(2015年4月至6月)。

東北七鰓鰻胚胎采用人工授精方法獲得, 在繁殖季節(jié), 根據(jù)東北七鰓鰻副性征及性腺成熟度, 共選取45尾親本(雌性15尾, 雄性30尾), 采用人工授精方法獲得胚胎[6,9]。當(dāng)雌雄親本具有明顯的副性征和繁殖行為時(shí), 用0.01% MS-222麻醉, 用手輕輕擠壓親魚的腹部, 將成熟的卵盛放在燒杯中(盛裝約300 mL養(yǎng)殖用水), 立即用同樣的方法向燒杯內(nèi)擠入精液, 混勻, 漂洗3—5次, 即可布入孵化缸, 獲得胚胎。

東北七鰓鰻卵黃囊期仔魚和幼魚均由胚胎培育獲得。

1.2 方法

東北七鰓鰻養(yǎng)殖、孵化和培育管理東北七鰓鰻親本在養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng), 養(yǎng)殖系統(tǒng)由水族箱(100 cm×50 cm×50 cm)、過(guò)濾系統(tǒng)和黑色陶粒砂(2—3 mm3)組成, 陶粒砂鋪在水族箱底部(10—15 cm高), 水高約40 cm, 水流約2 L/min。放養(yǎng)密度為30尾東北七鰓鰻/水族箱, 養(yǎng)殖水溫為5—18℃(11月至次年5月), 溶解氧≥5.0 mg/L, pH 7.0±0.2。

受精卵、初孵仔魚和幼魚均在孵化缸內(nèi)孵育,孵化缸由水族箱(50 cm×50 cm×50 cm)和養(yǎng)殖用沙粒(約0.5 mm3)組成, 每個(gè)孵化缸盛水高約40 cm, 缸底部鋪有約1.5 cm厚養(yǎng)殖用沙粒; 孵化缸內(nèi)每2枚胚胎間保持間距約為1 cm; 孵化缸內(nèi)投放初孵仔魚和幼魚的密度約200尾/缸。受精卵的孵化、初孵仔魚和幼魚培育采用靜水養(yǎng)殖, 用氣泵充氣, 胚胎孵化和初孵仔魚培育水溫(18±1)℃, 幼魚培育水溫(19±2)℃, 溶解氧≥5.0 mg/L, pH 7.0±0.2。

培育期間, 室內(nèi)保持安靜、弱光, 每天換等溫水1次, 換水量約為孵化缸內(nèi)水量的1/3, 養(yǎng)殖用水為充分曝氣至少3d的自來(lái)水。

東北七鰓鰻胚胎發(fā)育東北七鰓鰻胚胎發(fā)育觀察參照日本七鰓鰻胚胎發(fā)育觀察方法[8]。在體視鏡下(SMZ18, Nikon)觀察其發(fā)育形態(tài)特征和記錄胚胎發(fā)育起始時(shí)間, 當(dāng)其中50%以上胚胎出現(xiàn)某個(gè)時(shí)期發(fā)育特征則記為該發(fā)育階段的起始時(shí)間。分別收集各發(fā)育階段胚胎50—100枚, 用4%多聚甲醛固定, 4℃保存, 待東北七鰓鰻胚胎發(fā)育結(jié)束后, 在解剖鏡下觀察、照相。

東北七鰓鰻卵黃囊期仔魚的發(fā)育和異速生長(zhǎng)

試驗(yàn)選取同一天破膜孵出的仔魚1000尾用于試驗(yàn), 待仔魚卵黃囊完全吸收時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束, 實(shí)驗(yàn)周期為16d。每天取出30尾仔魚, 用濃度為0.01% MS 222麻醉, 在體視鏡下觀察其外部形態(tài)特征、照相,應(yīng)用NIS-Elements D 4.60.00軟件測(cè)量吻長(zhǎng)、眼徑、眼鰓間距、口笠長(zhǎng)、鰓前長(zhǎng)、鰓長(zhǎng)、頭長(zhǎng)、體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、泄殖孔長(zhǎng)和全長(zhǎng)各形態(tài)學(xué)指標(biāo)(精確至1 μm, 圖 1); 體重用分析天平測(cè)量, 每次稱量10尾仔魚(精確至0.0001 g), 共取3次, 取平均值。

東北七鰓鰻幼魚發(fā)育試驗(yàn)選取同一天破膜孵出500尾仔魚用于試驗(yàn)。每月取出30尾幼魚,幼魚用濃度為0.01% MS 222麻醉, 在體視鏡下觀察其外部形態(tài)特征、照相, 應(yīng)用軟件(NIS-Elements D 4.60.00軟件)和游標(biāo)卡尺測(cè)量全長(zhǎng)(精確至1 mm,圖 1), 用分析天平測(cè)量仔魚體重(精確至0.0001 g)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

圖 1 東北七鰓鰻卵黃囊期仔魚測(cè)量圖Fig. 1 Illustration of measurement of Lampetra morii yolk-sac larva1. 吻長(zhǎng); 2. 眼徑; 3. 眼鰓間距; 4. 口笠長(zhǎng); 5. 鰓前長(zhǎng); 6. 鰓長(zhǎng); 7.頭長(zhǎng); 8. 體長(zhǎng); 9. 尾長(zhǎng); 10. 泄殖孔長(zhǎng); 11. 全長(zhǎng)1. snout length, 2. eye length, 3. postocular length, 4. disc length,5. prebranchial length, 6. branchial length, 7. head length, 8. trunk length, 9. tail length, 10. cloacal slit length, 11. total length

2 結(jié)果

2.1 東北七鰓鰻親本形態(tài)性狀和繁殖行為

在非繁殖季節(jié)(9月至次年2月), 東北七鰓鰻成體無(wú)副性征, 不易鑒別雌雄。大多數(shù)時(shí)間, 東北七鰓鰻聚集在水族箱的一角, 極少游動(dòng)。在水族箱中投放餌料魚時(shí), 東北七鰓鰻逐漸活躍、靠近、叮咬餌料魚, 開始攝食。在繁殖季節(jié)(4—6月), 東北七鰓鰻十分活躍, 其在水族箱內(nèi)來(lái)回游動(dòng), 并不時(shí)向水面竄躍, 部分親本用口吸盤吸住缸壁, 或用口吸盤吸住較大石塊, 成排排列, 時(shí)而劇烈擺動(dòng)尾部, 攪動(dòng)底層陶粒砂。東北七鰓鰻在繁殖期間并未見其攝食活動(dòng)。

在繁殖季節(jié), 性成熟東北七鰓鰻具有副性征(圖 2A、2B), 隨成熟度增加, 背部第一背鰭和第二背鰭相互靠近, 直至2個(gè)背鰭在基部相連, 矗立在背部上方, 似山峰狀(圖 2A-a、2A-b、2B-a、2B-b);背鰭基部膨大(圖 2A-b、2B-b); 背鰭基部和中部充血, 可見毛細(xì)血管(圖 2A-b、2B-b); 泄殖孔腫脹(圖2A-c、2B-c)。東北七鰓鰻雌雄性的副性征并不完全相同, 雌性頭后至泄殖孔間腹部膨大, 性腺的外形明顯(圖 2A-a); 第二背鰭基部凸起(圖 2A-a、2A-b); 尾部明顯上翹(圖 2A-a); 臀鰭增厚膨大(圖 2A-b、2A-c); 泄殖孔表現(xiàn)出腫脹充血(圖 2A-b、2A-c),生殖孔凸出于泄殖孔(圖 2A-c), 解剖可見腹腔內(nèi)乳白色卵巢, 卵圓型卵游離于卵巢中。而雄性則表現(xiàn)出頭部和尾部稍向下彎, 其腹部稍膨大, 明顯小于雌性(圖 2B-a); 細(xì)長(zhǎng)的生殖孔凸出于泄殖孔(圖 2B-b、2B-c); 臀鰭較非生殖期增厚膨大, 但明顯小于雌性(圖 2B-b、2B-c), 解剖可見雄魚腹腔內(nèi)乳白色精巢。

2.2 東北七鰓鰻胚胎發(fā)育

東北七鰓鰻卵顏色為乳白色, 呈卵圓形(圖3A), 長(zhǎng)徑和短徑分別為(0.95±0.05)和(0.81±0.10)mm。卵受精后, 吸水膨脹, 受精膜舉起(圖 3B-a),受精膜外具有膠質(zhì)膜, 有弱黏性。

卵裂期受精后6—8h, 在受精卵表面出現(xiàn)凹痕, 即分裂溝(圖 3C-b), 受精卵開始第一次分裂。隨分裂溝不斷加深延長(zhǎng), 在中部環(huán)繞整個(gè)分裂球, 此時(shí)可見分裂球分成2個(gè)上下緊密相連、大小相似的細(xì)胞, 細(xì)胞呈半球形, 受精卵發(fā)育至2 細(xì)胞期(圖 3C)。受精后8—10h, 分裂球進(jìn)行第二次分裂,發(fā)育至4細(xì)胞期(圖 3D), 此次分裂面與第一次分裂面呈直角, 在分裂球表面可見2條垂直的分裂溝, 分裂球均勻地分成4個(gè)等大的細(xì)胞。在4細(xì)胞期后約2h, 分裂球發(fā)育至8細(xì)胞期(圖 3E), 在此期分裂球出現(xiàn)兩種分裂方式: (1) 分裂球同時(shí)出現(xiàn)2條分裂溝(與第一次出現(xiàn)的分裂溝垂直), 分裂成8個(gè)細(xì)胞(排成2行, 每行4個(gè)); (2) 出現(xiàn)1條分裂溝, 分裂溝與第一次和第二次出現(xiàn)的分裂溝呈直角, 分裂球分裂成上下兩層(每層各4個(gè)細(xì)胞)。隨后, 胚胎約每2h進(jìn)行一次卵裂, 依次進(jìn)入16細(xì)胞期(圖 3F)、32細(xì)胞期(圖 3G)、64細(xì)胞期(圖 3H)、128細(xì)胞期(圖 3I)和256細(xì)胞期(圖 3J)。

囊胚期受精后22—70h, 隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增加, 細(xì)胞明顯減小, 細(xì)胞數(shù)量逐漸增加, 分裂溝不明顯, 細(xì)胞間界線模糊, 整個(gè)胚胎發(fā)育成表面光滑的圓球型。在囊胚期初期, 胚胎內(nèi)部形成較大的囊胚腔(胚胎下半部分的動(dòng)物極呈半透明, 圖 3K),隨胚胎發(fā)育, 囊胚腔逐漸減小(動(dòng)物極透明部分逐漸減少, 圖 3L和 3M)。

圖 2 繁殖期東北七鰓鰻的形態(tài)性狀Fig. 2 Morphometric attributes of Lampetra morii at full sexual maturityA. 東北七鰓鰻雌魚; a. 雌魚(側(cè)面); b. 背鰭、臀鰭和泄殖孔(側(cè)面); c. 臀鰭和泄殖孔(腹面) B. 東北七鰓鰻雄魚; a. 雄魚(側(cè)面);b. 背鰭、臀鰭和泄殖孔(側(cè)面); c. 臀鰭和泄殖孔(腹面). 比例尺:1 cmA. L. morii female; a. side view of L. morii female; b. side view of dorsal fin, post-cloacal finfold and cloacal slit; c. ventral view of post-cloacal finfold and cloacal slit; B. L. morii male; a. side view of L. morii male; b. side view of dorsal fin, post-cloacal finfold and cloacal slit; c. ventral view of post-cloacal finfold and cloacal slit. Scale bars indicate 1 cm

原腸胚期受精后3—5d, 隨胚胎發(fā)育, 細(xì)胞分裂次數(shù)增加, 數(shù)量繼續(xù)增加, 個(gè)體不斷減小, 原腸期胚胎植物極細(xì)胞被動(dòng)物極細(xì)胞所包裹。胚胎植物極一端形成一拱形狹長(zhǎng)的裂縫(圖 3N-c)。隨動(dòng)物極細(xì)胞數(shù)量不斷增加、移動(dòng)和包裹, 胚胎體積減小, 胚孔不斷內(nèi)陷、擴(kuò)大, 并逐漸向腹面遷移(圖3O-c、3P-c和3Q-c)。

神經(jīng)胚期受精后5—6d, 胚胎發(fā)育至神經(jīng)胚期(圖 3R、3S和3T)。此期胚胎胚孔背側(cè)增厚延至胚胎前端, 背側(cè)發(fā)育較平直, 胚孔遷移至胚胎的末端(圖 3R-c和3T-c), 整個(gè)胚胎呈倒三角形。胚胎背部的外胚層不斷增厚, 發(fā)育成神經(jīng)基板, 神經(jīng)基板中央下陷, 兩側(cè)外胚層隆起, 發(fā)育形成兩條神經(jīng)褶, 在胚胎背中線區(qū)域形成神經(jīng)溝(圖 3S-d和3T-d)。胚胎神經(jīng)褶在背中線合并, 形成神經(jīng)管。

頭凸期受精后6—8d, 胚胎發(fā)育至頭凸期(圖 3U、3V和3W)。此期頭部(圖 3U-e和圖3V-e)凸出于卵黃囊, 在頭部腹側(cè)可觀察到凹陷, 咽部凸起(圖 3U-f和圖3V-f)。胚體增厚, 背部神經(jīng)管(圖 3U-g和圖3W-g)明顯凸起, 從頭部延伸至胚體末端; 橢圓形的卵黃囊(圖 3U-h、3V-h和3W-h)位于胚體后部, 胚孔(圖 3V-c)遷移至卵黃囊末端。

孵出前期受精后8—11d, 胚胎發(fā)育至孵出前期(圖 3X和圖 3Y)。在早期(圖 3X), 頭部(圖 3X-e)伸長(zhǎng), 并出現(xiàn)間歇性擺動(dòng)。隨胚胎發(fā)育, 頭部和軀干部進(jìn)一步拉伸, 胚體伸長(zhǎng), 胚胎在受精膜內(nèi)卷曲(圖 3Y)。在軀干部可見胚胎背側(cè)肌節(jié)(圖 3Y-i),卵黃囊由球型收縮成長(zhǎng)條狀(圖 3Y-h), 頭部間歇性擺動(dòng)加快, 整個(gè)胚胎有規(guī)律地顫動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)。

孵出期隨胚胎生長(zhǎng)和發(fā)育, 在受精后11—12d, 仔魚孵出(圖 3Z和圖 3Z-1)。初孵仔魚體色為乳白色, 身體未完全伸直, 后部彎曲, 呈現(xiàn)“J”型; 初孵仔魚極少活動(dòng)。在仔魚頭部(圖 3Z-e和圖3Z-1-e)腹側(cè)可觀察到鼻凹(圖 3Z-j和圖 3Z-1-j)和口凹(圖 3Z-k和圖 3Z-1-k), 兩側(cè)可見鰓原基(圖 3Z-2-l)。在軀干部, 前端可見心臟(圖 3Z-1-m)和肝臟(圖3Z-1-n), 背側(cè)可見神經(jīng)管(圖 3Z-1-g)和肌節(jié)(圖 3Z-1-i)。卵黃囊(圖 3Z-h和圖 3Z-1-h)位于軀干部的中后部, 呈長(zhǎng)條形棒狀, 前細(xì)后粗。初孵仔魚全長(zhǎng)為(0.29±0.02) cm, 體重為(0.00032±0.00002) g。

2.3 卵黃囊期仔魚生長(zhǎng)和發(fā)育

卵黃囊期仔魚的生長(zhǎng)發(fā)育初孵仔魚(0日齡)形態(tài)特征如2.2孵出期所描述(圖 3Z、3Z-1和3Z-2)。1日齡仔魚軀干后部及尾部向后拉伸, 身體較前一日平直, 僅靠近尾部分及尾部彎曲, 全長(zhǎng)增加,整個(gè)身體透明度增加(圖 4A)。在頭部(圖 4A-1-a)腹側(cè)鼻凹(圖 4A-1-b)和口凹(圖 4A-1-c)加深、擴(kuò)大, 鼻凹前移; 鰓原基增大(圖 4A-1-d), 輪廓更加清晰, 鰓籠已具備雛形。在軀干部前端可見心臟膨大(圖 4A-1-h), 有一心房一心室。軀干后部卵黃囊減小(圖 4A-1-j), 卵黃開始吸收。身體背側(cè)肌節(jié)明顯(圖 4A-1-g), 出現(xiàn)背鰭(圖 4A-1-k)。在孵出后第2天, 仔魚的全長(zhǎng)增加, 尾部仍未平直, 魚體透明度增加(圖 4B)。頭部背側(cè)黑色素增加, 口和鼻凹陷加深并擴(kuò)大, 鼻前移(圖 4B-b), 鰓孔增大, 外部輪廓清晰。身體背側(cè)肌節(jié)明顯, 軀干部及尾部卵黃囊減小。3日齡仔魚尾部向后伸展, 尾部與軀干基本平直, 仔魚透明度增加(圖 4C)。在頭部背側(cè)前端, 色素增加; 頭部腹面口凹陷加深擴(kuò)大, 鼻凹陷前移(圖4C-b); 鰓孔輪廓清晰, 增大, 外部形態(tài)呈圓角方形。心臟開始博動(dòng), 在心臟內(nèi)可見紅色血液流動(dòng)(圖 4C-h)。隨仔魚的發(fā)育, 卵黃吸收, 卵黃囊減小。背褶發(fā)育, 出現(xiàn)尾鰭(圖 4C-l)。在尾部腹側(cè)可見肛門雛形(圖 4C-m)。隨仔魚發(fā)育, 仔魚(4日齡)的透明度增加(圖 4D), 全長(zhǎng)增長(zhǎng)。頭部口凹加深、擴(kuò)大, 形成口笠(圖 4D-1-n); 口笠內(nèi)可見瓣膜(圖 4D-1-r); 鼻凹陷向移至頭部前端(圖 4D-1-b); 眼點(diǎn)有少量色素沉著(圖 4D-1-o); 鰓孔擴(kuò)大, 輪廓清晰; 在第一鰓孔上方和眼的后方, 橢圓形耳囊形成(圖 4D-1-p), 耳囊內(nèi)可見耳石(圖 4D-1-q)。在頭部、軀干部體側(cè)(卵黃囊的背側(cè))和背側(cè)色素增加,呈“一”字型自前向后分布(圖 4D-1-e)。背褶和尾鰭進(jìn)一步發(fā)育。4日齡仔魚開始上浮, 自由游動(dòng)。如圖 4E所示, 仔魚(5日齡)全長(zhǎng)增加。頭部口笠進(jìn)一步發(fā)育, 擴(kuò)大, 口笠內(nèi)可見質(zhì)膜觸手(圖 4E-1-s); 鼻移至頭部背側(cè); 眼點(diǎn)色素沉著, 形成一圓形黑點(diǎn); 鰓籠發(fā)育, 鰓孔擴(kuò)大, 輪廓清晰; 頭部、軀干部體側(cè)和背部色素明顯增加。背褶和尾鰭膨大, 透明度增加。肛門形成一管狀結(jié)構(gòu)(圖 4E-2-m)。6日齡仔魚(圖 4F)口笠擴(kuò)大。鰓部發(fā)育, 主要表現(xiàn)為鰓籠增長(zhǎng),鰓孔增大。身體色素增加。肛門形成一管狀結(jié)構(gòu)與外界相通(圖 4F-1-m), 其他形態(tài)較前一日基本相同。6日齡仔魚鉆入底層養(yǎng)殖沙中營(yíng)穴居生活。隨仔魚的發(fā)育, 7—8日齡仔魚透明度增加(圖 4G、H)?？隗议_口于頭部前端, 口瓣開始活動(dòng)。鰓孔增大, 鰓部輪廓清晰。仔魚色素增加。隨卵黃吸收,卵黃囊明顯減小。其他形態(tài)特征與前一日基本相同。9日齡仔魚(圖 4I)的肝臟的前部出現(xiàn)膽囊(圖4I-1-t), 其他形態(tài)特征與前一日基本相同。如圖4J、4K、4L、4M和4N所示, 10—14日齡仔魚色素增加。頭部各組織和器官明顯發(fā)育, 口笠擴(kuò)大, 鰓籠生長(zhǎng)明顯, 主要表現(xiàn)為鰓孔增大, 輪廓清晰。10—14日齡仔魚形態(tài)特征與9日齡基本相似。15日齡仔魚(圖 4O)的透明度增加, 體色加深。頭部各組織和器官明顯發(fā)育, 口笠擴(kuò)大, 鰓籠生長(zhǎng)明顯, 主要表現(xiàn)為鰓孔增大, 輪廓清晰。卵黃囊完全吸收, 消化道貫通, 形成腸道, 開始濾食, 腸道充盈食物。

如圖 5所示, 東北七鰓鰻卵黃囊期仔魚的體重和全長(zhǎng)均隨日齡增加而增長(zhǎng)。初孵仔魚的體重和全長(zhǎng)分別為(0.00032±0.00002) g和(0.29±0.02) cm,經(jīng)15d卵黃囊期生長(zhǎng)發(fā)育成幼魚, 此時(shí)幼魚體重和全長(zhǎng)分別為(0.0012±0.0003) g和(0.80±0.06) cm。

卵黃囊期仔魚身體各部分的異速生長(zhǎng)東北七鰓鰻仔魚在卵黃囊期發(fā)育過(guò)程中, 頭長(zhǎng)(圖6A)、體長(zhǎng)(圖 6B)和尾長(zhǎng)(圖 6C)均表現(xiàn)出異速生長(zhǎng)現(xiàn)象。仔魚頭長(zhǎng)(1.421±0.102) mm和尾長(zhǎng)(0.592±0.066) mm均在6日齡出現(xiàn)生長(zhǎng)拐點(diǎn)。頭長(zhǎng)的異速生長(zhǎng)指數(shù)在生長(zhǎng)拐點(diǎn)前后分別為0.948 (P＞0.05)和2.563 (P＜0.05), 相對(duì)于全長(zhǎng)生長(zhǎng)速率分別表現(xiàn)為等速生長(zhǎng)和正異速生長(zhǎng)。尾長(zhǎng)異速生長(zhǎng)指數(shù)在生長(zhǎng)拐點(diǎn)前后分別為3.373 (P＜0.05)和2.176 (P＜0.05), 尾長(zhǎng)生長(zhǎng)速率在生長(zhǎng)拐點(diǎn)前后相對(duì)于全長(zhǎng)生長(zhǎng)速率均表現(xiàn)出正異速生長(zhǎng)。而仔魚體長(zhǎng)在卵黃囊期內(nèi)未出現(xiàn)生長(zhǎng)拐點(diǎn), 異速生長(zhǎng)指數(shù)為0.352 (P＜0.05),表現(xiàn)為負(fù)異速生長(zhǎng)。

圖 4 東北七鰓鰻卵黃囊期仔魚外部形態(tài)特征Fig. 4 External view of Lampetra morii yolk-sac larva (head pointing left)A. 1日齡仔魚; A-1. 1日齡仔魚放大圖; B. 2日齡仔魚; C. 3日齡仔魚; D. 4日齡仔魚; D-1. 4日齡仔魚放大圖; E. 5日齡仔魚; E-1. 5日齡仔魚放大圖; E-2. 5日齡仔魚放大圖; F. 6日齡仔魚; F-1. 6日齡仔魚放大圖; G. 7日齡仔魚; H. 8日齡仔魚; I. 9日齡仔魚; I-1. 9日齡仔魚放大圖; J. 10日齡仔魚; K. 11日齡仔魚; L. 12日齡仔魚; M. 13日齡仔魚; N. 14日齡仔魚; O. 15日齡仔魚. a. 頭部; b. 鼻凹; c. 口凹; d. 鰓原基; e. 色素細(xì)胞; f. 神經(jīng)管; g. 肌節(jié); h. 心臟雛形; i. 肝臟雛形; j. 卵黃囊; k. 背鰭; l. 尾鰭; m. 肛門; n. 口笠; o. 眼; p. 耳囊; q. 耳石; r.瓣膜; s. 質(zhì)膜觸手; t. 膽囊; 比例尺: 1.0 mmA. 1-day old larva, A-1. enlargement of 1-day old larva, B. 2-day old larva, C. 3-day old larva, D. 4-day old larva, D-1. enlargement of 4-day old larva, E. 5-day old larva, E-1. enlargement of 5-day old larva, E-2. enlargement of 5-day old larva, F. 6-day old larva, F-1. enlargement of 6-day old larva, G. 7-day old larva, H. 8-day old larva, I. 9-day old larva, I-1. enlargement of 9-day old larva, J. 10-day old larva, K. 11-day old larva, L. 12-day old larva, M. 13-day old larva, N. 14-day old larva, O. 15-day old larva. a. head; b. nostril opening; c. mouth opening; d. gill anlagen; e. melanocyte; f. neurocoel; g. myomere; h. rudiment of heart; i. rudiment of liver; j. yolk sac; k. dorsal finflod; l.caudal finflod; m. rudiment of anus; n. oral hood; o. eye spot; p. otocyst; q. otolith; r. velum; s. oral cirri; t. gall bladder. Scale bars indicate 1.0 mm

卵黃囊期仔魚頭部器官的異速生長(zhǎng)東北七鰓鰻卵黃囊期仔魚的頭部器官中, 吻長(zhǎng)、眼徑、眼鰓間距、口笠長(zhǎng)、鰓前長(zhǎng)和鰓長(zhǎng)均隨日齡的增加而增長(zhǎng), 但其生長(zhǎng)速率相對(duì)于全長(zhǎng)的生長(zhǎng)速率并不相同。仔魚吻長(zhǎng)的生長(zhǎng)拐點(diǎn)出現(xiàn)在9日齡[吻長(zhǎng):(0.595±0.055) mm, 全長(zhǎng): (6.532±0.305) mm], 生長(zhǎng)拐點(diǎn)前異速生長(zhǎng)指數(shù)為3.326 (P＜0.05), 生長(zhǎng)拐點(diǎn)后生長(zhǎng)指數(shù)為2.271 (P＜0.05), 均表現(xiàn)為正異速生長(zhǎng)(圖 7A)。仔魚的眼徑和眼鰓間距在卵黃囊期內(nèi)并未出現(xiàn)生長(zhǎng)拐點(diǎn), 眼徑異速生長(zhǎng)指數(shù)為1.152 (P＞0.05),表現(xiàn)為等速生長(zhǎng)(圖 7B); 眼鰓間距異速生長(zhǎng)指數(shù)為0.687 (P＜0.05), 表現(xiàn)為負(fù)異速生長(zhǎng)(圖 7C)?？隗议L(zhǎng)在12日齡出現(xiàn)生長(zhǎng)拐點(diǎn)[口笠長(zhǎng): (0.315±0.023) mm,全長(zhǎng): (7.023±0.265) mm], 在生長(zhǎng)拐點(diǎn)前其異速生長(zhǎng)指數(shù)為0.870 (P＜0.05), 表現(xiàn)為負(fù)異速生長(zhǎng), 而在生長(zhǎng)拐點(diǎn)后其異速生長(zhǎng)指數(shù)為2.888 (P＜0.05), 表現(xiàn)為正異速生長(zhǎng)(圖 7D)。仔魚的鰓前長(zhǎng)在卵黃囊期內(nèi)并未出現(xiàn)生長(zhǎng)拐點(diǎn), 其異速生長(zhǎng)指數(shù)為1.546(P＜0.05), 表現(xiàn)為正異速生長(zhǎng)(圖 7E)。仔魚的鰓長(zhǎng)在8日齡出現(xiàn)生長(zhǎng)拐點(diǎn)[鰓長(zhǎng): (0.929±0.064) mm, 全長(zhǎng): (6.437±0.296) mm], 生長(zhǎng)拐點(diǎn)前的異速生長(zhǎng)指數(shù)為1.160 (P＞0.05), 表現(xiàn)出等速生長(zhǎng); 而生長(zhǎng)拐點(diǎn)后的異速生長(zhǎng)指數(shù)為1.477 (P＜0.05), 表現(xiàn)出正異速生長(zhǎng)(圖 7F)。

卵黃囊期仔魚尾部器官的異速生長(zhǎng)在卵黃囊期內(nèi), 東北七鰓鰻仔魚泄殖孔長(zhǎng)并未出現(xiàn)生長(zhǎng)拐點(diǎn)。泄殖孔長(zhǎng)的異速生長(zhǎng)指數(shù)為0.589 (P＜0.05),其生長(zhǎng)速率相對(duì)于全長(zhǎng)生長(zhǎng)速率表現(xiàn)出負(fù)異速生長(zhǎng)(圖 8)。

圖 5 東北七鰓鰻卵黃囊期仔魚體重和全長(zhǎng)與日齡的關(guān)系Fig. 5 The daily body weight and total length of Lampetra morii yolk-sac larva

圖 6 東北七鰓鰻卵黃囊期仔魚身體各部分異速生長(zhǎng)曲線及表達(dá)函數(shù)Fig. 6 Allometric growth curve and function of body parts of Lampetra morii yolk-sac larva

2.4 幼魚生長(zhǎng)發(fā)育

在1—5月齡幼魚的發(fā)育過(guò)程中, 幼魚大部分時(shí)間在缸底部的養(yǎng)殖沙中穴居, 活動(dòng)能力較強(qiáng), 其體色明顯隨月齡的增加而逐漸加深, 主要表現(xiàn)黑色素在幼魚頭部的口笠部、眼睛周圍、鰓孔的周圍和背側(cè), 軀干部體側(cè)(側(cè)線位置)和背側(cè)、心臟的背側(cè)以及尾部等部位的體表明顯增多, 身體透明度逐漸減小。其他外部形態(tài)特征無(wú)明顯的變化(圖9 A—E)。

在幼魚(1—5月齡)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中, 體重和全長(zhǎng)均隨日齡增加而增長(zhǎng)。在15日齡時(shí), 幼魚的體重和全長(zhǎng)分別為(0.0012±0.0003) g和(0.80±0.06) cm;經(jīng)5個(gè)月的生長(zhǎng)和發(fā)育, 150日齡幼魚的體重和全長(zhǎng)分別為(0.07±0.01) g和(3.87±0.32) cm (圖 10)。

3 討論

3.1 東北七鰓鰻副性征和繁殖行為

副性征是指性成熟動(dòng)物外表所顯示出的雌雄特征[17], 具有季節(jié)性變化, 是性腺發(fā)育的外觀特征,成為其鑒別雌雄的主要依據(jù)。本研究表明, 在繁殖季節(jié)室內(nèi)暫養(yǎng)的東北七鰓鰻雌性和雄性個(gè)體顯示出副性征, 與海七鰓鰻[6,9,18]、雷氏七鰓鰻(Lampetra reissneri)[19]、Lampetra lamptteni[17]、Ichthyomyzon fossor[17]、Ichthyomyzon castaneus[17]和Ichthyomyzon unicuspis[17]相似。但不同七鰓鰻物種的副性征并不相同, 具有各自特點(diǎn), 如性成熟海七鰓鰻在鰓孔后方的背部至第一背鰭出現(xiàn)一“線狀組織”[16]; 性成熟I. castaneus[17]和I. unicuspis[17]的泄殖孔并未出現(xiàn)腫脹和充血現(xiàn)象。

以上研究表明, 東北七鰓鰻成體在室內(nèi)暫養(yǎng)越冬后, 在繁殖季節(jié)顯示出副性征和繁殖行為, 表明其在室內(nèi)越冬的可行性, 為東北七鰓鰻的人工養(yǎng)殖奠定了基礎(chǔ)。同時(shí), 為七鰓鰻的繁殖生物學(xué)研究和人工繁殖提供了參考依據(jù)。

圖 7 東北七鰓鰻卵黃囊期仔魚頭部各器官的異速生長(zhǎng)曲線及表達(dá)函數(shù)Fig. 7 Allometric growth curve and function of head organs of Lampetra morii yolk-sac larva

3.2 東北七鰓鰻的早期發(fā)育

卵徑是反映動(dòng)物生活史進(jìn)化過(guò)程的一個(gè)重要的生物學(xué)特征, 其大小與環(huán)境相關(guān), 是長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果。已有研究報(bào)道溪水型七鰓鰻卵徑大于洄游型七鰓鰻卵徑[20,21]。本研究表明, 東北七鰓鰻卵徑[長(zhǎng)徑為(0.95±0.05) mm、短徑為(0.81±0.10)mm]大于同一地區(qū)洄游型日本七鰓鰻卵徑(長(zhǎng)徑和短徑分別為0.846和0.759 mm[8])。Yamazaki等[21]認(rèn)為, 七鰓鰻表型特征應(yīng)向小體型(繁殖期)、大卵徑和低繁殖力的生物特征進(jìn)化, 這可能與七鰓鰻的產(chǎn)卵場(chǎng)環(huán)境惡劣有關(guān)(如餌料缺乏、水溫低、水流速快等), 體積相對(duì)較大的卵能獲得更大的生存機(jī)率。

本研究參考海七鰓鰻[6]、E. tridentatus[7]、日本七鰓鰻[8]和L. reissneri[19]外部形態(tài)特征劃分東北七鰓鰻胚胎發(fā)育時(shí)期。研究表明, 東北七鰓鰻卵形態(tài)、卵裂方式、胚胎發(fā)育和卵黃囊期仔魚發(fā)育與海七鰓鰻[6]、E. tridentatus[7]、日本七鰓鰻[8]和L.reissneri[19]相似。曲漱惠等[22]認(rèn)為劃分胚胎發(fā)育時(shí)期不僅依據(jù)其外部形態(tài)特征, 還應(yīng)結(jié)合胚胎內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)變化特點(diǎn)。李軍等[8]研究日本七鰓鰻胚胎發(fā)育過(guò)程中的外部形態(tài)和內(nèi)部組織結(jié)構(gòu), 確定胚胎在64細(xì)胞期和128細(xì)胞期分別進(jìn)入囊胚期和原腸期。這與本研究結(jié)果并不相同, 所以在下一步研究工作中, 結(jié)合東北七鰓鰻各胚胎發(fā)育時(shí)期內(nèi)部組織結(jié)構(gòu),開展東北七鰓鰻胚胎發(fā)育研究。

東北七鰓鰻初孵仔魚全長(zhǎng)(0.29±0.02) cm與日本七鰓鰻(0.30±0.03) cm[23]和海七鰓鰻[6](0.3—0.5 cm)相近; 而其體重(0.00032±0.00002) g大于日本七鰓鰻(0.00016±0.00003) g[23]。經(jīng)過(guò)卵黃囊期, 東北七鰓鰻幼魚較日本七鰓鰻[23]的個(gè)體大, 卵黃囊期仔魚生長(zhǎng)速率(0.034 cm/d、0.000059 g/d)高于日本七鰓鰻(0.027 cm/d、0.000035 g/d)。在幼魚期, 經(jīng)5個(gè)月的生長(zhǎng)和發(fā)育, 與在同一條件下室內(nèi)養(yǎng)殖的日本七鰓鰻[23]相比, 東北七鰓鰻幼魚同樣表現(xiàn)出生長(zhǎng)速率快, 個(gè)體較大。與野外采捕的1齡L. planeri和海七鰓鰻個(gè)體(全長(zhǎng)3—4 cm)[16]相近。東北七鰓鰻早期發(fā)育階段生長(zhǎng)速率與物種、棲息地理微環(huán)境以及幼魚的密度等密切相關(guān)[16], 同時(shí)也可能與室內(nèi)良好的養(yǎng)殖水質(zhì), 相對(duì)較高的水溫以及豐富、營(yíng)養(yǎng)均衡的餌料有關(guān)。東北七鰓鰻的早期發(fā)育研究不但為七鰓鰻的發(fā)育學(xué)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù), 還顯示東北七鰓鰻是適合室內(nèi)養(yǎng)殖的優(yōu)良物種。

圖 8 東北七鰓鰻卵黃囊期仔魚泄殖孔異速生長(zhǎng)曲線及表達(dá)函數(shù)Fig. 8 Allometric growth curve and function of cloacal length of Lampetra morii yolk-sac larva

圖 9 東北七鰓鰻幼魚外部形態(tài)特征Fig. 9 External view of Lampetra morii ammocoeteA. 30日齡幼魚; B. 60日齡幼魚; C. 90日齡幼魚; D. 120日齡幼魚; E. 150日齡幼魚. 比例尺: A—B. 1.0 mm; C—E. 1.0 cmA. 30-day old ammocoete, B. 60-day old ammocoete, C. 90-day old ammocoete, D. 120-day old ammocoete, E. 150-day old ammocoete.A—B scale bars indicate 1.0 mm; C—E scale bars indicate 1.0 cm

3.3 東北七鰓鰻卵黃囊期仔魚的異速生長(zhǎng)

在水生生物的早期發(fā)育過(guò)程中, 組織形成和器官分化是極其重要而又復(fù)雜的過(guò)程, 其在外部形態(tài)、新陳代謝以及生活行為上的變化是生物體為適應(yīng)外界環(huán)境做出的選擇[24]。在七鰓鰻早期發(fā)育過(guò)程中, 仔魚的感覺(jué)、攝食、呼吸和游泳器官的異速生長(zhǎng)是長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中保留下來(lái)的發(fā)育特征[8],目的是使仔魚能夠在最短的時(shí)間內(nèi)獲得早期生存的各項(xiàng)能力。

卵黃囊期, 東北七鰓鰻仔魚頭長(zhǎng)和尾長(zhǎng)的生長(zhǎng)速率相對(duì)于全長(zhǎng)均表現(xiàn)為正異速生長(zhǎng), 而體長(zhǎng)則為負(fù)異速生長(zhǎng), 與日本七鰓鰻仔魚的異速生長(zhǎng)現(xiàn)象相似[8]。七鰓鰻頭部的正異速生長(zhǎng), 可以更好地保證組織和器官發(fā)育, 如大腦、視覺(jué)、呼吸和攝食器官。其次, 頭長(zhǎng)和尾長(zhǎng)的正異速生長(zhǎng)能增強(qiáng)仔魚的游泳能力, 而體長(zhǎng)的負(fù)異速生長(zhǎng)則能有效地控制七鰓鰻的全長(zhǎng), 減小頭部與尾部間的距離, 有利于游動(dòng)中身體平衡[25]。東北七鰓鰻頭長(zhǎng)和尾長(zhǎng)出現(xiàn)生長(zhǎng)拐點(diǎn)時(shí)間(6日齡)與日本七鰓鰻出現(xiàn)生長(zhǎng)拐點(diǎn)的時(shí)間相近[8], 這可能與其開始穴居生活方式有關(guān)[8]。

圖 10 東北七鰓鰻幼魚體重、全長(zhǎng)與日齡的關(guān)系Fig. 10 The body weight and total length of Lampetra morii ammocoete

口笠是仔魚的攝食器官, 直接決定了濾食能力的強(qiáng)弱。東北七鰓鰻的口笠的異速生長(zhǎng)與日本七鰓鰻相似[8], 在生長(zhǎng)拐點(diǎn)后呈正異速生長(zhǎng)?？隗业陌l(fā)育與吻長(zhǎng)和鰓前長(zhǎng)關(guān)系密切, 吻長(zhǎng)和鰓前長(zhǎng)快速發(fā)育為口笠的生長(zhǎng)提供了適當(dāng)?shù)目臻g[8]。而東北七鰓鰻在卵黃囊期泄殖孔表現(xiàn)的負(fù)異速生長(zhǎng)現(xiàn)象則與日本七鰓鰻不同。

東北七鰓鰻鰓長(zhǎng)的異速生長(zhǎng)與日本七鰓鰻相同[8]。東北七鰓鰻初孵仔魚在水底生存, 約在6日齡開始穴居生活。鰓長(zhǎng)在8日齡出現(xiàn)生長(zhǎng)拐點(diǎn), 生長(zhǎng)拐點(diǎn)后鰓長(zhǎng)的正異速生長(zhǎng)速度高于生長(zhǎng)拐點(diǎn)前。鰓的正異速生長(zhǎng)加快了鰓的發(fā)育, 能夠保證仔魚獲得足夠的溶解氧, 這可能與其穴居生活方式有關(guān)[8]。眼鰓間距在卵黃囊期一直處于負(fù)異速生長(zhǎng), 為鰓的正異速生長(zhǎng)提供了足夠的空間[8]。

七鰓鰻仔魚和幼魚主要在水底和底層泥沙中營(yíng)穴居生活, 其棲息環(huán)境較暗, 以被動(dòng)濾食腐植碎片、有機(jī)碎屑和浮游生物等為生, 眼睛的發(fā)育對(duì)于七鰓鰻仔魚的早期生存作用較小, 這可能是東北七鰓鰻和日本七鰓鰻眼徑呈負(fù)異速生長(zhǎng)的主要原因[8]。

綜上所述, 東北七鰓鰻卵黃囊期仔魚發(fā)育過(guò)程中存在異速生長(zhǎng)現(xiàn)象, 是其適應(yīng)環(huán)境的重要生長(zhǎng)策略。