黃 瑩 姚 遠 朱曉鳴 王壽昆 許偉華 劉雨龍 陳新華,

(1. 福建農林大學動物科學學院, 福州 350002; 2. 中國科學院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室, 武漢430072; 3. 福建農林大學海洋研究院, 福建省海洋生物技術重點實驗室, 福州 350002)

隨著魚粉資源日趨緊張, 魚粉價格不斷上漲。為了降低飼料生產成本, 水產飼料中多使用植物性蛋白, 如大豆、玉米蛋白粉等, 特別是在熱帶和亞熱帶地區(qū), 這些飼料原料和飼料成品在加工、運輸、保存過程中管理不當容易造成黃曲霉毒素(AFT)的污染[1]。AFT是霉菌次生代謝過程中產生的一類具有相似結構的有毒產物, 擁有1個糖酸呋喃和1個氧雜萘鄰酮(香豆素)結構[2]。黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)是主要產生AFT的真菌, 在潮濕或陰雨天氣的情況下, 極易導致上述2種真菌大量繁殖并產生AFT。曲霉菌通過空氣、土壤或昆蟲等途徑傳播到農作物和飼料儲藏處, 在適宜的環(huán)境中繁殖并產生多種AFT, 最常見的有黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)和黃曲霉毒素G2(AFG2), 其中黃曲霉毒素B1(AFB1)具免疫毒性、肝毒性和基因毒性, 可引起多種疾病的發(fā)生[3]。

國內外有關AFB1對水產動物影響的研究, 主要集中于尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)[4-7]、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[8,9]、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)[10,11]、斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)[12]、南亞野鯪(Labeo rohita)[13]等種類。尼羅羅非魚攝入含AFB1的飼料10周后, 生長減緩,死亡率升高[14]。用含不同濃度的AFB1飼料飼喂異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)成魚24周, 各毒素處理組魚體生長和飼料利用較對照組無顯著差異,但對其生殖功能有一定影響[15]。不同水產動物對AFB1的敏感性差別很大, 此外AFB1毒性的大小還受到毒素濃度、暴露時間、年齡、性別等因素的影響[1,4,5,8,9]。AFB1污染不僅會造成水產動物生長性能降低, 免疫抑制, 肝臟能損傷, 而且會積累在水產動物的體組織中, 隨食物鏈在生態(tài)系統(tǒng)中進一步傳播, 有可能威脅到人類的健康。

草魚(Ctenopharyngodon idellus)為我國傳統(tǒng)的四大家魚之一, 隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae), 雅羅魚亞科(Leuciscinae)、草魚屬(Ctenopharyngodon), 為我國養(yǎng)殖產量最大的淡水養(yǎng)殖魚類, 其配合飼料生產上多選用植物原料作其蛋白源。同時在我國南方漁民多習慣在塘頭儲存飼料, 而在高溫、高濕的環(huán)境下, 原料及飼料感染黃曲霉的可能性極大, 這進一步提高了草魚發(fā)生AFT中毒的概率。以往有關AFB1對水產動物的報道多集中于對水生動物急性毒性的研究, 研究方法多采用腹腔注射、灌喂等方式, 關于攝食途徑導致亞慢性致毒的研究相對較少[4,13]。但在實際生產中水產動物暴露于AFB1的方式主要是通過攝食被毒素污染的谷物和飼料, 因此, 相對于急性暴露, 研究動物長期攝入含AFB1的飼料, 更接近天然狀態(tài)的AFB1攝入途徑。迄今為止, 有關AFT在水產養(yǎng)殖動物中的代謝機理和毒理學研究尚不完整, 也僅涉及少數(shù)品種[5,8,12]。關于草魚AFB1的亞慢性中毒的研究鮮見報道。AFB1的毒性大小與受試動物的生長階段相關, 有報道表明魚苗階段比成魚更易發(fā)生AFT中毒[16]。本論文采用草魚幼魚為實驗對象, 研究不同濃度AFB1對草魚幼魚的生長、飼料利用、肝胰臟和腎臟組織學以及肌肉毒素殘留的影響, 評估飼料中的AFB1對草魚養(yǎng)殖和食品安全的潛在隱患。

1 材料與方法

1.1 養(yǎng)殖系統(tǒng)

微流水養(yǎng)殖系統(tǒng)由18個圓形塑料(pp)養(yǎng)殖桶(直徑80 cm, 高70 cm, 水體體積為180 L/缸)組成, 每缸水流速度0.6 L/min。每天測2次氣溫和水溫, 每2周檢測水體溶氧和氨氮。實驗期間, 水溫為22—28℃; 飼養(yǎng)用水為經曝氣的自來水, 保持水體中的溶解氧含量在6 mg/L以上, 氨氮范圍為0.2—0.4 mg/L, pH為6.8—7.0。光照周期12L∶12D, 光照周期為8:30到20:30。

1.2 實驗飼料及實驗設計

設置了不同濃度梯度AFB1(0、10、20、100、1000和5000 μg/kg)的6種等氮等能(32.96%蛋白質,14.55 kJ/g能量)飼料(表 1)。其中, 蛋白源為白魚粉和酪蛋白。

在各實驗組中, 通過酶聯(lián)免疫法測得飼料中AFB1含量分別為0.8、11.6、20.3、94.9、955.7和4979.2 μg/kg, AFB1濃度的設計參考關于AFB1在水產動物的研究報道[4,5,15]。AFB1純品購于美國Sigma公司, 將其溶于大豆油制成1000 μg/mL的母液, 按照設計濃度添加相應量到各組飼料中。飼料制成直徑3 mm顆粒, 于60℃恒溫干燥箱中烘干后置于-20℃冰箱備用。

1.3 實驗魚與飼養(yǎng)實驗

實驗草魚幼魚來自福州市閩侯縣南嶼湯湖生態(tài)養(yǎng)殖場。實驗魚在室內循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)2周后轉入實驗系統(tǒng)馴養(yǎng)2周, 暫養(yǎng)和馴化階段均投喂對照組飼料(表 1)。在實驗開始時, 實驗魚饑餓24h, 選擇健康、規(guī)格較為一致的草魚幼魚(平均體重2.90 g)360尾, 隨機放入18個魚缸中, 分為6個實驗組, 每組3個平行, 每缸20尾, 進行為期84d的飼養(yǎng)實驗。暫養(yǎng)期間和實驗期間均于每日9:30與16:00分別連續(xù)投喂飼料, 達到表觀飽食為止。在實驗結束時, 將實驗魚饑餓24h, 稱量和記錄每缸魚的終末體重。

表 1 實驗基礎飼料配方及化學組成(%干物質)Tab. 1 Diet formulation and chemical composition of experiment diets (% in dry matter)

1.4 實驗取樣

在實驗結束時, 每缸隨機取3尾草魚幼魚解剖取出肝胰臟和腎臟, 用中性甲醛固定, 采用HE染色做組織切片, 用作組織學觀察; 每缸隨機取7尾草魚幼魚在冰盤上解剖取背部白肌, 冷凍干燥后保存于-20℃用于肌肉AFB1含量測定。

1.5 樣品的測定

實驗飼料的干物質、粗蛋白、粗脂肪、灰分的測定參照文獻[17]的方法測定: 干物質在105℃烘干至恒重, 通過失重法測定; 粗蛋白采用FOSS定氮儀(2300 Kjeltec Analyzer Unit)測定; 粗脂肪采用索氏抽提儀(Soxtec system HT6, Tecator, Hoganas,Sweden)進行測定; 灰分在馬福爐中550℃燃燒3h,失重法測定。

血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的測定均采用南京建成生物工程研究所的測試盒。魚體肌肉毒素殘留采用ELISA法[4,15], 使用北京百靈康源生物公司的測試盒進行測定, 使用酶標儀(THERMO FISHER Multiskan FC)讀數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用下列公式計算特定生長率、攝食率、飼料效率、肝體比和臟體比:

存活率Survival rate (%)=100%×(剩余尾數(shù)/初始尾數(shù))

特定生長率(SGR, %/d)=100%×(LnW2-LnW1)/t

攝食率(FR, %BW/d)=100%×I/[(W1+W2)/2]/t

飼料利用率(FE, %)=100%×(W2-W1)/I

肝體比(HSI)=l00×肝臟重量(g)/魚體體重(g)

臟體比(VSI)=l00×內臟重量(g)/魚體體重(g)

式中,W1為平均初始體重(g),W2為平均終末體重(g),t為實驗時長(d),I為攝食量(g)。實驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS Statistics 17.0進行統(tǒng)計分析。實驗結果經過一元方差分析(One-way ANOVA)后, 用Duncan’s進行多重比較, 當P＜0.05時為差異顯著。

2 結果

2.1 飼料中AFB1水平對草魚幼魚生長的影響

在整個實驗過程中, 各組草魚幼魚行為均未表現(xiàn)出異常。各毒素組草魚幼魚外部形態(tài)和顏色較對照無顯著差別。如表 2所示, 各毒素組草魚幼魚的存活率均在80%以上, 與對照組無顯著差異(P＞0.05)。在實驗結束時, 各組草魚幼魚終末體重無顯著差異(P＞0.05)。飼料AFB1水平對草魚幼魚攝食率(FR)、特定生長率(SGR)、飼料效率(FE)無顯著影響(P＞0.05)。

2.2 飼料AFB1水平對草魚幼魚生理指標的影響

如表 3所示, 飼料AFB1水平對草魚幼魚血清谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性均無顯著影響(P＞0.05)。

2.3 飼料中AFB1水平對草魚幼魚內臟指數(shù)和組織學的影響

經過為期84d含不同濃度AFB1的飼料飼養(yǎng)后,解剖發(fā)現(xiàn), 草魚幼魚皮膚和各組織完整, 未觀察到鰭、眼和內臟器官等外部形態(tài)的改變。各毒素組幼魚的肝體比和臟體比與對照組相比無顯著差異(P＞0.05, 表 4)。

肝臟組織切片觀察結果如圖 1所示, 攝入不同濃度AFB1的草魚幼魚肝細胞均未出現(xiàn)異常, 細胞膜完整, 細胞質均勻、清晰, 細胞核形狀較為規(guī)則,細胞緊密連接。未見各類炎癥細胞, 沒有嗜酸性粒細胞聚集現(xiàn)象。圖 2為腎臟組織切片觀察結果, 經不同AFB1濃度處理的草魚幼魚腎臟組織未出現(xiàn)異常, 組織細胞邊界清晰, 腎小管與周圍組織相連, 未出現(xiàn)萎縮、變形等病理變化, 各毒素組草魚幼魚腎臟組織結構與對照組無顯著差異。

表 2 飼料AFB1水平對草魚幼魚初始體重(IBW)、終末體重(FBW)、存活率、攝食率(FR)、特定生長率(SGR)和飼料效率(FE)的影響(平均值±標準誤)Tab. 2 Effects of dietary AFB1 on initial body weight (IBW), final body weight (FBW), survival rate, feeding rate (FR), specific growth rate (SGR), feed efficiency (FE) of juvenile grass carp (Mean±SE)

表 3 飼料AFB1水平對草魚幼魚血清谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的影響(平均值±標準誤)Tab. 3 Effects of dietary AFB1 on serum activities of glutamic-pyruvic transaminase (ALT), glutamic-oxalacetic transaminase (AST),alkaline phosphatase (ALP), superoxide dismutase (SOD), and glutathione peroxidase (GSH-Px) of juvenile grass carp (Mean± SE)

表 4 飼料中AFB1水平對草魚幼魚肝體比(HSI)、臟體比(VSI)的影響(平均值±標準誤)Tab. 4 Effects of dietary AFB1 on hepatosomatic index (HSI) and viscera index (VSI) of juvenile grass carp (Mean ± SE)

2.4 飼料AFB1水平對草魚幼魚肌肉的AFB1積累水平的影響

在實驗結束時, 草魚幼魚肌肉中AFB1的殘留量如表 5所示。攝食AFB1≤1000 μg/kg的草魚幼魚肌肉中未檢測出AFB1殘留, 僅在5000 μg/kg實驗組中檢測出肌肉中含有(1.21±0.18) μg/kg的AFB1。

3 討論

3.1 飼料中AFB1水平對草魚幼魚存活率和生長的影響

AFB1會引起水產動物行為異常、體表黃化、食欲降低, 長期食用或暴露在AFB1污染中還會表現(xiàn)出致癌、致畸、致突變等基因毒性, 造成動物死亡[4,18-20]。凡納濱對蝦攝入AFB1含量為 1500 μg/kg的飼料后成活率顯著下降[21]。羅非魚攝食AFB1含量為10 mg/kg的飼料對死亡率無顯著影響[5]。異育銀鯽攝食1000 μg/kg AFB1后存活率與對照組無顯著差異[1]。在本實驗中, 草魚幼魚攝入AFB1達5000 μg/kg的飼料對存活率無顯著影響, 形態(tài)正常、魚體健康, 表明草魚幼魚對AFB1的耐受性較強。

尼羅羅非魚[14]、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodonFabricius)[22]攝食AFB1后表現(xiàn)為增重率降低; 溝鯰[19]和雜交鱘(Acipenser ruthenus♀×A. baerii♂)[23]攝食AFB1后攝食率下降。羅非魚攝食AFB1達245 μg/kg時飼料效率顯著降低, 飼料效率降低與飼料中AFB1含量存在劑量效應[4]。在本實驗中, 各毒素組草魚幼魚攝食率、特定生長率、飼料效率均未顯著受到顯著影響, 表明不同的魚類在AFB1的耐受性上差別很大。

3.2 飼料中AFB1水平對草魚幼魚肝功能指標和抗氧化能力的影響

肝臟被認為是AFB1的主要作用器官。AFB1在肝臟中首先經細胞色素P450氧化酶代謝轉化為黃曲霉毒醇(AFL)等, 而黃曲霉毒醇又轉化為AFB1-8,9-環(huán)氧化合物(AFBO), 隨后與鳥嘌呤結合, 形成一系列的加成物導致可遺傳的惡性腫瘤基因[24]。生物體血清中的AST和ALT是醫(yī)學臨床上肝功能檢查的最為主要的2種指標, 當肝臟受損, 細胞膜的通透性增大, 存在于肝細胞漿ALT和AST進入血液內, 血清中的ALT和AST的活性升高[1,4,11]。凡納濱對蝦攝入AFB1后ALT和AST活力顯著高于對照組[25]。堿性磷酸酶是肝臟中重要的解毒酶, 也是肝臟受損的評價標準之一。斑節(jié)對蝦攝食AFB1后ALP活性顯著升高[22]。在本實驗中, 草魚幼魚攝入不同濃度AFB1后血清ALT, AST和ALP均無顯著變化, 說明攝食AFB1含量≤5000 μg/kg飼料未對草魚幼魚肝功能造成損傷。

AFB1經過生物活化步驟轉化成的AFBO具有親電性, 極易攻擊酶蛋白分子上親核的氮、氧和硫等雜原子, 不但使酶蛋白失活, 而且使體內產生的大量自由基和活性氧無法及時清除[26]。肝細胞自由基清除系統(tǒng)受損, 機體的抗氧化能力大大降低,從而引起組織細胞的脂質過氧化, 使細胞內活性氧防衛(wèi)系統(tǒng)SOD、GSH-Px等活力下降[11]。在本實驗中, 攝食AFB1未對草魚幼魚的SOD和GSH-Px造成顯著影響。

3.3 飼料中AFB1水平對草魚幼魚內臟指數(shù)和組織學的影響

AFT可引起動物肝臟纖維化、肝小葉中心壞死, 膽囊腫大、膽管上皮組織增生等。攝入AFB1會造成魚體肝臟腫大, 肝體比顯著升高[20]。在本實驗中, 草魚攝食AFB1達5000 μg/kg飼料對肝體比、臟體比無顯著影響, 未造成膽囊腫大, 此結果與Huang等[15]對異育銀鯽的報道相似。

虹鱒連續(xù)12個月攝入80 μg/kg的AFB1后, 肝臟表現(xiàn)為出現(xiàn)大量空泡并伴有炎癥反應[27]。在肝臟受損的情況下, 虹鱒的原纖維細胞會轉化為成肌纖維細胞, 以應對肝臟的損傷。羅非魚攝入超過245 μg/kg超過20W后會引起肝臟疾病, 表現(xiàn)為肝形態(tài)異常,肝臟空泡化嚴重, 伴有大量的嗜酸性粒細胞和炎癥細胞[4]。凡納濱對蝦攝入AFB1后肝胰腺出現(xiàn)空泡的數(shù)量要遠多于對照組, 隨著AFB1濃度的升高, 肝細胞壞死程度越深, 空泡數(shù)量越多[11]。虹鱒攝食0.5 μg AFB1/kg飼料6個月后發(fā)現(xiàn)肝癌[8]。在本實驗中, 草魚幼魚的肝胰臟組織未呈現(xiàn)纖維化病變, 肝臟細胞排列正常、緊密, 未見各類炎癥細胞, 表明食用5000 μg/kg以下的AFB1不會對草魚幼魚肝胰臟造成病理損傷, 該結果與Han等[28]異育銀鯽攝入AFB1后肝胰臟組織結構的影響的報道相似。這些不同的研究結果表明, AFB1誘導肝癌的易感性方面, 生物種間存在著極大的差異。

圖 1 飼料中AFB1對草魚幼魚肝臟組織學的影響(HE, 標尺為50 μm)Fig. 1 Hepatopancreas of juvenile grass carp fed with diets containing AFB1 (HE, Bar = 50 μm)

鯉(Cyprinus carpio)攝食不同濃度(0.5、0.7、1.4 mg/kg) AFB121d, 鯉腎臟上皮組織變性脫落、壞死, 腎小管和腎小囊腔擴張[29]。AFB1急性或者亞急性攻毒均會引起南亞野鯪腎臟腎曲小管上皮細胞變性、壞死, 腎小球萎縮[30]。低濃度(0.05 μg/kg) AFB1飼料飼養(yǎng)白鼠8周, 解剖觀察其腎臟組織學變化, 染毒組的小鼠腎臟部分區(qū)域的近曲小管出現(xiàn)壞死和脫落現(xiàn)象; 電鏡結果表明, 細胞質呈現(xiàn)空泡狀態(tài), 缺乏線粒體, 微絨毛間隔稀疏, 遠曲小管出現(xiàn)細胞極性的消失和基底外側內折[31]。在本實驗中, 草魚攝入5000 μg/kg以下的AFB1不會對腎臟組織造成損傷, 表明草魚可能對AFB1有較強的代謝能力。一些魚類對AFB1耐受力較強可能是由于AFB1在其體內較快地轉化成AFL而非AFBO, 并且迅速被解毒酶作用而生成水溶性物質, 最后通過其膽汁、尿液等排出體外[12]。

3.4 飼料AFB1水平對草魚幼魚肌肉的AFB1積累水平的影響

圖 2 飼料中AFB1對草魚幼魚腎臟組織學的影響(HE, 標尺為50 μm)Fig. 2 Kidney of juvenile grass carp fed with diets containing AFB1 (H&E, Bar = 50 μm)

表 5 飼料中AFB1水平對草魚幼魚肌肉AFB1積累(μg/kg濕重)的影響(平均值±標準誤)Tab. 5 Effects of dietary AFB1 on AFB1 accumulation (μg/kg wet weight) in muscle of juvenile grass carp (Mean± SE)

(Dicentrarchus labraxL.)飼喂含18 μg/kg AFB1飼料42d后, 其肌肉中的AFB1達到4.25 μg/kg[34]。斑節(jié)對蝦攝入AFB1第4周肌肉和頭胸甲中有殘留, 且肌肉中含量多余頭胸甲, 而第6周開始AFB1的殘留量開始下降, 肌肉中AFB1含量極低, 而頭胸甲中的殘留量也顯著減小[22]。在本研究中, 攝入AFB1濃度在1000 μg/kg以下的草魚肌肉中未檢測出AFB1殘留,而5000 μg/kg組的殘留量僅為1.21 μg/kg, 低于FDA食品安全標準, 此結果與王靜等[11]對凡納濱對蝦的報道相似, 攝入AFB1含量在2000 μg/kg以下的蝦體肌肉中未檢測出AFB1。

4 結論

草魚幼魚攝入AFB1含量達4979.2 μg/kg飼料84d后, 其生長、肝功能指標、內臟指數(shù)、肝胰臟和腎臟組織結構均未受到顯著影響。肌肉的AFB1殘留量低于FDA食品安全限定標準。