劉曉珍，聶少平，余 強，黃丹菲，謝明勇,*

（1.東莞理工學(xué)院化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院，科技創(chuàng)新研究院，廣東 東莞 523808 ；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047 ）

壬基酚（nonylphenol，NP）是環(huán)境中普遍存在的化學(xué)污染物，被廣泛應(yīng)用于非離子表面活性劑、防腐劑和著色劑，如日常生活用品中的清潔劑、農(nóng)藥制劑、水性涂料、化妝品等。據(jù)報道，NP是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有持久性、生物蓄積性、損傷滯后性及低劑量-效應(yīng)關(guān)系，具有雌激素樣作用，可以干擾內(nèi)分泌激素系統(tǒng)的正常功能，從而導(dǎo)致潛在的生殖問題[1]。通過對果蔬、肉制品、水產(chǎn)品、飲料等的檢測，發(fā)現(xiàn)NP普遍存在于各類食品中[2]。NP通過食物鏈、食品加工、食品包裝遷移等途徑進入食品從而對機體造成潛在危害[3]。

目前對雄性生殖毒物的研究主要集中在睪丸。Sertoli細胞是存在于睪丸生精上皮中的一種體細胞，其在雄性生殖活動中扮演重要的角色。研究表明，Sertoli細胞具有為生精細胞提供營養(yǎng)、激素轉(zhuǎn)化、屏障保護以及吞噬等作用，有關(guān)Sertoli細胞的形態(tài)和功能的改變以及分子生物學(xué)研究已成為雄性生殖研究最活躍的領(lǐng)域[4-5]。另外，有研究表明，睪丸Sertoli細胞是烷基酚類內(nèi)分泌干擾物作用于雄性生殖系統(tǒng)的靶細胞[6]。

誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和細胞凋亡是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物引起多種細胞損傷的主要方式之一，同樣，NP能夠誘導(dǎo)細胞凋亡從而損害生物體[7-8]。N-乙酰-半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是氧自由基清除劑，具有干擾自由基生成、清除已生成的自由基、預(yù)防DNA損傷、調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、抗細胞凋亡等作用。研究報道，抗氧化劑NAC能夠降低毒性化合物引起的細胞損傷[9]。NP作為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，可對生殖系統(tǒng)產(chǎn)生危害，尤其是雄性生殖系統(tǒng)，但是其具體的作用機制還不清楚。另外，目前尚缺乏針對NP誘導(dǎo)機體損傷的干預(yù)治療相關(guān)藥物。因此，本研究通過檢測細胞氧化應(yīng)激和凋亡相關(guān)參數(shù)，用培養(yǎng)的Sertoli TM4細胞探索NP誘導(dǎo)生殖損傷的機制，探尋目前發(fā)育不全、男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常等疾病發(fā)病率明顯增加的可能原因。另一方面，以NAC作為干預(yù)藥物，探討其對NP誘導(dǎo)的細胞損傷效應(yīng)的干預(yù)作用，從而為NP生物危害的防治策略提供一定的參考。以期發(fā)現(xiàn)并評估NP對機體損傷效應(yīng)的重要指標，為NP的風(fēng)險評估、建立環(huán)境和食品中的控制標準提供依據(jù)，同時為NP誘導(dǎo)機體損傷的預(yù)防和治療提供新的作用靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠Sertoli TM4細胞 美國典型菌種保藏中心；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清 美國Hyclone公司；NP（純度99.9%）、噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美國Sigma公司；質(zhì)量分數(shù)0.25%胰酶北京索萊寶公司；2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorodi-hydrof l uorescein diacetate，DCFH-DA）美國Molecular Probes公司；細胞凋亡檢測試劑盒、Caspase-3檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；BCA蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p-ERK、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p-JNK蛋白一抗 美國Cell Signaling公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FACSCaliburTM流式細胞儀 美國Becton Dickinson公司；電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Varioskan Flash E33全波長多功能酶標儀、3110 Series II細胞培養(yǎng)箱 美國Thermo Fisher Scientific公司；倒置相差顯微鏡 日本Olympus公司；超凈工作臺 上海一恒科技有限公司；高速冷凍離心機 美國Sigma公司；超低溫冰箱 青島海爾電冰箱股份有限公司；Milli-Q50超純水凈化系統(tǒng) 美國Millipore公司；立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；垂直電泳-轉(zhuǎn)膜裝置、ChemDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與處理

Sertoli TM4細胞加入含質(zhì)量分數(shù)2.5%經(jīng)活性炭/葡聚糖處理胎牛血清和5%經(jīng)活性炭過濾馬血清的無酚紅DMEM/F12培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選用對數(shù)生長期生長良好的細胞進行后續(xù)實驗。

將培養(yǎng)的Sertoli TM4細胞分為4 組，每個處理組設(shè)置3 個復(fù)孔。對照組：細胞用培養(yǎng)基處理；NP組：細胞用20 μmol/L NP處理24 h；NP+NAC組：細胞用5 mmol/L NAC預(yù)處理4 h后加入20 μmol/L NP處理24 h；NAC組：細胞用5 mmol/L NAC預(yù)處理4 h后換與對照組相同體積的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.2 MTT法檢測細胞存活率

將Sertoli TM4細胞以1×104個/孔接種至96 孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h或24 h。加入NP處理24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇570 nm波長，在多功能酶標儀上測定各孔OD值，根據(jù)OD樣品/OD對照×100計算細胞相對存活率。

1.3.3 細胞內(nèi)活性氧生成水平檢測

將Sertoli TM4細胞懸液（約2×105個/mL）于3 000 r/min離心10 min，收集細胞，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗2 次，用0.5 mL 10 μmol/L DCFH-DA溶液重懸細胞，37 ℃孵育20 min；3 000 r/min離心3 min，棄上清液，PBS洗2 次，采用激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm于流式細胞儀檢測細胞內(nèi)DCF的熒光強度，每次計數(shù)1×104個細胞，用WinMDI 2.9軟件分析活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成水平。

1.3.4 分光光度法檢測細胞內(nèi)SOD活力、CAT活力、MDA含量以及Caspase-3相對活力

收集Sertoli TM4細胞，PBS洗2 次，利用液氮在37 ℃下進行5 次反復(fù)凍融，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，吸取上清液，用BCA蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。按照試劑盒說明書測定細胞內(nèi)SOD活力、CAT活力、MDA含量以及Caspase-3相對活力。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

胰酶消化收集Sertoli TM4細胞（5×105個/mL），將細胞懸液于3 000 r/min離心10 min，預(yù)冷PBS洗2 次后用500 μL Binding Buffer重懸細胞，加入Annexin V-FITC和PI探針各5 μL，避光反應(yīng)5 min后立即用流式細胞術(shù)檢測各組細胞染色情況。同時以不加Annexin V-FITC及PI探針的細胞樣本作為裸細胞，用于設(shè)定流式細胞術(shù)檢測條件。

1.3.6 Western blot法檢測ERK1/2、JNK1/2蛋白的磷酸化水平

將Sertoli TM4細胞以2×105個/孔接種至6 孔培養(yǎng)板中。細胞培養(yǎng)24 h后用預(yù)冷PBS洗2 遍，加入細胞裂解液，采用蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白。用BCA蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，等量蛋白上樣，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（質(zhì)量分數(shù)5%濃縮膠、50 V、30 min；質(zhì)量分數(shù)10%分離膠、100 V、55 min），濕法轉(zhuǎn)印NC膜。轉(zhuǎn)印完畢后，NC膜采用牛血清白蛋白封閉2 h，TBST洗3 遍后繼續(xù)用JNK1/2、p-JNK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2一抗按體積比1∶1 000稀釋孵育過夜，TBST洗3 遍，再用辣根過氧化物酶標記二抗按體積比1∶5 000稀釋孵育2 h。采用顯影液化學(xué)發(fā)光顯色反應(yīng)，采用全能型凝膠成像分析系統(tǒng)成像、Quantity One軟件分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 NAC和NP對Sertoli TM4細胞存活率的影響

圖1 NAC干預(yù)NP對Sertoli TM4細胞的毒性作用Fig. 1 NAC attenuated NP-induced cytotoxicity in mouse Sertoli TM4 cells

如圖1所示，20 μmol/L NP處理6 h對Sertoli TM4細胞無損傷作用。而與對照組相比，NP作用24 h能夠顯著降低Sertoli TM4細胞的相對存活率（P＜0.05）。經(jīng)NAC預(yù)處理后再用NP作用于細胞，細胞相對存活率與對照組相比無顯著性差異；同樣地，與對照組相比，NAC組細胞相對存活率無顯著變化，表明NAC預(yù)處理4 h對細胞無損害作用，并且能夠減少NP引起的細胞損傷。

2.2 NAC和NP對Sertoli TM4細胞內(nèi)ROS含量的影響

圖2 NAC對NP誘導(dǎo)的Sertoli TM4細胞內(nèi)ROS生成的干預(yù)Fig. 2 NAC attenuated NP-induced ROS generation in mouse Sertoli TM4 cells

如圖2所示，與對照組相比，20 μmol/L NP處理細胞24 h能夠引起Sertoli TM4細胞內(nèi)ROS含量極顯著上升。與NP組相比，NAC預(yù)處理能夠顯著下調(diào)NP誘導(dǎo)的ROS生成量。

2.3 NAC和NP對Sertoli TM4細胞內(nèi)抗氧化物酶活力和MDA含量的影響

表1 NAC和NP對Sertoli TM4細胞內(nèi)抗氧化物酶活力和MDA含量的影響Table 1 Effect of NAC on NP-induced antioxidant enzyme activities and MDA content in Sertoli TM4 cells

從表1可見，與對照組相比，NP組細胞內(nèi)的MDA含量極顯著升高。NAC預(yù)處理后，細胞內(nèi)MDA含量極顯著減少，表明NAC預(yù)處理可減輕NP引起的Sertoli TM4細胞脂質(zhì)過氧化。與對照組相比，NP組細胞內(nèi)SOD、CAT活力極顯著下降。與NP組相比，NP+NAC組細胞內(nèi)SOD、CAT活力極顯著增加，表明NAC預(yù)處理可逆轉(zhuǎn)NP引起的細胞內(nèi)SOD、CAT活力下降。這些結(jié)果表明NAC具有保護NP對Sertoli TM4細胞的損傷作用，該保護作用與減少細胞內(nèi)氧化應(yīng)激的形成有關(guān)。

2.4 NAC和NP對Sertoli TM4細胞凋亡的影響

圖3 NAC對NP誘導(dǎo)的Sertoli TM4細胞凋亡的干預(yù)Fig. 3 NAC attenuated NP-induced apoptosis in mouse Sertoli TM4 cells

如圖3所示，與對照組相比，Sertoli TM4細胞經(jīng)20 μmol/L NP處理24 h后，凋亡細胞明顯增加。用5 mmol/L NAC預(yù)處理Sertoli TM4細胞后，NP誘導(dǎo)的細胞凋亡率顯著下降（P＜0.05），這表明NAC對NP誘導(dǎo)的細胞凋亡損傷具有保護作用。

圖4 NAC抑制NP對Caspase-3的激活作用Fig. 4 NAC blocked NP-induced activation of caspase-3 in mouse Sertoli TM4 cells

圖4 顯示NP組、NP+NAC組、NAC組Caspase-3相對活力分別為對照組的（1.48±0.15）、（1.08±0.11）、（0.92±0.09）倍。NP處理激活了細胞內(nèi)Caspase-3，表明NP可通過激活Caspase-3誘導(dǎo)細胞凋亡。而NAC預(yù)處理能夠抑制NP誘導(dǎo)的Caspase-3活力的增加，進一步說明NAC能夠抑制NP對Sertoli TM4細胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

2.5 NAC和NP對Sertoli TM4細胞內(nèi)JNK、ERK信號通路的影響

圖5 NAC和NP對Sertoli TM4細胞ERK信號通路的影響Fig. 5 NAC blocked NP-induced activation of the ERK signaling pathway in mouse Sertoli TM4 cells

圖6 NAC和NP對Sertoli TM4細胞JNK信號通路的影響Fig. 6 NAC blocked NP- induced activation of the JNK signaling pathway in mouse Sertoli TM4 cells

如圖5、6所示，與對照組相比，NP能夠顯著增加ERK和JNK的磷酸化水平，表明NP激活了Sertoli TM4細胞內(nèi)ERK和JNK細胞信號通路。進一步研究發(fā)現(xiàn)，NAC預(yù)處理能夠降低NP誘導(dǎo)的ERK和JNK的磷酸化水平升高。結(jié)果表明，NP處理能夠激活Sertoli TM4細胞內(nèi)JNK和ERK通路，并且ROS參與了該過程，ROS清除劑NAC能夠阻斷這一過程。

3 討 論

作為一種典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，NP引起了學(xué)術(shù)界和公眾的廣泛關(guān)注。大量的證據(jù)表明，有害化學(xué)物質(zhì)在環(huán)境中暴露可誘導(dǎo)機體損傷。Duan Peng等[10]發(fā)現(xiàn)NP暴露可引發(fā)雄性SD大鼠睪丸生精功能退化、精子數(shù)量和質(zhì)量降低。本研究中NP作用24 h后引起Sertoli TM4細胞存活率顯著降低，表明NP處理可造成細胞損傷。NAC預(yù)處理抑制了NP誘導(dǎo)的細胞凋亡，表明NAC對NP誘導(dǎo)的細胞損傷具有保護作用。

ROS的大量生成和脂質(zhì)過氧化的增加是氧化應(yīng)激的兩個重要指標。ROS和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡與細胞死亡密切相關(guān)，ROS的過量生成會誘導(dǎo)線粒體內(nèi)膜雙磷脂酰甘油的過氧化，從而觸發(fā)細胞色素c的游離。SOD、CAT是細胞內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化物酶，可間接反映細胞內(nèi)的抗氧化水平[11]。MDA為細胞中多不飽和脂肪酸氧化生成的脂質(zhì)過氧化物，其含量常用以評價脂質(zhì)過氧化水平[12]。前人的研究發(fā)現(xiàn)，NP能夠在多種細胞中誘導(dǎo)ROS的生成，包括Raji淋巴瘤細胞[13]、U937單核細胞白血病細胞[14]、人血中性粒細胞[15]、大鼠原代Sertoli細胞[16]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)NP處理后，Sertoli TM4細胞內(nèi)ROS生成量和MDA含量顯著增加，抗氧化物酶活力降低，這些結(jié)果均說明NP暴露能夠引發(fā)Sertoli TM4細胞內(nèi)氧化應(yīng)激。

氧化應(yīng)激被認為是引發(fā)細胞凋亡的一個主要機制[17-18]，因此，本研究進一步探究了NP是否能夠通過與ROS生成相關(guān)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NP處理細胞24 h后顯著誘導(dǎo)細胞凋亡，證實NP是通過ROS過量生成引起的氧化應(yīng)激和細胞凋亡誘導(dǎo)Sertoli TM4細胞損傷，這與前期報道結(jié)果[19-20]一致?？寡趸瘎㎞AC能夠通過抑制ROS的生成以及維護體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡從而保護機體或細胞免受有害化學(xué)物質(zhì)的損傷。Ansari等[21-22]報道NAC或者肌肽預(yù)處理能夠減緩亞硝酸鹽對大鼠腸道/血液的損傷作用。本研究中，NAC預(yù)處理能夠有效抑制NP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，主要表現(xiàn)在NAC有效抑制了細胞內(nèi)ROS的生成、降低抗氧化物酶活力和增加MAD含量，與NAC對NP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的干預(yù)效果一致。NAC對NP誘導(dǎo)的Sertoli TM4細胞凋亡損傷具有保護作用，主要表現(xiàn)在NAC預(yù)處理后，經(jīng)過NP處理的Sertoli TM4細胞凋亡率和Caspase-3相對活力下降。本研究證明NAC對NP誘導(dǎo)的細胞凋亡損傷具有保護作用，并且NP主要是通過與ROS生成相關(guān)的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細胞凋亡。Huang Wenting等[23]發(fā)現(xiàn)NP處理能夠誘導(dǎo)SD大鼠睪丸以及Sertoli原代培養(yǎng)細胞發(fā)生氧化應(yīng)激和細胞凋亡，NAC預(yù)處理能夠緩解這一現(xiàn)象，這與本研究結(jié)論一致。

近年來，隨著對細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑研究的逐步深入，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尤其是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的作用引起了人們的廣泛關(guān)注。MAPK信號通路是生物體內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，參與介導(dǎo)細胞增殖、分化、凋亡和對環(huán)境刺激的反應(yīng)等。目前已知MAPK具有5 個單元，即JNK1、JNK2、p38、ERK1、ERK2亞家族。而JNK、p38和ERK的磷酸化動態(tài)平衡決定了細胞的存活或凋亡。研究報道，大量環(huán)境污染毒性物質(zhì)能夠通過激活MAPK通路誘導(dǎo)細胞凋亡[24-27]，在本研究中，Sertoli TM4細胞暴露于NP下，細胞內(nèi)ERK和JNK磷酸化水平顯著增加，表明ERK和JNK信號通路參與了NP對細胞的損傷作用。NAC預(yù)處理能夠抑制NP對ERK、JNK信號通路的激活作用，該結(jié)果進一步證明NAC能夠通過干預(yù)ERK和JNK信號通路抑制NP對Sertoli TM4細胞的損傷作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)NP對Sertoli TM4細胞具有一定的損傷作用，當Sertoli TM4細胞暴露在一定濃度NP環(huán)境下，細胞內(nèi)ROS生成增加、抗氧化物酶活力降低、MDA含量和細胞凋亡率增加，表明誘導(dǎo)細胞內(nèi)氧化應(yīng)激和細胞凋亡是NP造成細胞損傷的主要方式之一。同時，ERK和JNK信號通路參與了NP對細胞的損傷作用。NAC預(yù)處理能夠抑制NP對Sertoli TM4細胞的損傷作用，主要表現(xiàn)在NAC能夠緩解NP誘導(dǎo)的細胞內(nèi)氧化應(yīng)激，抑制NP誘導(dǎo)的Sertoli TM4細胞凋亡，以及阻斷NP激活ERK和JNK信號通路。