葛 青，章亭洲,2*，王騰浩，趙 艷

（1.浙江科峰生物科技有限公司，浙江 海寧 314400；2.浙江工商大學(xué)，杭州 310000）

纖維素酶可以分解纖維素，添加纖維素酶能夠改善粗飼料的柔韌性，并破壞飼料中粗纖維等抗?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)，從而提高動(dòng)物采食量，改善動(dòng)物消化道健康[1]。添加纖維素酶還可以補(bǔ)充動(dòng)物體內(nèi)內(nèi)源酶的不足，提高對粗纖維的利用率，同時(shí)還可以改善消化道酶系組成、酶量及活性，從而提高對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率[2]。因此，纖維素酶對于現(xiàn)代飼料產(chǎn)業(yè)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值，但是目前飼用纖維素酶制劑仍然存在功能單一、穩(wěn)定性差、不耐熱、酶活性低、產(chǎn)率低且成本高等缺陷[3-4]。這是影響纖維素酶制劑廣泛應(yīng)用于飼料中的瓶頸問題，篩選高產(chǎn)纖維素酶生產(chǎn)菌株具有重要意義[5-6]。

里氏木霉是一種好氧的絲狀真菌，其分泌的纖維素酶是胞外酶，經(jīng)初提和分離純化就可得到纖維素酶制劑[7-8]。里氏木霉產(chǎn)纖維素酶量高、穩(wěn)定性好、適應(yīng)性強(qiáng)，且可以通過物理和化學(xué)誘變獲取高產(chǎn)菌株，便于形成規(guī)?；a(chǎn)和管理[9]。研究采用里氏木霉的誘變方法，改造菌株同時(shí)優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基及發(fā)酵條件，并采用培養(yǎng)條件易于控制、生產(chǎn)效率高且不易染菌的液態(tài)發(fā)酵方法培養(yǎng)菌株，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。因此，本研究利用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變法處理里氏木霉菌株，選育纖維素酶高產(chǎn)突變株，優(yōu)化高產(chǎn)纖維素酶突變菌株發(fā)酵工藝，確定最適發(fā)酵條件，為高產(chǎn)纖維素酶菌株的開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

里氏木霉RUT-C30 購自廣東微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

微晶纖維素剛果紅培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉10 g，乳糖3 g，硫酸銨2 g，磷酸氫二鉀2.0 g，七水合硫酸鎂0.5 g，剛果紅0.2 g，瓊脂粉20 g，用蒸餾水定容至1 L。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖15 g，酵母浸膏20 g，硫酸鎂0.8 g，磷酸氫二鉀6 g，氯化鈣1.0 g，硫酸銨2.5 g，Mandels 微量元素營養(yǎng)鹽1 mL，吐溫-80 2 mL，pH 4.8，用蒸餾水定容至1 L。

發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：乳糖18 g，玉米槳粉12 g，微晶纖維素10 g，硫酸鎂1 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈣0.5 g，Mandels 微量元素營養(yǎng)鹽1 mL，吐溫-80 2 mL，pH 4.8，用蒸餾水定容至1 L。

1.2 誘變和篩選

1.2.1 孢子懸液制備

取活化培養(yǎng)的里氏木霉平板，用無菌水沖洗，接入種子培養(yǎng)基，30 ℃，150 r·min-1培養(yǎng)。在此過程中記錄孢子萌動(dòng)過程，以萌動(dòng)率20%～30%為最佳萌動(dòng)時(shí)間。

1.2.2 ARTP誘變

將里氏木霉孢子液用無菌水稀釋至107～108個(gè)·mL-1進(jìn)行常壓室溫等離子體（ARTP）誘變。照射距離為2 mm，誘變時(shí)間分別為0、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220、240、260 s。吸取不同誘變時(shí)間的菌液均勻涂布于種子培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)48 h，記錄菌落數(shù)，以無菌水處理的作為空白對照，計(jì)算致死率，公式見式1。

致死率/%=（處理菌落數(shù)-對照菌落數(shù)）/對照菌落數(shù)×100% （1）

1.2.3 最優(yōu)突變菌篩選

將誘變得到的里氏木霉涂布于微晶纖維素剛果紅培養(yǎng)基上，以原菌里氏木霉在微晶纖維素剛果紅培養(yǎng)基上產(chǎn)生的透明圈菌落大小為對照，挑選出平板上突變菌長得快、透明圈大、菌絲短、產(chǎn)孢子晚的單菌落。用0.9%的生理鹽水清洗，然后涂到傳代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4～6 d，接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵，測定其總酶活（FPU），比較其酶活性大小以確定高產(chǎn)纖維素酶分解菌株。

1.3 酶活力測定

以濾紙作為底物測定纖維素酶總酶活：將濾紙條置于裝有1 mL 檸檬酸緩沖液（50 mmol·L-1，pH 4.8）的試管中作為反應(yīng)底物，然后加入500 μL經(jīng)稀釋的發(fā)酵上清液，50 ℃恒溫振蕩反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后立即加入3,5-二硝基水楊酸溶液3 mL，沸水浴5 min，迅速冷卻至室溫，加入去離子水20 mL，混合均勻后測定540 nm處的吸光值[11]?？瞻讓φ諡闄幟仕峋彌_液（50 mmol·L-1，pH 4.8）500 μL。

酶活的表示用U·mL-1上清液來衡量。其中一個(gè)酶活單位（U）定義為指在1 min 內(nèi)釋放1 μmol 底物所需要的酶量。

1.4 突變菌產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化

1.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為基準(zhǔn)，30 ℃恒溫培養(yǎng)，依次對發(fā)酵時(shí)間（12、24、36、48、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、132、144 h）、硫酸銨濃度（0、0.5、1、1.5、2、2.5 g·L-1）、微晶纖維素濃度（6、8、10、12、14 g·L-1）、接種量（7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%）及攪拌速度（200、300、400、500、600 r·min-1）進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，保持其他條件恒定（乳糖10 g·L-1，微晶纖維素10 g·L-1，玉米漿粉12 g·L-1，（NH4）2SO41.5 g·L-1，MgSO41.2 g·L-1，CaCl21.4 g·L-1，Mandels 微量元素營養(yǎng)鹽1 mL·L-1，吐溫-80 2 mL·L-1，pH 4.8，攪拌轉(zhuǎn)速為400 r·min-1，通氣量2 vvm。每個(gè)重復(fù)3次。測定不同發(fā)酵條件下突變菌里氏木霉濾紙酶活性，確定這些因素對突變菌里氏木霉產(chǎn)酶的影響，并得到最佳產(chǎn)酶條件。

1.4.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇單因素實(shí)驗(yàn)中對產(chǎn)酶影響較大的4 個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)3 個(gè)水平，即采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，對里氏木霉突變菌的產(chǎn)濾紙酶的最優(yōu)固體發(fā)酵條件組合進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變株篩選

2.1.1 ARTP誘變與突變菌篩選

將里氏木霉孢子萌發(fā)后進(jìn)行ARTP 誘變，最佳照射時(shí)間為200～240 s（致死率達(dá)到98%）。經(jīng)多輪ARTP 誘變，挑選出各輪誘變菌透明圈直徑/菌落直徑較大的初篩突變菌。初篩突變菌經(jīng)搖瓶發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩，突變菌里氏木霉的產(chǎn)酶能力見表1。

表1 里氏木霉RUT-C30 突變菌產(chǎn)酶能力

由表1可知，通過突變菌菌落大小比較，獲得5 個(gè)突變菌，經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩發(fā)現(xiàn)，突變菌里氏木霉ATR-4的濾紙酶活性較原菌里氏木霉有所提高。鑒于里氏木霉ATR-4 濾紙酶活（FPU）最高，可達(dá)2.01 U·mL-1，因此選擇KFDY-4菌株作為產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的突變菌。

2.2 突變菌里氏木霉ATR-4產(chǎn)酶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對里氏木霉ATR-4產(chǎn)酶能力的影響

發(fā)酵時(shí)間對里氏木霉ATR-4 產(chǎn)酶能力的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對里氏木霉ATR-4產(chǎn)酶能力的影響

由圖1可知，發(fā)酵時(shí)間對里氏木霉ATR-4產(chǎn)酶能力的影響較大。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，濾紙酶活性呈現(xiàn)先升高再降低再升高的變化趨勢，發(fā)酵時(shí)間84 h 時(shí)濾紙酶活達(dá)到最高，隨后濾紙酶活性隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而呈下降趨勢。由于發(fā)酵時(shí)間越短，對降低生產(chǎn)成本較為有利，因此選擇里氏木霉ATR-4最佳發(fā)酵時(shí)間定為84 h。

2.2.2 硫酸銨濃度對里氏木霉ATR-4 產(chǎn)酶能力的影響

硫酸銨濃度對里氏木霉ATR-4 產(chǎn)酶能力的影響見圖2。

圖2 硫酸銨濃度對里氏木霉ATR-4產(chǎn)酶能力的影響

由圖2 可知，濾紙酶活性在硫酸銨濃度為1.5 g·L-1時(shí)最高，顯著高于硫酸銨濃度為0、0.5、2.5 g·L-1時(shí)（P＜0.05）。因此，選擇里氏木霉ATR-4 最佳的硫酸銨濃度定為1.5 g·L-1。

2.2.3 微晶纖維素濃度對里氏木霉ATR-4 產(chǎn)酶能力的影響

微晶纖維素濃度對里氏木霉ATR-4 產(chǎn)酶能力的影響見圖3。

圖3 微晶纖維素濃度對里氏木霉ATR-4產(chǎn)酶能力的影響

由圖3 可知，微晶纖維素對濾紙酶活性無顯著影響，微晶纖維素濃度在10 g·L-1時(shí)，濾紙酶活性相對較高。綜合考慮成本，里氏木霉ATR-4 產(chǎn)酶的最佳微晶纖維素濃度定為10 g·L-1。

2.2.4 接種量對里氏木霉ATR-4產(chǎn)酶能力的影響

接種量對里氏木霉ATR-4 產(chǎn)酶能力的影響見圖4。

圖4 接種量對里氏木霉ATR-4產(chǎn)酶能力的影響

由圖4 可知，接種量在7%～10%時(shí)，濾紙酶活性隨著接種量的增加而提高，接種量＞10%時(shí)，濾紙酶活性隨著接種量的增加而下降，當(dāng)接種量為10%時(shí)，濾紙酶活性達(dá)最高，為2.15 U·mL-1。因此，里氏木霉ATR-4產(chǎn)酶的最佳接種量定為10%。

2.2.5 攪拌速度對里氏木霉ATR-4 產(chǎn)酶能力的影響

攪拌速度對里氏木霉ATR-4 產(chǎn)酶能力的影響見圖5。

圖5 攪拌速度對里氏木霉ATR-4產(chǎn)酶能力的影響

由圖5 可知，攪拌速度在400 r·min-1時(shí)，濾紙酶活性最高，顯著高于攪拌速度200、600 r·min-1時(shí)（P＜0.05）。因此，里氏木霉ATR-4 產(chǎn)酶的最佳攪拌速度定為400 r·min-1。

2.2.6 正交實(shí)驗(yàn)

通過單因素實(shí)驗(yàn)初步確定里氏木霉ATR-4 產(chǎn)酶的最佳工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間84 h，硫酸銨濃度1.5 g·L-1，微晶纖維素濃度10 g·L-1，接種量10%，攪拌速度400 r·min-1。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇對里氏木霉ATR-4 固體發(fā)酵產(chǎn)酶能力影響較大的4 個(gè)因素（發(fā)酵時(shí)間、硫酸銨濃度、接種量、攪拌速度）進(jìn)行L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行3次。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見表2。

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表3，以極差大小確定因素主次順序。從極差分析可知，影響里氏木霉ATR-4 產(chǎn)酶的主要因素是攪拌速度，其次是發(fā)酵時(shí)間和接種量，硫酸銨濃度的影響最小。里氏木霉ATR-4產(chǎn)酶的最佳組合為A1B1C2D3，即發(fā)酵時(shí)間78 h，硫酸銨濃度1 g·L-1，接種量10%，攪拌速度400 r·min-1。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因數(shù)水平表L 9（34）

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

在上述正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件下，對里氏木霉ATR-4 發(fā)酵產(chǎn)酶活性的最適發(fā)酵條件進(jìn)行驗(yàn)證，平行實(shí)驗(yàn)3次，測得濾紙酶活性為4.57 U·mL-1，該結(jié)果大于單因素實(shí)驗(yàn)最佳條件的得率。說明各因素間相互作用可以提高里氏木霉ATR-4 產(chǎn)濾紙酶活性，達(dá)到更好的提取效果。

3 結(jié) 論

采用常壓室溫等離子體（ARTP）誘變技術(shù)處理里氏木霉Trichoderma reesei RUT-C30菌株，經(jīng)液體發(fā)酵篩選，選擇纖維素酶活性較高菌株并對其液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。在誘變時(shí)間240 s 條件下獲得11 株突變里氏木霉ATR-4，其濾紙酶活（FPU）最高可達(dá)2.01 U·mL-1。對突變里氏木霉菌株ATR-4的發(fā)酵條件優(yōu)化，篩選得到最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)條件為：發(fā)酵時(shí)間78 h，硫酸銨濃度1 g·L-1，接種量10%，攪拌速度400 r·min-1，乳糖10 g·L-1，微晶纖維素10 g·L-1，玉米漿粉12 g·L-1，MgSO41.2 g·L-1，CaCl21.4 g·L-1，Mandels 微量元素營養(yǎng)鹽1 mL·L-1，吐溫80 2 mL·L-1，pH 4.8，發(fā)酵溫度30 ℃，通氣量2 vvm。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最高酶活可達(dá)4.57 U·mL-1。本研究結(jié)果表明，常壓室溫等離子體（ARTP）誘變可有效對里氏木霉進(jìn)行誘變育種，改善其產(chǎn)酶能力。研究選育獲得產(chǎn)纖維素酶能力較穩(wěn)定的突變里氏木霉菌株ATR-4，可為后續(xù)大規(guī)模培養(yǎng)與應(yīng)用提供重要依據(jù)。