劉潔，羅展雄，陳祖平

（柳州市人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科，廣西 柳州 545004）

心血管系統(tǒng)疾病是威脅人類生命健康的主要原因之一，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動脈粥樣硬化發(fā)生的基礎(chǔ)。內(nèi)皮祖細(xì)胞是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，參與內(nèi)皮組織損傷修復(fù)，其在骨髓、脾臟等多種器官中存在，內(nèi)皮祖細(xì)胞可以遷移到外周血并聚集到損傷血管周圍促進(jìn)損傷修復(fù)[1]。核轉(zhuǎn)錄因子核因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的重要亞單位之一NF-κB p65，參與炎癥、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞生長、氧化應(yīng)激等過程，在腫瘤、心血管等疾病中扮演重要角色[2]。最近研究顯示，內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷與NF-кB p65 過度表達(dá)有關(guān)，在高糖、氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein,OX-LDL）等誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷中過度激活[3]。本實(shí)驗(yàn)以人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，通過microRNA 干擾技術(shù)下調(diào)內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-κB p65 的表達(dá)，探討其在OX-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷中的作用，為明確動脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康人外周血來自柳州市人民醫(yī)院。SYBR premix Ex Taq 和Prime Script RT reagent kit 購自大連TaKaRa 公司，引物由生工生物（上海）股份有限公司合成，ECL 發(fā)光試劑盒、NF-кB p65 抗體均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，丙二醛（Malonaldehyde,MDA）含量檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶（superoxide orgotein dismutase,SOD）活力檢測試劑盒均購自北京Solarbio 公司，活化的Caspase-3 抗體、活化的Caspase-9 抗體均購自美國Abcam 公司，OX-LDL 購自美國Sigma 公司。

1.2 內(nèi)皮祖細(xì)胞分離培養(yǎng)

取健康人外周血，按照密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞，按照5×105個/cm2接種細(xì)胞種植到纖維連接蛋白包被好的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個孔中加入1 ml M199 細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中含有10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素、b-FGF 1 和50 ng/ml 血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），放在飽和濕度、37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d 以后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，添加PBS 洗滌后，貼壁細(xì)胞用免疫組織化學(xué)檢測CD34、VEGFR-2 的陽性表達(dá)率均＞90%，CD133 免疫熒光檢測其陽性率＞95%，DiI-ac-LDL 和FITC-UEA-1 雙染染色陽性率＞90%，鑒定為內(nèi)皮祖細(xì)胞[8]。

1.3 OX-LDL 處理后的內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-κB p65表達(dá)水平

取內(nèi)皮祖細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞配制成單細(xì)胞懸浮液，分別用0 和10 mg/L[1]OX-LDL 細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 以后，記為Control 和OX-LDL，用于實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）和Western blotting 檢測。

1.3.1 qRT-PCR取內(nèi)皮祖細(xì)胞，用細(xì)胞總RNA 提取試劑盒分別提取內(nèi)皮祖細(xì)胞的RNA，步驟按照試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)流程操作。檢測其OD 260/280 nm 的比值在1.8 ～2.0。用Prime Script RT reagent kit 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用SYBR premix Ex Taq 分析NF-κB p65 mRNA 表達(dá)水平，反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃預(yù)變性10 s，95℃退火10 s，60℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。GAPDH作 為參 照，2-△△Ct法分 析NF-κB p65 mRNA 水 平。GAPDH 引物正向：5'-GGTGAAGGTCGGTGTCAACG-3'，反向：5'-GAGCCCTTCCACGATGCCAA-3'。NF-κB p65 引物正向：5'-AAGATCAATGGCTCACAGG-3'，反向：5'-CCTCAATGTCTTCTTTCTGA-3'。

1.3.2 BCA 法蛋白定量取內(nèi)皮祖細(xì)胞，用移液槍小心將上清吸棄以后，用PBS 將各組細(xì)胞洗滌2 次，分別在細(xì)胞中添加適量的裂解液，將細(xì)胞放在冰上裂解反應(yīng)30 min，取細(xì)胞刮棒將各組細(xì)胞裂解液收集到離心管內(nèi)，4℃高速離心以后，對蛋白進(jìn)行定量，具體步驟同BCA 蛋白定量試劑盒操作流程。按照每個上樣泳道中添加樣品40 μg，濃縮膠90 V 電壓電泳，分離膠120 V 電壓電泳。在200 mA 電流條件下把凝膠上蛋白電轉(zhuǎn)至NC 膜后，用封閉液（5%牛血清白蛋白）將非特異性的位點(diǎn)封閉以后，同NF-κB p65 一抗（1∶200 稀釋）置于4℃過夜反應(yīng)，與HRP 標(biāo)記的二抗（1∶2 000 稀釋）結(jié)合2 h。按照增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）發(fā)光，用Image J 軟件以GAPDH 作為參照分析NF-κB p65 蛋白表達(dá)。

1.4 慢病毒感染及細(xì)胞分組

內(nèi)皮祖細(xì)胞分為4 組，分別為Control 組、OXLDL 組、siRNA control+OX-LDL 組、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 組，Control 組和OX-LDL 組處理方法同1.3 部分。siRNA control+OX-LDL 組為感染siRNA Control 陰性對照慢病毒的內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)10 mg/L 的OX-LDL 細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，NF-κB p65 siRNA+ OX-LDL 組為感染NF-κB p65 siRNA 慢病毒的內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)10 mg/L OX-LDL 細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。慢病毒由山東維真生物科技有限公司構(gòu)建，慢病毒感染方法簡述為：內(nèi)皮祖細(xì)胞密度生長為60%時，將原細(xì)胞培養(yǎng)液吸棄，加入新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，同時加入8 μg/ml 的聚凝胺，按照MOI 值為10 添加慢病毒顆粒，培養(yǎng)過夜以后，檢測GFP 熒光表達(dá)情況，感染效率高于90%。OX-LDL 組、siRNA control+OX-LDL 組、NFκB p65 siRNA+OX-LDL 組細(xì)胞用qRT-PCR 和Western blotting 檢測干擾效果，步驟同1.3 部分。

1.5 MTT 檢測細(xì)胞增殖

內(nèi)皮祖細(xì)胞種植到96 孔培養(yǎng)板（提前用纖維連接蛋白包被）中，按照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 分組處理培養(yǎng)。取出96 孔培養(yǎng)板，每孔加10 μl MTT，放在37℃靜置4 h。將孔內(nèi)的液體分別吸除掉后，加DMSO將結(jié)晶溶解，將酶標(biāo)儀調(diào)整到490 nm 波長處，檢測各孔的OD 值，用不添加細(xì)胞的孔調(diào)零以后，分析細(xì)胞存活率變化。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

按照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL分組培養(yǎng)后，添加1×PBS 將各組內(nèi)皮祖細(xì)胞洗滌2 次。再加入0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞收集后，加入400 μl 緩沖液混合，分別添加Annexin V-FITC 約10 μl 和PI 約5 μl 至各組待測細(xì)胞中混合，避光反應(yīng)15 min。繼續(xù)加入100 μl 緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞凋亡水平。

1.7 Western blotting 檢測細(xì)胞中活化的Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平

按 照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 分組培養(yǎng)后，檢測細(xì)胞中活化的Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)情況，步驟同1.3部分中Western blotting 操作。

1.8 SOD 活力及MDA 含量檢測

按 照Control、OX-LDL、siRNA control+OX-LDL、NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 分組培養(yǎng)后，收集細(xì)胞，把細(xì)胞裂解以后，檢測裂解液中SOD 活力及MDA 含量，步驟均參照試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)流程。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OX-LDL 誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-κB p65 的表達(dá)的影響

內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)過OX-LDL 處理以后，細(xì)胞中的NF-κB p65 mRNA及蛋白水平均升高（P＜0.05）。OX-LDL 可以誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-κB p65 的表達(dá)。見表1 和圖1。

表1 兩組NF-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)的比較 （±s）

表1 兩組NF-κB p65 mRNA和蛋白表達(dá)的比較 （±s）

注：?與Control 組比較，P＜0.05

組別 NF-κB p65 mRNA NF-κB p65 蛋白Control 組 1.000±0.113 0.170±0.022 OX-LDL 組 1.852±0.121? 0.302±0.053?t值 12.269 4.181P值 0.000 0.000

圖1 OX-LDL 處理前后內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-кB p65 表達(dá)

2.2 NF-κB p65 siRNA 對OX-LDL 條件下內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-κB p65 表達(dá)的影響

內(nèi)皮祖細(xì)胞感染NF-κB p65 siRNA 慢病毒，經(jīng)過OX-LDL 處理以后，細(xì)胞中的NF-κB p65 mRNA及蛋白水平降低（P＜0.05）。見表2 和圖2。

2.3 敲低NF-κB p65 對OX-LDL 條件下內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖活性的影響

OX-LDL 處理后內(nèi)皮祖細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞增殖能力下降（P＜0.05），敲低NF-κB p65 可以提高OX-LDL 條件下內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖活性。敲低NF-κB p65 具有拮抗OX-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖抑制作用。見表3。

表2 各組NF-κB p65 mRNA 和蛋白表達(dá)的比較 （±s）

表2 各組NF-κB p65 mRNA 和蛋白表達(dá)的比較 （±s）

注：?與OX-LDL 組、siRNA control+OX-LDL 組比較，P＜0.05

NF-κB p65 蛋白OX-LDL 組 1.000±0.000 0.279±0.016 siRNA control+OX-LDL 組 1.011±0.082 0.294±0.042 NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 組 0.321±0.027? 0.110±0.031?F值 192.863 31.759P值 0.000 0.001組別 NF-κB p65 mRNA

圖2 NF-κB p65 siRNA 對OX-LDL 條件下 內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-κB p65 沉默效果

2.4 敲低NF-κB p65 對OX-LDL 條件下內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的影響

OX-LDL 處理后內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡率升高，同時細(xì)胞中凋亡蛋白活化的Caspase-3、Caspase-9 水平也升高，敲低NF-кB p65 可以降低OX-LDL 條件下內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡水平并下調(diào)細(xì)胞中活化的Caspase-3、Caspase-9蛋白水平（P＜0.05）。敲低NF-кB p65 具有拮抗OXLDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡作用。見圖3、4 和表4。

表3 沉默NF-κB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的 內(nèi)皮祖細(xì)胞存活率 （%，±s）

表3 沉默NF-κB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的 內(nèi)皮祖細(xì)胞存活率 （%，±s）

注：1）與Control 組比較，P＜0.05；2）與OX-LDL 組、siRNA control+OX-LDL 組比較，P＜0.05

組別 存活率Control 組 100.000±9.021 OX-LDL 組 58.449±8.1371）siRNA control+OX-LDL 組 60.479±7.232 NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 組 81.359±8.6892）F組 23.709P組 0.000

2.5 敲低NF-κB p65 對OX-LDL 條件下內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化損傷的影響

OX-LDL 處理后內(nèi)皮祖細(xì)胞裂解液中抗氧化酶SOD 活性降低，MDA 含量升高，敲低NF-κB p65 能夠降低OX-LDL 條件下內(nèi)皮祖細(xì)胞裂解液中MDA 含量，并提高SOD 活性（P＜0.05）。敲低NF-κB p65具有拮抗OX-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用。見表5。

圖3 內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡

圖4 沉默NF-кB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡變化

表4 沉默NF-кB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡率及活化的Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平變化 （±s）

表4 沉默NF-кB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡率及活化的Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平變化 （±s）

注：1）與Control 組比較，P＜0.05；2）與OX-LDL 組、siRNA control+OX-LDL 組比較，P＜0.05

組別 凋亡率/% 活化的Caspase-3 活化的Caspase-9 Control 組 8.561±1.522 0.237±0.043 0.281±0.052 OX-LDL 組 28.957±3.7431） 0.410±0.0591） 0.542±0.0811）siRNA control+OX-LDL 組 29.411±4.171 0.417±0.033 0.560±0.072 NF-κB p65 siRNA+OX-LDL 組 15.782±1.1622） 0.320±0.0212） 0.393±0.0522）F值 36.044 13.215 12.877P值 0.000 0.002 0.002

表5 沉默NF-кB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞裂解液中SOD 活性及MDA 含量變化 （±s）

表5 沉默NF-кB p65 后經(jīng)OX-LDL 處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞裂解液中SOD 活性及MDA 含量變化 （±s）

注：1）與Control 組比較，P＜0.05；2）與OX-LDL 組、siRNA control+OX-LDL 組比較，P＜0.05

MDA 含量/（nmol/ml）組別 SOD 活性/（u/ml）Control 組 42.510±3.242 5.689±1.348 OX-LDL 組 9.892±1.1421） 14.581±1.7211）siRNA control+OX-LDL 組 10.210±1.262 14.821±1.958 NF-кB p65 siRNA+OX-LDL 組19.676±1.8722） 11.010±1.2312）F值 166.062 21.510P值 0.000 0.000

3 討論

近年來很多研究表明，在骨髓、臍帶血、外周血等中均有內(nèi)皮祖細(xì)胞存在，內(nèi)皮祖細(xì)胞作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，其以CD34、CD133、VEGFR-2 為標(biāo)志，能夠分化成為內(nèi)皮細(xì)胞，在血管新生及損傷修復(fù)中具有重要作用[4]。動脈粥樣硬化是以血管內(nèi)皮損傷為主特征的心血管系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機(jī)制與內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷密切相關(guān)[5]。OX-LDL 是動脈粥樣硬化發(fā)生的主要誘導(dǎo)因子，也是內(nèi)皮功能障礙發(fā)生的原因之一，其可以誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷[6]。本研究表明，OX-LDL組處理后的內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞凋亡增多，提示成功構(gòu)建動脈粥樣硬化內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷模型。

NF-κB 在體內(nèi)的分布極為廣泛，是一個轉(zhuǎn)錄因子家族，NF-κB 含有5 個成員，其中NF-κB p65 是重要的NF-κB 家族成員之一，其N 端含有Rel 同源區(qū)，參與DNA 結(jié)合和二聚體的形成，另外，NF-κB p65 還含有1 個TAD 結(jié)構(gòu)域，具有正向調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的作用[7]。NF-κB p65 參與多種生理過程，包括細(xì)胞生長、凋亡、免疫反應(yīng)等，在內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等各種類型的細(xì)胞中均有表達(dá)[8]。目前研究表明，NF-κB p65 在動脈粥樣硬化中過度激活，參與內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷發(fā)生，在銀杏內(nèi)酯B、Ang-1基因調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖中異常表達(dá)[9]。本實(shí)驗(yàn)表明，OX-LDL 處理可以誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞中NF-κB p65 高表達(dá)，敲低其表達(dá)后可以減少OX-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡，提高內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖活性，提示敲低NF-κB p65 在動脈粥樣硬化內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。

眾所周知，正常組織中細(xì)胞增殖和凋亡處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞過度增殖或者過度凋亡時都可以引起疾病的發(fā)生，內(nèi)皮祖細(xì)胞過度凋亡是動脈粥樣硬化發(fā)生的重要機(jī)制之一[10]。細(xì)胞凋亡的發(fā)生與細(xì)胞內(nèi)的Caspase 蛋白級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)，該級聯(lián)反應(yīng)幾乎參與所有細(xì)胞的凋亡過程，Caspase-9 是位于凋亡反應(yīng)上游的起始因子，Caspase-3 位于凋亡反應(yīng)的下游，兩者在活化后可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。氧化應(yīng)激是細(xì)胞凋亡發(fā)生的誘導(dǎo)因素之一，細(xì)胞內(nèi)過量的氧自由基可以促進(jìn)細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，而細(xì)胞內(nèi)過量的氧自由基與細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD 活性降低有關(guān)，MDA是脂質(zhì)發(fā)生過氧化的產(chǎn)物[11]。另外，內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化損傷也是動脈粥樣硬化發(fā)生的機(jī)制之一。NF-кBp65具有促進(jìn)心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞凋亡作用，在心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)揮促進(jìn)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，OX-LDL 條件下，敲低NF-κB p65 后的內(nèi)皮祖細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9 蛋白水平降低，SOD 活性升高，MDA 含量降低，這可能表明敲低NFκB p65 通過降低OX-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化應(yīng)激減少細(xì)胞凋亡。

NF-κB p65 在內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷中表達(dá)水平升高，敲低其表達(dá)可以減少內(nèi)皮祖細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，提高內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖活性，敲低NF-κB p65 表達(dá)具有減輕動脈粥樣硬化內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷作用，這為研究動脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制提供了基礎(chǔ)，也為以后探討NF-κB p65 在內(nèi)皮祖細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，但對其具體的調(diào)控機(jī)制和作用機(jī)制尚不清楚，在以后的研究中將進(jìn)一步探討。