彭芳珍,王書揚,佘銳萍,胡艷欣,靳 紅

(1.安慶師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽 安慶 246052;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,北京 海淀 100193;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技教育司,北京 朝陽 100026)

雞傳染性支氣管炎(IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的雞的一種急性高度接觸性傳染病,主要侵害雞的呼吸、泌尿生殖和消化系統(tǒng)等,可導(dǎo)致不同日齡的雞發(fā)生不同程度的危害。IBV往往引起復(fù)合感染(如新城疫、慢性呼吸道病等),并可繼發(fā)細(xì)菌性疾病如大腸桿菌病、沙門菌病等,從而加重了對雞群的危害。IBV是危害我國養(yǎng)禽業(yè)的主要疫病之一[1-4],國內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)每年因該病導(dǎo)致直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)億元人民幣。為了從微觀水平觀察接種IBV后雛雞氣管黏膜結(jié)構(gòu)的變化,本研究選取接種IBV后不同日齡的氣管下段組織進(jìn)行了掃描電鏡觀察,試驗結(jié)果為IBV的發(fā)病機理的研究提供了形態(tài)學(xué)證據(jù),進(jìn)而為IB的綜合防治提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 IBV毒株 M41株,由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病與微生物教研室提供,ELD50=10-5.63/0.1 mL。

1.2 飼料 雛雞全價飼料,購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)震亞飼料廠。

1.3 實驗動物 80只14日齡無特定病原體動物(Specific Pathogen Free,SPF)白來航雞,購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司。隨機平均分為對照組和試驗組。

1.4 主要設(shè)備 日立HCP-2臨界點二氧化碳干燥儀;離子濺射儀日立IB-5;日立S-570掃描電鏡。

1.5 樣品的準(zhǔn)備 試驗組雛雞用M41株尿囊液滴鼻點眼,0.3 mL/只。攻毒后5 d和7 d分別取試驗組和對照組各5只雞,頸靜脈放血處死,采取氣管下1/3段,在2.5%戊二醛-多聚甲醛混合固定液中充分固定后,備用。對試驗組死亡雞只及時剖檢,觀察、記錄大體病理變化。

1.6 掃描電鏡樣品的制作 掃描電鏡樣品具體的制作過程如下：取已經(jīng)固定好的樣品,修成大小為1 mm3左右的小塊;PBS(0.1 mol/L,pH值7.4～7.6)沖洗;鋨酸(1%)后固定1 h;PBS(0.1 mol/L,pH值7.4～7.6)沖洗3×5 min;用梯度乙醇逐級脫水(乙醇濃度從30% ～100%);醋酸異戊酯置換,4℃過夜;日立HCP-2臨界點二氧化碳干燥儀干燥;粘臺(每種樣品分別有俯視觀察面和側(cè)視觀察面?zhèn)€一個樣品);噴金(離子濺射儀 日立 IB-5);日立S-570掃描電鏡觀察拍照。

2 試驗結(jié)果

掃描電鏡觀察到的結(jié)果如下(參見圖1～8)。

圖1 感染后5 d對照組氣管表面纖毛排列整齊,見杯狀細(xì)胞 SEM,2 900×

圖1為感染后第5天對照組雛雞氣管掃描電鏡圖,從圖中可見,雛雞氣管表面纖毛排列整齊,似麥浪樣,還可見杯狀細(xì)胞,細(xì)胞間聯(lián)系致密。圖2為感染后第5天試驗組雛雞氣管掃描電鏡圖,從圖中可見,感染組雛雞氣管表面纖毛集結(jié)成束,表面有大量黏液附著,纖毛擺動無力,杯狀細(xì)胞已不易觀察到。

圖3為感染后第7天對照組雛雞氣管掃描電鏡圖,從圖中可見,氣管表面纖毛排列整齊,似麥浪樣,杯狀細(xì)胞清晰可見,細(xì)胞間聯(lián)系致密。圖4為感染后第7天氣管掃描電鏡圖,從圖中可見,氣管表面纖毛已完全被黏液覆蓋,纖毛粘連,看不見杯狀細(xì)胞。

圖2 感染后5天試驗組氣管表面有黏液附著,纖毛粘集 SEM,2 500×

圖3 感染后7 d對照組氣管表面纖毛排列整齊,杯狀細(xì)胞清晰可見 SEM,2 150×

另外,感染后氣管還出現(xiàn)黏膜脫落,固有層裸露,氣管表面可見大量炎性細(xì)胞滲出,還可見紅細(xì)胞的穿出,隨感染期的延長,這些癥狀有加劇趨勢(圖5～8)。

圖4 感染后7 d試驗組氣管表面大量黏液覆蓋 SEM,2 000×

圖5 感染后5 d,氣管表面炎性細(xì)胞滲出SEM,2 000×

圖6 感染后7 d,氣管表面炎性細(xì)胞滲出明顯增多 SEM,1 000×

圖7 感染后5 d,部分氣管黏膜脫落,炎性細(xì)胞從固有層穿出 SEM,1 000×

3 討論

氣管黏膜上皮為假復(fù)層纖毛柱狀上皮,主要由纖毛柱狀上皮細(xì)胞、杯狀細(xì)胞以及基細(xì)胞等構(gòu)成。

纖毛具有凈化呼吸道的重要功能,正常情況下,纖毛擺動頻率為5～20 Hz,黏液的黏度以及心跳和呼吸頻率可影響纖毛擺動頻率。纖毛內(nèi)、外臂中的動力蛋白,即ATP酶提供能量,使得相鄰纖毛依次按一定順序有規(guī)律地向咽側(cè)擺動,產(chǎn)生推力,將上皮細(xì)胞表面的黏液及附著在其上的塵埃和細(xì)菌等異物推向咽部并排出[5]。

慢性支氣管炎患者的纖毛細(xì)胞內(nèi)可見線粒體腫脹和嵴斷裂;長期吸煙者纖毛細(xì)胞的纖毛會減少或消失;纖毛無運動綜合征患者出現(xiàn)呼吸道部分纖毛細(xì)胞的結(jié)構(gòu)異常,從而導(dǎo)致纖毛運動不協(xié)調(diào)而不能有效地發(fā)揮其清除異物的功能。

除了形態(tài)學(xué)方法外,也可檢測氣管纖毛的運動來評價呼吸道黏膜屏障功能。在人醫(yī)常采用亞甲藍(lán)移動情況觀察及氣管黏膜標(biāo)本錄像觀察的方式統(tǒng)計得到氣管黏膜纖毛的功能指標(biāo),包括黏膜纖毛清除率(MCC)、黏膜纖毛輸送率(MTR)及纖毛擺動頻率(CBF)等,支氣管擴張患者的氣管黏膜纖毛的功能指標(biāo)相對低下[6]。氣管離體時,可采用墨水示蹤法、墨粉示蹤法與紅細(xì)胞示蹤法等示蹤法測定氣管纖毛擺動活性數(shù)據(jù)[7]。

杯狀細(xì)胞的糖原顆粒以出胞方式排出黏蛋白,分布在纖毛頂端,與壁內(nèi)腺體的分泌物共同組成黏液層。黏液層可粘附吸入空氣中的顆粒物質(zhì),通過纖毛的定向擺動,使黏液及其所粘附的異物向咽部移動并排出。但是病理情況下,杯狀細(xì)胞會呈現(xiàn)區(qū)域性增多,黏液分泌亢進(jìn),管腔內(nèi)黏液增多,同進(jìn)黏膜下層的混合腺(主要為黏液腺)也會增生肥大,黏液分泌量增多,過量的黏液會積聚潴留在管腔內(nèi),影響呼吸系統(tǒng)的正常清潔功能。

基細(xì)胞位于上皮基部,是一種未分化的干細(xì)胞,有增殖能力。在上皮損傷時,可增殖分化形成其他上皮細(xì)胞。

IBV感染雛雞的組織切片可見氣管黏膜上皮的杯狀細(xì)胞明顯增多,黏液腺增生肥大,開口增多,腺體分泌亢進(jìn)。從圖2,圖4可見,感染IBV后黏液分泌明顯增多,從圖5～8可見,氣管部分纖毛及黏膜脫落,固有層裸露,同時可見有紅細(xì)胞等炎性細(xì)胞從氣管固有層細(xì)胞間穿出。這可能是由于病毒在氣管黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)大量增生繁殖,嚴(yán)重影響到纖毛上皮的功能,從而導(dǎo)致氣管等呼吸系統(tǒng)的炎癥,黏液增多,氣管黏膜上皮受損出現(xiàn)出血癥狀。同時由于纖毛柱狀細(xì)胞的受損及黏液分泌的亢進(jìn),雞只表現(xiàn)為伸頸,張口呼吸,咳嗽,并出現(xiàn)氣管啰音。剖檢死亡雞只也可見到呼吸道內(nèi)有漿液性、卡他性和干酪樣的滲出物。

以上觀察到的氣管黏膜表面的超微結(jié)構(gòu)變化表明,在IBV感染雞只后,機體防御呼吸系統(tǒng)疾病的重要門戶-氣管的結(jié)構(gòu)與功能受損,必然影響到機體對疾病的抵抗能力,這也進(jìn)一步為IB的發(fā)病機理提供了形態(tài)學(xué)上的依據(jù)。