張華 孫穎穎 于晨

摘要：以鴨梨果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，研究了哈茨木霉對(duì)貯藏在常溫條件（20±1°C）下鴨梨果實(shí)采后青霉病的抑制效果及相關(guān)機(jī)理。結(jié)果表明，哈茨木霉顯著抑制了青霉病的發(fā)病率和病斑直徑。哈茨木霉處理提高了鴨梨果實(shí)中幾丁質(zhì)酶（chitinase，CHI）和β-1，3-葡聚糖酶（β-1，3-glucanase，GLU）的活性，誘導(dǎo)了鴨梨果實(shí)中過氧化氫酶（catalase，CAT）、多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）等抗病相關(guān)酶活性的提高。哈茨木霉通過誘導(dǎo)提高抗病性相關(guān)酶活性，從而減輕鴨梨果實(shí)采后青霉病的發(fā)生。

關(guān)鍵詞：哈茨木霉;鴨梨;青霉病;誘導(dǎo)抗病性

中圖分類號(hào) TS255.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）12-0084-3

Abstract：The effects of Trichoderma harzianum on blue mold decay in harvested Yali pear fruit stored at 20±1°C and the possible mechanisms were investigated. The results showed that fruit treated with Trichoderma harzianum had significantly lower disease incidence and smaller lesion diameter than the control fruit did. Trichoderma harzianum treatment significantly enhanced activities of chitinase（CHI），β-1，3-glucanase（GLU），catalase（CAT），peroxidase（POD），and polyphenoloxidase（PPO）. The experimental results suggested that Trichoderma harzianum could effectively suppress blue mold decay in pear fruit may be related to the induction o f defensiv e enzyme activities.

Key words：Trichoderma harzianum;Pyrus bretschneideri;Blue mold decay;Induced disease resistance

鴨梨（Pyrus bretschneideri Rehd.）是白梨系統(tǒng)中的優(yōu)良品種，果實(shí)皮薄多汁，營(yíng)養(yǎng)豐富，受到國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的歡迎，每年需求量巨大，但果實(shí)在貯藏期間易發(fā)生真菌病害，造成了巨大的損失，影響果實(shí)的貯藏和銷售。其中由擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是鴨梨采后貯藏的主要真菌病害之一[1]。對(duì)于水果采后真菌病害的防治，傳統(tǒng)的方法是依靠人工合成的化學(xué)殺菌劑，但長(zhǎng)期使用會(huì)造成真菌產(chǎn)生抗藥性以及農(nóng)藥殘留，隨著人們環(huán)境保護(hù)意識(shí)的提高，通過生物防治的方法抑制采后病害的發(fā)展成為研究熱點(diǎn)。

木霉菌是防治效果非常好的生防真菌，其抗性效果在多種植物中都有報(bào)道。哈茨木霉（Trichoderma harzianum）屬于半知菌門絲孢目木霉屬，廣泛存在于不同環(huán)境中的土壤中。眾多的研究結(jié)果表明，哈茨木霉在農(nóng)作物上的使用可抑制植物病原真菌、細(xì)菌、昆蟲等有害生物，同時(shí)還可以促進(jìn)農(nóng)作物的生長(zhǎng)，被廣泛應(yīng)用于生物防治[2]，但關(guān)于哈茨木霉對(duì)鴨梨果實(shí)采后青霉病的抑制效果及相關(guān)機(jī)理尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)研究了哈茨木霉對(duì)鴨梨果實(shí)采后青霉病的抑制效果和相關(guān)機(jī)理，以期為哈茨木霉在水果采后貯運(yùn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)處理 哈茨木霉在PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯：200g;葡萄糖：20g;瓊脂：20g;水：1000mL）上擴(kuò)大培養(yǎng)15d，使用血球計(jì)數(shù)板配置濃度為1×108個(gè)/mL的孢子懸浮液。將青霉菌孢子接種于PDA培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)7d，使用血球計(jì)數(shù)板配置濃度為5×104個(gè)/mL的孢子懸浮液。鴨梨果實(shí)采摘自山東省聊城市冠縣果園，選擇大小、成熟度一致，無物理損傷和病蟲害的果實(shí)，隨機(jī)分成2組，為避免交叉感染，先用75%的酒精擦拭鴨梨果實(shí)表面需要接種的部位，用無菌打孔器在果實(shí)的赤道部位打孔（深4mm，直徑2mm）。處理組用移液槍注入25?L的哈茨木霉孢子懸浮液，對(duì)照組注入等量的無菌水，2h后在打孔處注入15?L的青霉菌孢子菌懸液。處理完畢后，用0.01mm厚的聚乙烯保鮮袋分裝果實(shí)，將果實(shí)貯藏于20±1°C、相對(duì)濕度為90%的生化培養(yǎng)箱中5d，在貯藏的第1、3、5d測(cè)量鴨梨果實(shí)的發(fā)病率和病斑直徑，同時(shí)取果實(shí)病斑外圍2～10mm的樣品，測(cè)定其它生化指標(biāo)，每個(gè)處理20個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鴨梨的發(fā)病率和病斑直徑的測(cè)定 使用游標(biāo)卡尺測(cè)量鴨梨果實(shí)的病斑直徑，當(dāng)病斑直徑大于2mm時(shí)，認(rèn)定為是發(fā)病，發(fā)病率（%）=（發(fā)病果個(gè)數(shù)/果實(shí)總數(shù)）×100。

1.2.2 鴨梨果實(shí)組織中抗病相關(guān)酶活性的測(cè)定 稱取1g鴨梨果實(shí)組織，冰浴條件下用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（5mL，pH5.0）勻漿，4℃離心（12000r/min）15min，所得上清液用于測(cè)定幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性。根據(jù)王雷等的方法[3]，以每分鐘增加0.001個(gè)光密度所需要的酶量為1個(gè)幾丁質(zhì)酶活力單位;以每小時(shí)生成1mg葡萄糖為1個(gè)β-1，3-葡聚糖酶活力單位，結(jié)果表示為U mg-1protein。CAT的活性按照Liu等[4]的方法進(jìn)行測(cè)定，以反應(yīng)液每分鐘在240nm處吸光值變化0.001為1個(gè)酶活力單位，結(jié)果表示為U mg-1protein。PPO和POD的活性依據(jù)Jiang等[5]所述方法測(cè)量，使用磷酸鈉緩沖液（0.2M，pH6.5）勻漿1g水果組織并離心，反應(yīng)體系中包含0.1mL上清液，0.2mL的鄰苯二酚，在420nm處測(cè)定吸光度值，每分鐘增加0.01為1個(gè)酶活力單位。測(cè)定POD活性時(shí)，吸光度值在470nm處的每分鐘變化為0.01為1個(gè)酶活力單位，結(jié)果表示為U mg-1protein。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[6]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SAS 9.3對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)鴨梨果實(shí)青霉病的抑制效果 由擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）引起的青霉病是鴨梨采后貯藏的主要真菌病害，其引起的腐爛造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。如圖1所示，鴨梨果實(shí)在采后常溫（20±1°C）貯藏過程中，通過穿刺接種青霉菌后，腐爛的發(fā)病率和病斑直徑表現(xiàn)出了上升的趨勢(shì)，接種哈茨木霉處理能夠抑制鴨梨果實(shí)青霉病的擴(kuò)展，這說明哈茨木霉處理可以控制鴨梨果實(shí)采后的青霉病。貯藏5d后，處理組果實(shí)的病斑直徑比對(duì)照組果實(shí)少49.6%。

2.2 對(duì)鴨梨果實(shí)CHI和GLU活性的影響 由圖2可見，對(duì)照組和處理組的鴨梨果實(shí)組織中幾丁質(zhì)酶活性在貯藏的前3d急劇上升，隨后略有下降。與對(duì)照組相比，整個(gè)貯藏過程中接種哈茨木霉能夠顯著提高鴨梨果實(shí)的幾丁質(zhì)酶活性。處理組鴨梨果實(shí)的β-1，3-葡聚糖酶活性表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)，而對(duì)照組在第1天上升隨后略有下降，處理組在整個(gè)貯藏期內(nèi)都顯著高于對(duì)照組。這2種酶是非常重要的抗性酶，可以破壞病原菌的細(xì)胞壁，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)。多種采后處理方式在草莓[3]、葡萄[5]等水果上都通過誘導(dǎo)提高了這2種抗性酶活性，最終提高果實(shí)的抗病性，減少采后病害的發(fā)生。

2.3 對(duì)鴨梨果實(shí)CAT活性的影響 鴨梨果實(shí)組織中CAT活性在貯藏的前3天迅速上升，隨后處理組果實(shí)略有上升而對(duì)照組的活性略有下降，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，哈茨木霉處理組的果實(shí)CAT活性都顯著高于對(duì)照果實(shí)。水果的抗病性與CAT活性密切相關(guān)，CAT是植物體內(nèi)清除活性氧系統(tǒng)的主要酶，活性氧自由基的積累會(huì)降低水果的抗病性。眾多的研究結(jié)果表明，提高果實(shí)中CAT的活性，有助于提高果實(shí)的抗病性[5，7]。

2.4 對(duì)鴨梨果實(shí)POD和PPO活性的影響 由圖4可見，鴨梨果實(shí)的POD活性先上升隨后下降，處理組果實(shí)顯著高于對(duì)照組。處理組鴨梨果實(shí)的PPO活性在貯藏的前3天上升達(dá)到最大值，隨后略有下降，哈茨木霉處理顯著提高了PPO活性的上升。POD在果實(shí)中參與木質(zhì)素的合成，PPO能夠提高抗菌物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，兩者都可提高果實(shí)的抗病性。Jiang等人[5]的研究結(jié)果表明，茉莉酸甲酯通過提高POD和PPO的活性提高了葡萄果實(shí)的抗病性。

3 結(jié)論

哈茨木霉處理促進(jìn)了CHI、GLU、CAT、PPO及POD等抗性相關(guān)酶活性的提高，這是哈茨木霉抑制鴨梨果實(shí)采后青霉病的重要作用機(jī)理，可以有效抑制青霉菌在鴨梨果實(shí)上的發(fā)病率和病斑直徑。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)編：王慧晴）