魏雙霞，師尚禮，康文娟，譚諶淼

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

苜蓿具有產(chǎn)量高，粗蛋白含量高，適口性好的特點(diǎn)，在世界范圍內(nèi)廣泛種植[1-2]。青藏高原素有 “世界屋脊"和 “世界第三極"之稱(chēng)[3]，是我國(guó)重要的草地畜牧業(yè)基地之一，但過(guò)度放牧使天然草地產(chǎn)量下降，毒雜草滋生，牧草品質(zhì)降低[4]，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。解決這一問(wèn)題，需要了解紫花苜蓿對(duì)寒冷地區(qū)的適應(yīng)性特征和規(guī)律。因此，深入研究苜蓿的生產(chǎn)性能和遺傳基礎(chǔ)，選育出適應(yīng)于該地區(qū)種植的苜蓿新品系，擴(kuò)大其種植范圍，提高生產(chǎn)力，具有舉足輕重的意義。

目前，我國(guó)關(guān)于苜蓿品種適應(yīng)性評(píng)價(jià)的研究主要在干旱半干旱地區(qū)，朱博等[5]、王虹等[6]通過(guò)綜合評(píng)價(jià)篩選出在西北荒漠地區(qū)種植的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苜蓿品種。而對(duì)苜蓿品種在高寒地區(qū)適應(yīng)性的研究很少，其中丁培俊等[7]在甘南州進(jìn)行了苜蓿引種品比試驗(yàn)，挑選出適宜于青藏高原種植的傳統(tǒng)苜蓿材料金皇后和阿爾岡金。楊瞾等[8]在東北寒冷地區(qū)對(duì)引種的 16個(gè)苜蓿材料應(yīng)用灰色關(guān)聯(lián)度進(jìn)行生產(chǎn)性能評(píng)價(jià)，篩選出適應(yīng)性較好的品種有俄羅斯西伯利亞雜花等。采用3份抗寒苜蓿品系和3份對(duì)照苜蓿材料，進(jìn)行生長(zhǎng)適應(yīng)性對(duì)比試驗(yàn)，綜合評(píng)價(jià)生產(chǎn)性能，以期為高寒牧區(qū)培育多年生抗寒苜蓿新品系，發(fā)展苜蓿產(chǎn)業(yè)提供技術(shù)依據(jù)。

分子標(biāo)記是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，在苜蓿生物技術(shù)育種和種質(zhì)資源評(píng)價(jià)中的地位不可忽視[9]。李哲等[10]用ISSR在遺傳距離0.266處將供試苜蓿材料聚為5大類(lèi)，為其后代株系雜交組合育種的研究提供理論支持。楊瞾等[11]用 ISSR在遺傳距離0.833處將供試抗旱苜蓿材料分為高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值相對(duì)較低2大類(lèi)。應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記方法研究3份抗寒苜蓿品系和3份對(duì)照苜蓿材料俄羅斯西伯利亞雜花、金皇后、阿爾岡金之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近和遺傳多樣性，確定不同品系之間的遺傳差異及遺傳背景，為驗(yàn)育種工作提供分子水平的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2013年4月～2015年5月在高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)的甘南州夏河縣牧草試驗(yàn)站進(jìn)行。夏河縣位于甘南藏族自治州西北部，E 101°54′～103°25′，N 34°32′～35°34′，地處青藏高原東北邊緣，地勢(shì)由西北向東南傾斜，海拔3 000～3 800 m，屬于寒冷濕潤(rùn)性氣候，土壤類(lèi)型為高寒草甸土，有明顯的腐殖質(zhì)積聚，腐殖質(zhì)層厚10 cm，呈灰棕至黑褐色粒狀-扁核狀結(jié)構(gòu)，土壤有機(jī)質(zhì)含量45 140 mg/kg，pH 7.87，速效氮50.83 mg/kg，速效磷10.57 mg/kg，速效鉀230.0 mg/kg，土壤肥力均勻。

1.2 試驗(yàn)材料

供試材料GNKH-1(Cold resistance No.1 of alfalfa)、GNKH-2(Cold resistance No.2 of alfalfa)和GNKH-3(Cold resistance No.3 of alfalfa 3)為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院選育的3個(gè)抗寒苜蓿新品系，具有較強(qiáng)的抗寒能力和優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)性能。對(duì)照材料為抗寒能力強(qiáng)的俄羅斯西伯利亞雜花苜蓿(M.sativasubsp.varia)(FD.2)、金皇后苜蓿(M.sativacv.Golden Empress)(FD.3)和阿爾岡金紫花苜蓿(M.sativacv.Algonguin)(FD.3)，均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供(表1)。

表1 供試苜蓿材料

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，小區(qū)面積3 m×5 m，3次重復(fù)，采用深開(kāi)溝，淺覆土，冬前耙平的播種技術(shù)：人工開(kāi)溝條播，溝深12～15 cm，覆土1～2 cm，冬前耙平埋頸，行距30 cm，播量1.7 g/m2。適時(shí)對(duì)試驗(yàn)地進(jìn)行鋤草及病蟲(chóng)害防治等田間管理。

于2013年12月在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)沙培種植，放置于光照充足、溫度適宜的組織培養(yǎng)室內(nèi)，期間定期定量加入Hogland營(yíng)養(yǎng)液。待出苗后30 d采集各供試苜蓿材料幼嫩葉片提取DNA待用。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 生產(chǎn)性能 (1) 物候期特征比較 對(duì)每個(gè)品種生長(zhǎng)第1年和第2年的出苗期(返青期)、分枝期、現(xiàn)蕾期、初花期進(jìn)行觀測(cè)記錄。苜蓿品種每小區(qū)留2行進(jìn)行物候期觀測(cè)，鑒別的標(biāo)準(zhǔn)是50%的植株達(dá)到某一個(gè)生育階段為某生育期；10%～20%的植株達(dá)到為初期，70%～80%達(dá)到為盛期[18]。

(2) 越冬率 采用隨機(jī)取樣法進(jìn)行調(diào)查，避開(kāi)邊緣地段，在小區(qū)株行內(nèi)隨機(jī)選取長(zhǎng)為1 m的樣段，調(diào)查每一樣段內(nèi)的株數(shù)。翌年植物返青后調(diào)查原樣段內(nèi)返青的株數(shù)，然后計(jì)數(shù)返青后存活的株數(shù)和越冬前總株數(shù)，用下式計(jì)算越冬率。

(3) 干鮮比和干草產(chǎn)量 干鮮比測(cè)產(chǎn)時(shí)，每個(gè)小區(qū)稱(chēng)鮮草500 g，自然風(fēng)干后稱(chēng)重，計(jì)算干鮮比，干鮮比=苜蓿風(fēng)干重/苜蓿鮮重；干草產(chǎn)量 在每茬初花期，每小區(qū)隨機(jī)取樣1 m2，重復(fù)3次，刈割后稱(chēng)重量，留茬高度3～5 cm，取平均值為鮮草產(chǎn)量，根據(jù)干鮮比計(jì)算干草產(chǎn)量。青藏高原高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)2013年刈割1茬，2014年刈割2茬，年度產(chǎn)量為各茬草產(chǎn)量之和。

(4) 株高和生長(zhǎng)速度 株高 在第1茬初花期測(cè)產(chǎn)前，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取10株，測(cè)量植株絕對(duì)高度(拉直測(cè)定)；生長(zhǎng)速度 第1茬草從分枝期開(kāi)始，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取10個(gè)單株，做好標(biāo)記，直到初花期測(cè)定生長(zhǎng)高度，兩次生長(zhǎng)高度之差除以生長(zhǎng)天數(shù)即為生長(zhǎng)速度。

(5)分枝數(shù)和葉莖比 分枝數(shù) 魏臻武等[35]的方法，每年第1茬初花期測(cè)定地表根莖部形成的分枝數(shù)。

葉莖比 測(cè)產(chǎn)時(shí)，取500 g全株鮮草將莖葉分離，稱(chēng)量葉片和莖稈鮮重，105℃殺青15 min，并置于65℃下烘至恒重，冷卻后取出用1%天平稱(chēng)量葉片和莖稈干重。

1.4.2 遺傳特征 (1) DNA提取 每份材料隨機(jī)取10個(gè)單株的幼嫩葉片0.5 g，洗凈葉片后等量混合，采用柱式植物基因組抽提試劑盒提取苜蓿總DNA。

(2) DNA檢測(cè) 在濃度2.0%的瓊脂糖凝膠上對(duì)提取的DNA進(jìn)行電泳，于紫外凝膠成像儀中拍照；用紫外分光光度計(jì)于D260 nm與D280 nm檢測(cè)所提取的DNA濃度。

(3) 引物合成與篩選 試驗(yàn)初期選擇了10條引物，由上海生工有限公司合成。經(jīng)引物篩選試驗(yàn)，篩選了PCR擴(kuò)增效果好、條帶清晰的8條引物用于6份苜蓿的遺傳多樣性研究。

(4)ISSR擴(kuò)增與檢測(cè) 采用25 μLPCR反應(yīng)體系，模板DNA 2 μL、ISSR合成引物1 μL，DreamTaqGreen PCR Master Mix 12.5 μL，雙蒸水9.5 μL。擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃ 4 min，然后循環(huán)，94 ℃ 1 min，45～60℃ 40 s，72℃ 1～2 min，共40輪循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，72℃ 10 min，最后在4℃條件下保存。取PCR產(chǎn)物7 μL于1.6%的瓊脂糖膠上電泳，在0.5×TBE緩沖液中電泳約1.5 h，在紫外凝膠成像儀中拍照。

1.5 數(shù)據(jù)處理和評(píng)價(jià)方法

1.5.1 生產(chǎn)性能評(píng)價(jià) 用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件和EXCEL進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析；應(yīng)用主成分分析法對(duì)多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)判。先把參與主成分分析的n個(gè)指標(biāo)變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算出特征值和貢獻(xiàn)率以及主成分，最后比較總得分值F的大小，F(xiàn)值越大表明該苜蓿材料生產(chǎn)性能適應(yīng)性越強(qiáng)。

1.5.2 遺傳特征分析 對(duì)強(qiáng)帶以及清晰可辨的弱帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)賦值，采取0/1賦值的記帶方法，即有帶計(jì)為“1”，無(wú)帶計(jì)為“0”，從而實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)的統(tǒng)計(jì)。

多態(tài)性位點(diǎn)比率：p=i/j×100%

式中：i為多態(tài)性位點(diǎn)的數(shù)目，j為統(tǒng)計(jì)出的總位點(diǎn)數(shù)目。

使用軟件Ntsys-pc 2.1軟件進(jìn)行分析，計(jì)算 Nei’s遺傳距離，使用UPMGA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，建立聚類(lèi)圖。使用軟件 POPGEN 32計(jì)算ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)信息含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物學(xué)特性及生產(chǎn)性能比較

2.1.1 物候期比較 高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)各苜蓿材料物候期差異很大，各苜蓿材料于2013年5月17日播種，5月25日出苗，截止6月1日齊苗，7月初開(kāi)始分枝，抗寒苜蓿品系分枝期比對(duì)照苜蓿品種早10 d。播種第1年，GNKH-2和GNKH-3出苗期最早，比對(duì)照材料提前5～10 d；GNKH-3、GNKH-2有現(xiàn)蕾并有開(kāi)花，但開(kāi)花數(shù)不足10%，其他品種均只生長(zhǎng)到分枝期。播種第2年，3個(gè)抗寒苜蓿品系返青、分枝、現(xiàn)蕾、開(kāi)花、結(jié)莢、枯黃各物候期時(shí)間較為一致，對(duì)照品種俄羅斯西伯利亞雜花、金皇后和阿爾岡金各物候期時(shí)間較為一致，但GNKH-3和GNKH-2較其他材料提前5 d進(jìn)入現(xiàn)蕾期。播種第2年，各品種均能結(jié)莢，種子均未成熟(表1)。

表2 高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)供試苜蓿材料的物候期

2.1.2 生產(chǎn)性能指標(biāo)特征分析 播種當(dāng)年，供試苜蓿材料均能安全越冬，但越冬率較低，苜蓿材料平均越冬率為60.32%，其中GNKH-3和GNKH-2的越冬率最高，達(dá)到了76.66%，72.34%，顯著高于其他苜蓿品種(P<0.05)，GNKH-1次之，阿爾岡金最低(40.39%)。播種的第2年，供試苜蓿材料的越冬率均超過(guò)90%，顯著高于播種當(dāng)年的越冬率(P<0.05)，GNKH-3的越冬率也最高，為94.43%，顯著高于對(duì)照苜蓿俄羅斯西伯利亞雜花苜蓿(P<0.05)，GNKH-2次之，為93.21%。GNKH-3、GNKH-2、GNKH-1兩年的平均越冬率分別為85.55%、82.78%、78.99%，均高于對(duì)照(圖1)。

綜合分析供試苜蓿材料在高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)的越冬率表現(xiàn)，GNKH-3為適宜高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)的越冬率最高的苜蓿材料，GNKH-2和GNKH-1為高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)越冬率較高的苜蓿材料。

圖1 越冬率Fig.1 Wintering rate

供試苜蓿材料干鮮比隨著生長(zhǎng)年限的增加均呈減小趨勢(shì)。播種當(dāng)年平均干鮮比為0.28，其中阿爾岡金干鮮比最高(0.29)，俄羅斯西伯利亞雜花最低(0.26)。播種第2年，供試苜蓿材料的干鮮比均為0.25，其中GNKH-2干鮮比最高，為0.27，顯著高于俄羅斯西伯利亞雜花和阿爾岡金(P<0.05)，俄羅斯西伯利亞雜花也最低(0.23)。GNKH-2、GNKH-1兩年的平均干鮮比分別為0.27、0.27，均高于對(duì)照(圖2)。

綜合分析供試苜蓿材料在高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)的干鮮比表現(xiàn)，GNKH-2為適宜高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)的干鮮比最高的苜蓿材料，GNKH-1為高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)干鮮比較高的苜蓿材料。

圖2 干鮮比Fig.2 Ratio of dry to fresh mater

播種當(dāng)年，供試苜蓿材料由于生育期沒(méi)有達(dá)到初花期，干草產(chǎn)量較低，隨著生長(zhǎng)年限的增加，不同苜蓿材料的干草產(chǎn)量均呈增加趨勢(shì)。播種當(dāng)年平均干草產(chǎn)量為2.20 t/hm2，其中GNKH-2干草產(chǎn)量最高，為2.95 t/hm2，顯著高于對(duì)照俄羅斯雜花和金皇后(P<0.05)，GNKH-1和GNKH-3次之，分別為2.77、2.67 t/hm2，俄羅斯西伯利亞雜花最低，為1.38 t/hm2。播種第2年，抗寒苜蓿材料的干草產(chǎn)量顯著高于播種當(dāng)年(P<0.05)，對(duì)照苜蓿材料的干草產(chǎn)量相對(duì)于播種當(dāng)年有所增加，但是不顯著。供試苜蓿材料的干草產(chǎn)量平均為5.15 t/hm2，其中GNKH-3干草產(chǎn)量最高，為8.81 t/hm2，顯著高于GNKH-1和對(duì)照苜蓿材料(P<0.05)，GNKH-2和GNKH-1次之，也顯著高于對(duì)照苜蓿材料(P<0.05)，金皇后最低(1.94 t/hm2)。GNKH-3，GNKH-2和GNKH-1兩年的平均干草產(chǎn)量分別為5.74、5.49和4.94 t/hm2，均高于對(duì)照(圖3)。

綜合分析供試苜蓿材料在高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)的干草產(chǎn)量表現(xiàn)，GNKH-3為適宜高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)的干草產(chǎn)量最高的苜蓿材料，GNKH-2和GNKH-1為高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)干草產(chǎn)量較高的苜蓿材料。

圖3 干草產(chǎn)量Fig.3 Hay yield

(3) 株高和生長(zhǎng)速度 播種當(dāng)年，供試苜蓿材料的平均株高為48.10 cm，其中GNKH-3、GNKH-2株高最高，分別為53.45 cm、52.42 cm，顯著高于對(duì)照材料俄羅斯西伯利亞雜花和金皇后(P<0.05)，金皇后最低(41.33 cm)。播種第2年，供試苜蓿材料的株高顯著高于播種當(dāng)年(P<0.05)，平均株高為64.66 cm，其中GNKH-3株高最高，為70.62 cm，顯著高于對(duì)照苜蓿材料(P<0.05)，GNKH-2、GNKH-1次之，為68.32、65.57 cm，均高于對(duì)照材料(57.49～64.21 cm)。GNKH-3，GNKH-2和GNKH-1兩年的平均株高分別為62.03，60.37和58.56 cm，均高于對(duì)照(圖4)。

供試苜蓿材料在高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)速度低，播種當(dāng)年只能收獲1茬，第2年只能收獲2茬。播種當(dāng)年，供試苜蓿材料的生長(zhǎng)速度平均值為0.65 cm/d，其中GNKH-3、GNKH-2生長(zhǎng)速度顯著高于對(duì)照俄羅斯雜花和金皇后(P<0.05)，分別為0.74、0.73 cm/d，GNKH-1次之，為0.70 cm/d，金皇后最低(0.55 cm/d)。播種第2年，供試苜蓿材料的平均生長(zhǎng)速度為0.77 cm/d，供試苜蓿材料的生長(zhǎng)速度有所增加，其中GNKH-3、GNKH-2生長(zhǎng)速度也顯著高于對(duì)照俄羅斯雜花和金皇后，分別為0.86、0.83 cm/d，GNKH-1次之，為0.82 cm/d，金皇后最低(0.66 cm/d)。GNKH-3、GNKH-2、GNKH-1兩年的平均生長(zhǎng)速度分別為0.80，0.78和0.76 cm/d，均高于對(duì)照(圖5)。

綜合分析供試苜蓿材料在高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)的株高和生長(zhǎng)速度表現(xiàn)，GNKH-3為高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)的株高和生長(zhǎng)速度最高的苜蓿材料，GNKH-2和GNKH-1為高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)株高和生長(zhǎng)速度均較高的苜蓿材料。

圖4 株高Fig.4 Plant height

圖5 生長(zhǎng)速度Fig.5 Growth rate

(4) 分枝數(shù)和葉莖比 播種當(dāng)年，供試苜蓿材料的分枝數(shù)平均為11.0個(gè)/株，其中GNKH-2分枝數(shù)顯著高于俄羅斯雜花和金皇后(P<0.05)，為12.7個(gè)/株、GNKH-1、GNKH-3次之，分別為12.2、12.1個(gè)/株，金皇后最少(8.7個(gè)/株)。播種第2年，供試苜蓿材料的平均分枝數(shù)為14.3個(gè)/株，抗寒苜蓿材料的分枝數(shù)顯著高于播種當(dāng)年(P<0.05)，對(duì)照苜蓿材料的分枝數(shù)相對(duì)播種當(dāng)年也有所增加，其中GNKH-3、GNKH-2、GNKH-1分枝數(shù)顯著多于對(duì)照苜蓿材料(P<0.05)，分別為18.5，17.8和17.1個(gè)/株。GNKH-3、GNKH-2、GNKH-1兩年的平均分枝數(shù)分別為15.3，15.2和14.7個(gè)/株，均高于對(duì)照(圖6)。

播種當(dāng)年，供試苜蓿材料的葉莖比平均為1.11，其中GNKH-3，GNKH-2和GNKH-1葉莖比均比對(duì)照多，分別為1.15，1.14和1.13，金皇后最小(1.01)，顯著低于其他苜蓿材料(P<0.05)。播種第2年，供試苜蓿材料的葉莖比顯著低于播種當(dāng)年(P<0.05)，平均葉莖比為0.84，其中GNKH-3，GNKH-1和GNKH-2葉莖比均大于對(duì)照苜蓿材料，分別為0.89，0.88和0.86。GNKH-3，GNKH-1和GNKH-2兩年的平均葉莖比分別為1.02，1.01和1.00，均高于對(duì)照(圖7)。

圖6 分枝數(shù)Fig.6 Branching number

綜合分析供試苜蓿材料在兩個(gè)氣候區(qū)的分枝數(shù)和葉莖比表現(xiàn)，GNKH-3為高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)的分枝數(shù)和葉莖比最高的苜蓿材料，GNKH-1、GNKH-2為高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)的分枝數(shù)和葉莖比較好的苜蓿材料。

圖7 葉莖比Fig.7 Leaf to stem ratio

2.2 遺傳多樣性分析

2.2.1 DNA 檢測(cè) 分子標(biāo)記是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，在苜蓿生物技術(shù)育種和種質(zhì)資源評(píng)價(jià)中的地位不可忽視。因此，在苜蓿常規(guī)育種的基礎(chǔ)上，結(jié)合分子標(biāo)記輔助育種，進(jìn)行種質(zhì)資源評(píng)價(jià)，可為我國(guó)苜蓿種質(zhì)資源的科學(xué)利用和育種工作提供更為可靠的技術(shù)支持。簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增分子標(biāo)記技術(shù)能夠更好的檢測(cè)出生物遺傳物質(zhì)的多態(tài)性，因此，在遺傳上有遠(yuǎn)景[13]，ISSR標(biāo)記為顯性標(biāo)記，可以揭示整個(gè)基因組的一些特征，符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，具有穩(wěn)定性好，多態(tài)性高，試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快速、用時(shí)少等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)被廣泛用作研究植物種質(zhì)資源遺傳多樣性及親緣關(guān)系的有效手段[14-15]。

挑選每個(gè)材料條帶清晰、無(wú)降解、無(wú)拖尾現(xiàn)象的DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)。6 份參試材料DNA條帶清晰，點(diǎn)樣孔干凈，表明DNA片段大小比較均一，純度比較高，總DNA稍帶乳白色，在D260 nm及D280 nm處的D值為 1.80～1.88，濃度2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果比較理想，能夠達(dá)到ISSR分子標(biāo)記分析的要求(圖8)。

圖8 6份苜蓿材料的DNA檢測(cè)Fig.8 DNA testing chart of 6 alfalfa materials注：從左到右依次為M，GNKH-1，GNKH-2，GNKH-3，俄羅斯西伯利亞雜花苜蓿，金皇后苜蓿，阿爾岡金苜蓿

2.2.2 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性 用通過(guò)引物篩選試驗(yàn)得到的8條多態(tài)性好的引物，對(duì)6份苜蓿材料進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明8個(gè)引物共擴(kuò)增出87條清晰譜帶，平均每個(gè)引物能擴(kuò)增出10.9個(gè)條帶，平均多態(tài)性比率(PPB)為62.07%。不同引物擴(kuò)增出來(lái)的片段數(shù)不同，除了引物844和847的條帶較少，分別為7個(gè)和9個(gè)；引物822，845和888的條帶數(shù)均大于10個(gè)，他們的擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性最豐富，圖譜也很清晰，并且擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性比率均在80%，多態(tài)性信息含量較高。其他3個(gè)引物825，855和885的條帶數(shù)也均大于10個(gè)，他們的擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性也較豐富，圖譜也清晰。6份材料的有效等位基因數(shù)為1.494 3、基因多樣性指數(shù)為0.2676和Shannon’s信息指數(shù)為0.3842(表3)。

2.2.3 遺傳相似性系數(shù)分析 6份材料間的遺傳相似性系數(shù)在0.482 8～0.954 0，GNKH-1和GNKH-2的遺傳相似性最大，為0.954 0，GNKH-1與親本阿爾岡金的遺傳相似性為0.517 2；GNKH-3與阿爾岡金間的遺傳相似性最小，為0.482 8，說(shuō)明它們?cè)谟H緣關(guān)系上離得最遠(yuǎn)，GNKH-3與親本金皇后的遺傳相似性為0.551 7；與GNKH-3遺傳相似性最高的是俄羅斯西伯利亞雜花，為0.6667。3個(gè)抗寒苜蓿品系與對(duì)照材料的遺傳相似性都比較小，為0.482 8～0.666 7，表明抗寒苜蓿品系與對(duì)照材料的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，具有相對(duì)獨(dú)立的遺傳特性。整體分析，6份苜蓿材料間遺傳異質(zhì)性豐富(表4)。

表3 ISSR分析所用引物序列和擴(kuò)增結(jié)果

圖9 引物822，845和888 ISSR擴(kuò)增Fig.9 Amplification map of 822,845,888 ISSR注：從左到右依次為M，GNKH-1，GNKH-2和GNKH-3，俄羅斯西伯利亞雜花苜蓿，金皇后苜蓿，阿爾岡金苜蓿

2.2.4 ISSR遺傳多樣性分析 利用ISSR遺傳相似性系數(shù)矩陣，根據(jù)UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建了6份參試苜蓿材料的親緣關(guān)系系統(tǒng)樹(shù)狀圖。在遺傳距離0.78處，6份苜蓿材料被分為2個(gè)大類(lèi)，第1個(gè)大類(lèi)包括了GNKH-1，GNKH-2和GNKH-3抗寒苜蓿品系，第2大類(lèi)包括俄羅斯西伯利亞雜花，金皇后和阿爾岡金。在遺傳距離0.86處，6份苜蓿材料被分為3個(gè)大類(lèi)，第1個(gè)大類(lèi)包括了GNKH-1，GNKH-2和GNKH-3抗寒苜蓿品系，第2大類(lèi)包括俄羅斯西伯利亞雜花和金皇后，第3大類(lèi)只有阿爾岡金。在遺傳距離0.88處，6份苜蓿材料被分為4個(gè)大類(lèi)，第1個(gè)大類(lèi)包括了GNKH-1、GNKH-2、GNKH-3 抗寒苜蓿品系，第2大類(lèi)只有俄羅斯西伯利亞雜花，第3大類(lèi)只有金皇后，第4大類(lèi)只有阿爾岡金。在遺傳距離0.90處，GNKH-3單獨(dú)聚類(lèi)(圖10)。

表4 6份苜蓿材料遺傳相似系數(shù)矩陣

圖10 6份苜蓿材料基于ISSR的遺傳相似性UPGMA聚類(lèi)Fig.10 UPGMA cluster analysis based on ISSR genetic identities among 6 alfalfa materials注：1-GNKH-1，2-GNKH-2，3-GNKH-3，4-俄羅斯西伯利亞雜花苜蓿，5-金皇后苜蓿，6-阿爾岡金苜蓿

2.3 生產(chǎn)性能綜合評(píng)價(jià)

由于供試苜蓿材料的來(lái)源不同、基因型不同，其在形態(tài)特征和產(chǎn)量及品質(zhì)指標(biāo)上變化非常大，很難用一個(gè)或幾個(gè)指標(biāo)對(duì)其作出準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。因此，選擇影響生產(chǎn)性能的主要因子越冬率、干草產(chǎn)量、株高、生長(zhǎng)速度、分枝數(shù)、葉莖比，采用主成分分析法對(duì)6份苜蓿種質(zhì)材料連續(xù)兩年的生產(chǎn)性能進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

根據(jù)綜合評(píng)價(jià)函數(shù)，計(jì)算各種質(zhì)材料的綜合得分(表5)，給予供試苜蓿材料定量化的描述，綜合得分越大，表明綜合表現(xiàn)越好。高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)各苜蓿材料主成分分析綜合得分值排名為：GNKH-3>GNKH-2>GNKH-1>阿爾岡金>俄羅斯西伯利亞雜花>金皇后。GNKH-3的綜合得分最高，在高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)的適應(yīng)能力最強(qiáng)；其次是GNKH-2和GNKH-1，它們?cè)诟吆疂駶?rùn)氣候區(qū)的適應(yīng)能力較強(qiáng)；俄羅斯西伯利亞雜花和金皇后的綜合得分最低，它們?cè)诟吆疂駶?rùn)氣候區(qū)的適應(yīng)能力最弱(表5)。

3 討論

3.1 物候期及農(nóng)藝性狀差異

植株整個(gè)生育期的生長(zhǎng)是植物自身對(duì)外界生態(tài)因子適應(yīng)性的反應(yīng)。供試苜蓿材料在高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)生育期差異顯著，GNKH-3、GNKH-2返青期最早，阿爾岡金返青期最遲，比抗寒苜蓿品系晚5 d。3個(gè)抗寒苜蓿品系的物候期與暢云喜等[16]在青藏高原觀測(cè)的抗寒苜蓿新品系的物候期差別不大。

表5 在高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)供試苜蓿材料綜合得分及排名

潘正武等[17]于2009～2011年在天祝高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)和西藏“一江兩區(qū)”進(jìn)行品種比較試驗(yàn)，挑選出了適應(yīng)性較高的抗寒苜蓿品種苜蓿王等[18]。陳玲玲等[19-27]對(duì)國(guó)外苜蓿的研究表明，其物候期、株高、產(chǎn)量、分枝數(shù)、葉莖比等農(nóng)藝性狀的差異較大，這與青藏高原的高寒環(huán)境有著直接的關(guān)系，由于海拔高、氣候多變、溫差較大、降水時(shí)間不均勻，適宜苜蓿生長(zhǎng)的時(shí)間相對(duì)較短(5～8月)，致使苜蓿生長(zhǎng)緩慢，無(wú)法完成整個(gè)生育期。越冬率是最重要的一個(gè)抗寒生理指標(biāo)，其大小可以反映苜蓿品種的抗寒能力。在低溫脅迫下，植株的越冬率越高，抗寒性越強(qiáng)，越能適應(yīng)高寒氣候。試驗(yàn)所用的抗寒苜蓿品系在高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)兩年平均越冬率比對(duì)照材料高，其中，GNKH-3、GNKH-2越冬率均超過(guò)80%。高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)兩年的平均干草產(chǎn)量均是抗寒苜蓿品系顯著高于對(duì)照苜蓿材料(P<0.05)，其中GNKH-3最高，GNKH-2、GNKH-1次之。有研究表明植株高度是衡量牧草生長(zhǎng)狀況的重要指標(biāo)，與產(chǎn)量呈正相關(guān)，高植株通常有更高的相對(duì)產(chǎn)量潛力[21-22]，這與試驗(yàn)結(jié)果相一致；高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)3個(gè)抗寒苜蓿品系株高比對(duì)照的3個(gè)苜蓿材料高，他們之間差異不顯著。生長(zhǎng)速度在一定程度上反映苜蓿生長(zhǎng)能力的強(qiáng)弱[23]，高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)兩年的平均生長(zhǎng)速度為抗寒苜蓿品系高于對(duì)照苜蓿材料。牧草分枝(分蘗)數(shù)的多少在一定程度上影響其生產(chǎn)性能的高低[24]，苜蓿由于分枝數(shù)的增多，干物質(zhì)產(chǎn)量也隨之增加，高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)兩年的平均分枝數(shù)抗寒苜蓿品系多于對(duì)照苜蓿材料，因此，干草產(chǎn)量也較高。供試材料高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)兩年的平均葉莖比以GNKH-3最高，達(dá)到了1.02。

3.2 ISSR分子標(biāo)記的檢測(cè)效率及材料的遺傳多樣性分析

分子標(biāo)記己經(jīng)成為苜蓿育種中的重要輔助選擇手段。用8對(duì)引物在供試苜蓿材料中共獲得87條擴(kuò)增帶，其中54條具有多態(tài)性，引物的多態(tài)位點(diǎn)百分率62.07%。李紅等[15]用10個(gè)引物對(duì)30份苜蓿材料共擴(kuò)增出112條帶，其中59條帶是多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率的平均值為74.5%。李哲等[16-17]用4條引物對(duì)39份苜蓿材料共擴(kuò)增22條帶，其中21條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為95.45%。張穎娟等[25]用13條引物對(duì)12份苜蓿材料共擴(kuò)增出346條帶，多態(tài)性條帶332條，多態(tài)性條帶百分比為95.95%。擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，能反映材料的遺傳多樣性[26]，以此為依據(jù)，供試苜蓿種質(zhì)資源具有較豐富的遺傳多樣性。與多態(tài)位點(diǎn)百分率相比，基于Nei’s基因多樣性指數(shù)和基于條帶表型頻率的Shannon’s信息指數(shù)更能客觀地衡量材料的遺傳多樣性水平[27]，研究的Nei’s基因多樣性指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)分別為1.494 3和0.384 2，進(jìn)一步表明供試苜蓿種質(zhì)資源具有一定水平的遺傳多樣性。

3.3 供試材料間的親緣關(guān)系分析

遺傳相似系數(shù)是反映個(gè)體之間遺傳相似程度和遺傳背景一致性的度量值。3個(gè)抗寒苜蓿品系間的遺傳相似性為0.873 7～0.954 0，對(duì)照材料間的遺傳相似性為0.747 1～0.862 1，材料間的遺傳相似程度較高，親緣關(guān)系較近。此次研究親本材料阿爾岡金、隴東苜蓿、金皇后苜蓿在海拔3 050 m的青藏高原連續(xù)種植很多年，抗寒性能得到長(zhǎng)期馴化，在選育過(guò)程中移植到暖溫地帶，又移植到青藏高原高寒地區(qū)，進(jìn)行多帶馴化，抗寒能力得到提高，選育的抗寒苜蓿新品系與親本材料形成明顯的差異，GNKH-1與親本阿爾岡金的遺傳相似性為0.517 2；GNKH-3與親本金皇后的遺傳相似性為0.5517，遺傳距離增大，遺傳多樣性豐富。GNKH-3與阿爾岡金間的遺傳相似性最小，為0.482 8，說(shuō)明它們?cè)谟H緣關(guān)系上離得最遠(yuǎn)，3個(gè)抗寒苜蓿品系與對(duì)照材料的遺傳相似性都比較小，介于0.482 8～0.666 7，表明抗寒苜蓿品系與對(duì)照材料的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，具有相對(duì)獨(dú)立的遺傳特性。

根據(jù)6份供試苜蓿材料的親緣關(guān)系系統(tǒng)樹(shù)，在遺傳距離0.78處將6個(gè)苜蓿供試材料分為2類(lèi)。第1類(lèi)包含GNKH-1，GNKH-2和GNKH-3 3個(gè)抗寒苜蓿品系材料，具有高產(chǎn)、越冬率高、生產(chǎn)性能強(qiáng)的特點(diǎn)；第二類(lèi)包含俄羅斯西伯利亞雜花、金皇后、阿爾岡金苜蓿3個(gè)對(duì)照品種材料，其產(chǎn)量、越冬率、生產(chǎn)性能相對(duì)第1類(lèi)材料較低。在遺傳距離0.90處，GNKH-3單獨(dú)聚類(lèi)，為青藏高原地區(qū)抗寒苜蓿品種的選育提供了理論基礎(chǔ)。GNKH-1和GNKH-2各方面表現(xiàn)僅次于GNKH-3。因此，在常規(guī)育種實(shí)踐中，采用集團(tuán)選擇法在原有種質(zhì)資源中發(fā)掘新的、有變異的種質(zhì)資源及遺傳特性相對(duì)獨(dú)立的材料具有重要意義。

青藏高原缺乏適應(yīng)性能好、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的苜蓿品種，GNKH -3，GNKH-1和GNKH-2的選育為在東北緣區(qū)域?qū)崿F(xiàn)苜蓿的產(chǎn)業(yè)化提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，有望解決青藏高原東北緣區(qū)豆科飼草缺乏的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)高寒牧區(qū)家畜的營(yíng)養(yǎng)平衡和健康養(yǎng)殖。

4 結(jié)論

(1)高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)各苜蓿材料主成分分析綜合得分值排名為：GNKH-3>GNKH-2>GNKH-1>阿爾岡金>俄羅斯西伯利亞雜花>金皇后。GNKH-3的綜合得分最高，在高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)的適應(yīng)能力最強(qiáng)；其次是GNKH-2和GNKH-1。

(2)在遺傳距離 0.78處將6個(gè)供試苜蓿材料分為2類(lèi)。第1類(lèi)包含GNKH-1，GNKH-2和GNKH-3抗寒苜蓿品系材料，在高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)具有高產(chǎn)、越冬率高、生產(chǎn)性能強(qiáng)的特點(diǎn)；第2類(lèi)包含俄羅斯西伯利亞雜花、金皇后、阿爾岡金苜蓿3個(gè)對(duì)照品種材料，其產(chǎn)量、越冬率、生產(chǎn)性能相對(duì)第1類(lèi)材料較低。在遺傳距離0.90處，GNKH-3單獨(dú)聚類(lèi)。GNKH-3為高寒濕潤(rùn)氣候區(qū)最理想的優(yōu)良苜蓿品系，GNKH-2次之。