馬文馨，宋 謙，田新會，杜文華

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

青藏高原氣候寒冷，自然環(huán)境惡劣，植物生長季短，能夠適應(yīng)該地區(qū)生長的優(yōu)質(zhì)牧草較少，飼草缺乏是制約其畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素，引進(jìn)高產(chǎn)，穩(wěn)產(chǎn)和抗寒性強(qiáng)的牧草品種是當(dāng)前亟待解決的問題[1]。小黑麥(Triticale)是小麥屬(Triticum)和黑麥屬(Secale)經(jīng)屬間有性雜交，育成的異源多倍體新物種[2]。小黑麥不僅生物量高、營養(yǎng)品質(zhì)好，而且可以利用冬閑田種植，在冬春枯草季節(jié)為家畜提供優(yōu)質(zhì)飼料[3]。小黑麥發(fā)達(dá)的根系對土壤中水分、養(yǎng)分具有較強(qiáng)的吸收能力，因此，可在土層淺薄的坡地和貧瘠的土壤種植[4]。小黑麥耐寒性較強(qiáng)，冬季能夠抵御-20℃低溫，在2～-10℃條件下能夠正常生長，且具有較高生物量[5]。

目前，小黑麥研究多集中于遺傳多樣性[6]、遺傳圖譜構(gòu)建[7]、基因定位[8]、生產(chǎn)性能和營養(yǎng)價值[9-11]等方面，對于小黑麥抗寒性的研究較少。張舒蕓[12]測定了小黑麥和黑麥葉片的含水量，可溶性糖含量，SOD，POD，CAT等生理指標(biāo)，對黑麥和小黑麥抗寒性進(jìn)行綜合評價，結(jié)果表明，小黑麥抗寒性顯著優(yōu)于黑麥。劉杰[13]研究了小黑麥對低溫復(fù)合脅迫的抗逆性，綜合評價了小黑麥的抗逆性。以甘農(nóng)2號小黑麥和小黑麥新品系P4為試驗材料，國家草品種審定委員會指定的小黑麥區(qū)域試驗統(tǒng)一對照石大1號小黑麥(CK1)和中飼1048(CK2)作為對照，通過研究小黑麥材料在低溫脅迫處理(0℃、-10℃、-20℃、-30℃)下可溶性糖含量、脯氨酸含量和丙二醛含量，以及SOD，POD和CAT活性的變化，并利用隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評價，以評價甘農(nóng)2號小黑麥的抗寒性強(qiáng)弱，為其在青藏高原高寒牧區(qū)和西北、華北的秋閑田種植提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗設(shè)在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草試驗地。N 36°03′76″，E 103°53′24″，海拔1 600 m，年均溫7.9℃，無霜期150 d，年降水量320 mm。土壤類型為黃綿土，土壤有機(jī)質(zhì)2.3 g/kg，堿解氮90.05 mg/kg，速效磷7.36 mg/kg，速效鉀172.8 mg/kg，pH 7.35。播種時間為2016年10月26日，前茬作物為小黑麥，有灌溉條件。

1.2 試驗材料

參試材料為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院培育的甘農(nóng)2號小黑麥品種和小黑麥新品系P4。對照為國家草品種委員會審定的小黑麥品種石大1號(CK1)和中飼1048(CK2)。

1.3 試驗設(shè)計及方法

試驗采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，小區(qū)面積2 m×5 m，行距0.3 m，播種深度3～4 cm。播種量按照750萬基本苗/hm2計算而得。生長發(fā)育期間進(jìn)行正常灌水施肥，并及時防除雜草。于小黑麥出苗40 d，從其上部采集長勢良好的葉片。每個材料取樣20 g。將樣品放入速封袋，存放在裝有液氮的保鮮盒中帶回實驗室。葉片先用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗1遍，然后用吸水紙吸干。將每個小黑麥材料的葉片分為3份，3個重復(fù)，用錫箔紙包好分別放入超低溫冰箱中進(jìn)行人工模擬低溫處理。處理溫度根據(jù)甘肅省高寒牧區(qū)冬季的最低溫，分別為0℃，-10℃，-20℃，-30℃，先在不同溫度下處理8h，取出在常溫下放置8h，重復(fù)3次[14-15]。處理結(jié)束后測定葉片的生理指標(biāo)。

1.4 測定指標(biāo)與方法

可溶性糖含量用蒽酮比色法測定，游離脯氨酸含量用水合茚三酮法測定，MDA含量用硫代巴比妥酸法測定，SOD活性用氮藍(lán)四唑(NBT)法測定，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，CAT活性采用紫外吸收法測定[16-17]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。抗寒性綜合評價應(yīng)用隸屬函數(shù)法[18]。生理指標(biāo)與抗寒性正相關(guān)時，用公式：

Uij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

負(fù)相關(guān)公式：

Uij=1-(Xij-Xjmax)/(Xjmax-Xjmin)

式中：i表示某一小黑麥材料，j表示測定指標(biāo)，Xij表示某一小黑麥材料第j指標(biāo)的測定值，Xjmin表示所有小黑麥材料j指標(biāo)的最小值，Xjmax表示所有小黑麥材料j指標(biāo)的最大值，Uij表示某一小黑麥材料j指標(biāo)的抗寒隸屬函數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

F測驗表明，除小黑麥材料間可溶性糖含量、脯氨酸含量、SOD，POD和CAT活性無顯著差異外，低溫脅迫間、小黑麥材料間和低溫脅迫×小黑麥材料交互作用間的其他生理生化指標(biāo)均存在極顯著差異(P<0.01)，需要進(jìn)行多重比較(表1)。

表1 小黑麥生理指標(biāo)的方差分析

注：**表示差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)

2.1 小黑麥材料間生理生化指標(biāo)的差異

4個參試材料中，P4的MDA含量(0.36 μmol/g)顯著高于其他3個材料，甘農(nóng)2號小黑麥的MDA含量(0.29 μmol/g)和CK1、CK2無顯著差異。

2.2 低溫脅迫下小黑麥生理生化指標(biāo)的差異

隨著低溫脅迫程度的不斷增加，小黑麥葉片中的可溶性糖含量先升高后下降， -20℃時可溶性糖含量達(dá)到最大值，且顯著高于其他低溫脅迫處理。低溫脅迫處理對小黑麥葉片的脯氨酸含量有極顯著影響，-10℃時小黑麥葉片的脯氨酸含量極顯著高于其他低溫脅迫處理。隨著低溫脅迫程度加劇，小黑麥葉片的MDA含量呈現(xiàn)出不斷升高的變化趨勢，-30℃時MDA含量達(dá)到最大值，且與其他各處理間的MDA含量均有極顯著性差異。-30℃處理下小黑麥葉片的SOD活性顯著高于其他低溫處理，-10℃處理的SOD活性顯著低于0℃處理，但與-20℃處理無顯著差異。低溫脅迫下小黑麥的POD在-30℃時平均POD活性最大，且與其他各處理間的POD活性均有顯著性差異。隨著低溫脅迫加劇，小黑麥葉片的CAT活性呈現(xiàn)出不斷升高的變化趨勢，-30℃時大值，且顯著高于其他處理。其余處理間的CAT活性無顯著差異(表2)。

表2 不同低溫脅迫處理下小黑麥的生理指標(biāo)

注：同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 小黑麥材料×低溫脅迫交互作用間生理生化指標(biāo)的差異

0℃時，甘農(nóng)2號小黑麥的可溶性糖含量顯著低于P4和CK2；-10℃時，與P4和CK1無顯著差異，但顯著低于CK2；-20℃和-30℃時顯著高于CK1，但顯著低于P4和CK2。0℃和-20℃時，甘農(nóng)2號小黑麥的脯氨酸含量顯著低于P4，但顯著高于CK1和CK2對照；-10℃時其脯氨酸含量顯著低于P4，和CK1和CK2；-30℃時，顯著低于P4，與CK1和CK2對照無顯著差異。0℃時，甘農(nóng)2號小黑麥的MDA含量顯著低于P4和CK2，與CK1無顯著差異；-10℃和-20℃時，甘農(nóng)2號小黑麥的MDA含量顯著低于P4，但顯著高于CK1和CK2；-30℃時，其MDA含量顯著高于CK2，但低于P4和CK1。0℃和-10℃時，甘農(nóng)2號小黑麥的SOD活性和P4相近，顯著低于CK1和CK2；-20℃時其SOD活性顯著高于P4和CK2，但顯著低于CK1；-30℃時顯著高于CK1和CK2對照，但顯著低于P4。0℃時，甘農(nóng)2號小黑麥的POD活性顯著高于CK1和P4，但顯著低于CK2；-10℃時其POD活性顯著高于P4，但顯著低于CK1和CK2；隨著低溫脅迫加劇，其SOD活性急劇增加，-20℃時顯著高于P4和2對照，-30℃時雖然低于P4，但顯著高于2對照除-10℃處理下甘農(nóng)2號小黑麥和P4的CAT活性顯著低于CK2外，其余低溫脅迫處理下甘農(nóng)2號小黑麥和P4的CAT活性均顯著高于CK1和CK2(圖1)。

2.4 小黑麥材料間抗寒性綜合評價

利用可溶性糖含量、脯氨酸含量、MDA含量、SOD活性、POD活性、CAT活性6個抗寒性指標(biāo)對4個小黑麥材料的抗寒性進(jìn)行綜合評價，用隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評價結(jié)果為甘農(nóng)2號小黑麥>P4>CK1>CK2(表3)。

表3 不同小黑麥材料抗寒性排序

圖1 小黑麥材料×低溫脅迫交互作用間小黑麥的生理生化指標(biāo)Fig.1 The physiochemical indexes of the interaction between triticale materials and low temperature stress

3 討論

3.1 小黑麥材料間生理生化指標(biāo)的差異

植物在逆境條件下會產(chǎn)生活性氧代謝，破壞植物的組織與功能[19]。隨著低溫脅迫程度加劇，抗寒性強(qiáng)的材料能積累更多的可溶性糖和脯氨酸[20]。研究中，隨著低溫脅迫的加劇，小黑麥的可溶性糖含量和脯氨酸含量先增高后降低，CK2的可溶性糖含量最高，P4的脯氨酸含量最高。MDA是植物膜質(zhì)過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，對細(xì)胞膜有毒害作用，低溫脅迫程度越大，植物積累的MDA越多[21]。植物細(xì)胞內(nèi)的保護(hù)酶SOD，POD和CAT可清除植物細(xì)胞產(chǎn)生的自由基，使植物細(xì)胞的膜系統(tǒng)不被損傷[22]。逆境脅迫下SOD與CAT的變化趨勢相似，與抗寒性呈正相關(guān)；POD活性變化較復(fù)雜，有報道寒冷條件下抗寒品種葉片 POD活性上升或維持較高水平，并隨低溫脅迫程度增強(qiáng)而增加。抗寒性越強(qiáng)的植物葉片中SOD，POD和CAT活性越大[22-23]。4個參試小黑麥材料的其他指標(biāo)無顯著差異，只有P4的MDA含量顯著高于其他3個材料，說明P4的抗寒性最強(qiáng)。

3.2 不同低溫脅迫下小黑麥生理生化指標(biāo)的差異

隨著低溫脅迫加劇，小黑麥葉片的可溶性糖和脯氨酸含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，-20℃時可溶性糖最高，-10℃時脯氨酸含量最高，是因為一定程度的低溫脅迫有利于提高植物的可溶性糖和脯氨酸含量。但隨著脅迫程度加劇植物葉片的組織細(xì)胞受到破壞，小黑麥葉片的可溶性糖和脯氨酸含量降低。這與張基德等[24]的研究結(jié)果一致。植物受到低溫脅迫時，葉片的 MDA含量和POD、SOD、CAT活性會持續(xù)上升或維持較高水平以降低傷害[25-26]，試驗得出相似結(jié)論，即隨著低溫脅迫程度增強(qiáng)，參試小黑麥材料的MDA含量和POD、SOD、CAT活性呈持續(xù)上升的趨勢。

3.3 小黑麥材料×低溫脅迫交互作用間生理生化指標(biāo)的差異

可溶性糖通過糖代謝來增加細(xì)胞液濃度，增加細(xì)胞中的非結(jié)冰水，保護(hù)植物受到逆境脅迫，抗寒性強(qiáng)的植物可溶性糖含量高[27]。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，在逆境脅迫下隨著低溫脅迫的加劇，細(xì)胞的過氧化物會增多，植物體內(nèi)的MDA含量會增高[28]。SOD，POD和CAT作為細(xì)胞的酶保護(hù)物質(zhì)，共同作用清除植物因逆境產(chǎn)生的過多的O2-，防止膜脂過氧化，保護(hù)植物細(xì)胞受到低溫脅迫帶來的傷害[29]。試驗的參試小黑麥材料受到低溫脅迫時，表現(xiàn)各異。0℃和-10℃時CK2的可溶性糖、脯氨酸和MDA含量，以及POD，SOD和CAT活性顯著高于甘農(nóng)2號小黑麥和小黑麥品系P4，但隨著脅迫程度加劇，其含量顯著低于2材料，說明其難以抵抗-10℃以下的低溫，抗寒性較甘農(nóng)2號小黑麥和小黑麥品系P4弱；從總體分析，CK1的可溶性糖、脯氨酸和MDA含量，以及POD，SOD和CAT活性均低于CK2，說明其抗寒性比CK2弱，這與綜合評價的結(jié)果一致(表3)。對于甘農(nóng)2號小黑麥和小黑麥品系P4分析，雖然0℃和-10℃時，和抗寒相關(guān)的生理生化指標(biāo)與CK1和CK2相近或低于對照，但隨著低溫脅迫程度加劇，各指標(biāo)迅速上升，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗寒性[30-31]。分析圖1結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，0℃和-10℃時CK1和CK2的相關(guān)生理生化指標(biāo)值較高，甘農(nóng)2號小黑麥和小黑麥品系P4則較低，溫度低于-10℃時則相反，因此，4份參試材料在不同低溫脅迫下各生理生化指標(biāo)平均值的差異就縮小，小黑麥材料間除MDA含量外其他生理生化指標(biāo)就無顯著差異(表1)。這一結(jié)果進(jìn)一步說明了小黑麥材料和低溫脅迫天數(shù)交互作用分析的重要性。由于4份參試小黑麥材料對不同生理生化指標(biāo)的反應(yīng)各異，為準(zhǔn)確評價其抗寒性強(qiáng)弱。

4 結(jié)論

從滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、酶保護(hù)物質(zhì)兩方面相應(yīng)指標(biāo)的變化，基于隸屬函數(shù)綜合評價結(jié)果表明，參試小黑麥材料的抗寒性強(qiáng)弱依次為甘農(nóng)2號小黑麥>P4>CK1>CK2，甘農(nóng)2號小黑麥和小黑麥新品系P4的抗寒性較強(qiáng)，適宜于甘肅省高寒牧區(qū)及其他氣候相似區(qū)種植，該研究將為高寒牧區(qū)飼草品種的選擇奠定基礎(chǔ)。