紀(jì)雪華　秦小潔　齊衛(wèi)衛(wèi)

[摘要] 目的 探討胃癌組織中軸蛋白（Axin）、結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MACC1）蛋白的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。 方法 收集山東省青島市第八人民醫(yī)院2015年1月～2017年12月胃癌患者手術(shù)標(biāo)本150例胃癌組織，隨機(jī)抽取其中70例為癌旁組織，利用免疫組織化法檢測癌及癌旁組織中Axin、MACC1的表達(dá);分析Axin、MACC1表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系及兩者的相關(guān)性。 結(jié)果 胃癌組織中Axin陽性表達(dá)率低于癌旁組織，胃癌組織中MACC1陽性表達(dá)率高于癌旁組織，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。Axin、MACC1在胃癌組織中的表達(dá)均與胃癌的浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及Duke分期有關(guān)（P < 0.01），且胃癌組織中Axin表達(dá)與MACC1呈負(fù)相關(guān)（P < 0.05）。 結(jié)論 Axin的表達(dá)降低及MACC1的表達(dá)升高都與胃癌發(fā)展相關(guān)，早期檢測兩項指標(biāo)可為預(yù)測胃癌進(jìn)展提供重要依據(jù);Axin與MACC1的表達(dá)負(fù)相關(guān)，兩者可能協(xié)同導(dǎo)致腫瘤的低分化、高侵襲、高轉(zhuǎn)移性，提示兩者可能成為胃癌治療的潛在靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 胃癌;軸蛋白;結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1;臨床病理參數(shù)

[中圖分類號] R735.2 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）05（b）-0092-04

[Abstract] Objective To investigate the expression of Axin and metastasis-associated gene 1 in colon cancer in gastric cancer tissues and their correlation with clinicopathological parameters. Methods From January 2015 to December 2017， 150 surgical specimens of patients with gastric cancer in the Qingdao Eighth People′s Hospital， Shandong Province were collected as the gastric cancer tissue and randomly pick one of them 70 cases as the paracancer tissues. The expression of Axin and MACC1 in the cancer and paracancer tissues were detected by immunohistochemistry， to analyze the relationship between the expression of Axin and MACC1 and the clinicopathological parameters of gastric cancer patients and their correlation. Results The positive expression rate of Axin in the gastric cancer tissue was lower than that in the paracancerous tissue， and the positive expression rate of MACC1 in the gastric cancer tissue was higher than that in the paracancerous tissue， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. The expressions of Axin and MACC1 in gastric cancer tissues were related to the invasion depth， differentiation degree， lymph node metastasis and Duke stage of gastric cancer （P < 0.01）， and the expression of Axin in gastric cancer tissues was negatively correlated with MACC1 （P < 0.05）. Conclusion The decreased expression of Axin and the increased expression of MACC1 are both related to the development of gastric cancer. The early detection of these two indicators can provide an important basis for the prediction of the progress of gastric cancer. The expression of Axin is negatively correlated with MACC1， which may synergistically lead to low differentiation， high invasion and high metastasis of the tumor， suggesting that Axin and MACC1 may be potential targets for the treatment of gastric cancer.

[Key words] Gastric cancer; Axin; Metastasis-associated gene 1 in colon cancer; Clinicopathological parameters

胃癌（gastric cancer，GC）為上消化道最常見的惡性腫瘤之一，是全球第三大導(dǎo)致癌癥死亡的原因[1]。預(yù)后差，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移為胃癌治療中的棘手問題，目前尚無真正有效的靶向治療[2]，因此，研究胃癌的發(fā)病機(jī)制，尋找早期診斷分子標(biāo)志物及潛在新治療靶標(biāo)為目前亟需解決的問題。軸蛋白（Axin）為一種抑癌基因，目前研究[3-4]表明，其主要通過負(fù)調(diào)控Wnt信號通路抑制腫瘤，而反常表達(dá)的Axin使Wnt信號通路失去調(diào)控，細(xì)胞增殖、分化、遷移失衡，從而導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，Axin廣泛表達(dá)在心、肝、腦、肺、腎等正常組織中，而在腦膜瘤、乳腺癌、腎透明細(xì)胞癌、卵巢癌等多種腫瘤中表達(dá)降低或缺失。已有研究[5]發(fā)現(xiàn)Axin的表達(dá)與卵巢癌的臨床分期、組織學(xué)分級及淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1（MACC1）為新發(fā)現(xiàn)的癌基因，首次在人復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌的基因測序中發(fā)現(xiàn)，除結(jié)腸癌外，在胃癌、肝癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，它可以通過調(diào)控肝細(xì)胞生長因子/肝細(xì)胞生長因子受體（HGF/c-MET）通路促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化、遷移，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移[6]。研究[7]表明，在大腸癌患者的血液檢測中發(fā)現(xiàn)，有轉(zhuǎn)移的患者M(jìn)ACC1水平更高。目前，關(guān)于Axin和MACC1在胃癌中的作用研究尚少，尤其是兩個基因相關(guān)性的研究，本研究采用免疫組化的方法檢測Axin和MACC1在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)，分析其表達(dá)的相關(guān)性，以及其與臨床病理參數(shù)的聯(lián)系，擬為尋找胃癌早期診斷的分子標(biāo)志物、胃癌治療的潛在靶標(biāo)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集山東省青島市第八人民醫(yī)院2015年1月～2017年12月150例胃癌組織，并從中隨機(jī)抽取70例癌旁組織，其為手術(shù)切除標(biāo)本中距離胃癌組織>5.0 cm的癌旁組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲;診斷為原發(fā)性胃癌;術(shù)前未行放療、化療或其他抗癌治療;臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他臟器原發(fā)腫瘤或危及生命的其他器質(zhì)性病變。胃癌組織150例，男81例，女69例;年齡35～69歲，平均（64.29±11.10）歲;腫瘤直徑：<5 cm 82例，≥5 cm 68例;腫瘤位置：近端胃52例，胃體56例，遠(yuǎn)端胃42例;分化程度：高分化18例，中分化69例，低分化63例;浸潤深度：黏膜及黏膜下層15例，黏膜層16例，黏膜外層119例;淋巴轉(zhuǎn)移：有淋巴轉(zhuǎn)移96例，無淋巴轉(zhuǎn)移54例;Duke分期Ⅰ～Ⅱ期83例，Ⅲ～Ⅳ期67例。癌旁組織70例，男38例，女32例;年齡36～68歲，平均（64.13±12.09）歲。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)并已獲得患者知情同意書。

1.2 試劑材料

兔抗人Axin多克隆抗體購于英國Abcam公司[Anti-Axin抗體（ab133221）]，兔抗人MACC1多克隆抗體購于英國Abcam公司[Anti-MACC1抗體（ab106579）]，羊血清購于碧云天公司，磷酸像沖鹽（PBS）粉劑購于巨能世紀(jì)信息科技（蘇州）有限公司，DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒（生產(chǎn)批號：20141105）購于碧云天公司，加拿大中性樹膠購于Solarbio公司。

1.3 免疫組化方法

所有蠟塊均來源于病理科，為3 μm/片連續(xù)切片，免疫組化染色步驟：經(jīng)二甲苯脫蠟，100%、95%、90%、85%梯度酒精及雙蒸水中浸泡水化，在0.01 mol/L，pH 6.0枸櫞酸鈉溶液中高溫高壓抗原修復(fù)3 min，羊血清封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，Axin一抗?jié)舛葹? μg/mL，MACC1一抗?jié)舛葹?.5 μg/mL，PBS洗滌3次，每次5 min，滴加二抗（B液∶C液=50∶1），DAB法染色。

免疫組化陽性結(jié)果由2位病理科醫(yī)生進(jìn)行評價，顯微鏡下隨機(jī)觀察10個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，以細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，根據(jù)染色范圍和強(qiáng)度對切片進(jìn)行評價。以胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為Axin、MACC1陽性，根據(jù)陽性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評價：陽性細(xì)胞百分比0～<5%記0分，5%～<25%記1分，25%～<50%記2分，50%～100%記3分;細(xì)胞無著色記0分，淺棕黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分;2項得分相加，0～1分為蛋白表達(dá)陰性，≥2分為蛋白表達(dá)陽性[8]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，兩基因表達(dá)相關(guān)性采用Spearman分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Axin和MACC1在胃癌組織及癌旁組織中的陽性表達(dá)

胃癌組織中Axin的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，胃癌組織中MACC1的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.001）。見表1。Spearman分析發(fā)現(xiàn)，Axin的表達(dá)與MACC1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r = -0.723，P < 0.05）。

2.2 胃癌組織中Axin、MACC1的陽性表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Axin在癌中陽性表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小及位置無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），與分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke分期相關(guān)，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）;MACC1在癌中陽性表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小及位置無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），而與組織分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Duke分期均相關(guān)，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（均P < 0.01）。見表2。

3 討論

胃癌為上消化道最常見的惡性腫瘤之一，位列全球癌癥死亡原因的第三位。預(yù)后差，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移為胃癌治療中的棘手問題，5年生存率僅為20%～30%[9]?，F(xiàn)有的治療手段中，手術(shù)治療為主要方式，而晚期患者已失去手術(shù)機(jī)會，化療后平均生存期僅為10個月左右，目前尚無真正有效的靶向治療，由此可見，胃癌已成為危害民眾健康的重要因素。因此，從信號通路的角度來研究胃癌的發(fā)病機(jī)制及診療的靶標(biāo)將為胃癌的治療鋪墊良好的基礎(chǔ)。本研究從Wnt信號通路中的一個重要抑制劑Axin，以及MACC1兩個新基因出發(fā)，研究兩者的表達(dá)與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，試圖尋找胃癌早期診斷的分子標(biāo)志及可能的治療靶點(diǎn)。

Axin為一種抑癌基因，位于人常染色體16p13.3，編碼分子量約96 kDa的多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)[10]，它首先于1997年由學(xué)者從稱為Fused的小鼠突變株中得到，它可表達(dá)于胞膜、胞質(zhì)及胞核中，在胚胎發(fā)育中起重要作用，Axin的表達(dá)失控在多種惡性腫瘤中被報道，如腦膜瘤、乳腺癌、腎透明細(xì)胞癌等，在這些惡性腫瘤中，Axin的表達(dá)降低，不能發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用[11]。近年來研究[12]顯示，Axin含有多個固定保守的結(jié)構(gòu)域，其中含有幾個最重要的高度保守的功能結(jié)構(gòu)域的磷酸化位點(diǎn)，其能與Wnt信號通路中許多分子相互結(jié)合來調(diào)節(jié)該信號通路中的核心分β-連環(huán)蛋白（β-catenin），Wnt信號通路被認(rèn)為是多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵通路，其中Wnt/β-catenin為最經(jīng)典的信號通路，直接影響細(xì)胞的增殖分化，失調(diào)的Wnt信號通路導(dǎo)致細(xì)胞正常的分化、增殖失控，從而形成腫瘤。正常的Wnt信號通路中，β-catenin可被降解，其中，Axin為降解過程中的關(guān)鍵分子，Axin通過與腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、酪蛋白激酶1（casein kinase 1，CK1）、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK3β）等蛋白結(jié)合，形成β-catenin降解復(fù)合物，磷酸化β-catenin，從而負(fù)性調(diào)節(jié)Wnt信號通路[13]。Axin也可通過激活應(yīng)激活化蛋白激酶/氨基末端激酶（SAPK/JNK）通路及激活野生型p53，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而抑制腫瘤的發(fā)生[14]。MACC1為Stein等[6]在人復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌的基因測序中發(fā)現(xiàn)的癌基因，定位于人染色體7p21.1，編碼一個由852個氨基酸殘基組成的結(jié)合蛋白，其在腫瘤的發(fā)生中起重要作用。已有研究[15-16]表明，MACC1在胃癌、肝癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤中高表達(dá)。HGF/c-MET通路為與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要通路，正常的細(xì)胞中，c-MET呈低表達(dá)或不表達(dá)狀態(tài)，在腫瘤細(xì)胞中，c-MET高表達(dá)，持續(xù)激活HGF/c-MET通路，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[17]?，F(xiàn)有研究顯示，MACC1可以調(diào)控c-MET的啟動子從而促進(jìn)該基因的表達(dá)，進(jìn)一步激活HGF/c-MET，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生惡變、侵襲和轉(zhuǎn)移[18-19]。MACC1也可通過激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶/β連環(huán)蛋白（Akt/β-cantenin）通路來促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中Axin的陽性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，而MACC1的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，且其與組織分化程度、浸潤深度、Duke分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均相關(guān)，提示Axin、MACC1可能為胃癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵基因，Axin的低表達(dá)和MACC1的高表達(dá)導(dǎo)致了胃癌的低分化和高侵襲、高轉(zhuǎn)移性，促進(jìn)了胃癌的發(fā)生發(fā)展。Axin和MACC1的表達(dá)相關(guān)性鮮有研究，本研究通過Spearman分析，發(fā)現(xiàn)在胃癌中Axin的表達(dá)與MACC1的表達(dá)負(fù)相關(guān)，Axin的表達(dá)缺失或下調(diào)失去了對腫瘤的抑制作用，而MACC1的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，既往研究[21]發(fā)現(xiàn)，Axin和MACC1都可作用于β-cantenin，Axin表達(dá)下調(diào)及MACC1的表達(dá)上調(diào)都可促進(jìn)β-cantenin的異常表達(dá)，兩者可能共同參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。

綜上所述，本研究通過探究Axin及MACC1在胃癌中的表達(dá)情況，分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系及兩者相關(guān)性，提示早期檢測兩項指標(biāo)可為預(yù)測胃癌進(jìn)展提供重要線索，但兩個基因的具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實(shí)，有望為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2018-10-23 ?本文編輯：封 ? 華）