鄭 煜，常慶瑞，王婷婷，楊 景

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌712100)

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用吸收和傳遞光能的主要物質(zhì)，其含量與植被的光合能力、發(fā)育階段有較好的相關(guān)性[1]，是表征作物生長情況、病蟲害脅迫以及營養(yǎng)狀況的重要指標(biāo)。傳統(tǒng)的葉綠素含量獲取方法包括分光光度計(jì)法、高效液相色譜法、原子吸收法等[2]，這些方法提取葉綠素的過程復(fù)雜繁瑣，容易導(dǎo)致葉綠素含量損失[3-4]。目前，常采用SPAD值來表征葉綠素的相對(duì)含量，國內(nèi)外一些研究已證明，SPAD值能夠被用來預(yù)測(cè)水稻、玉米、小麥等作物的葉綠素含量[5-10]，具有快速、高效、無損檢測(cè)的特點(diǎn)。

近年來，越來越多的學(xué)者將高光譜技術(shù)應(yīng)用于葉綠素含量的測(cè)定中[11-15]。便攜式高光譜儀可從光譜反射率的微弱差異對(duì)植物生長變化進(jìn)行定量分析，從而實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)估算植物葉綠素含量[16]。研究表明，不同葉片葉綠素含量的反射光譜差異，主要體現(xiàn)在葉綠素強(qiáng)烈吸收的藍(lán)、紅光區(qū)和水吸收的短波紅外區(qū)[17]。因此，對(duì)反射光譜吸收谷與吸收峰進(jìn)行光譜吸收特征分析，從中可以獲得更多與植物葉綠素相關(guān)的信息。近年來已有研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)統(tǒng)去除法能夠較好地估算作物養(yǎng)分含量[18-25]，該方法能夠壓抑背景光譜，消除葉肉結(jié)構(gòu)影響，擴(kuò)大弱吸收特征信息[26]，目前采用該方法對(duì)葉綠素含量進(jìn)行估算及對(duì)藍(lán)光和紅光吸收谷進(jìn)行探討的報(bào)道還較少。所以本研究探討了油菜不同生育期400～1 000 nm連續(xù)統(tǒng)去除光譜與SPAD值的相關(guān)性，篩選出特征波段和光譜特征參數(shù)構(gòu)建偏最小二乘回歸模型，以期為實(shí)現(xiàn)油菜葉片葉綠素含量的高效、無損、大面積監(jiān)測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究地位于陜西楊凌雜交油菜研究中心，地理位置108°02′51″E，34°18′11″N，地處關(guān)中平原中部，屬東亞暖溫帶半濕潤半干旱氣候區(qū)，年均氣溫12.9 ℃，年均降水量635.1 mm。試驗(yàn)共設(shè)8個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積4 m×5 m=20 m2。2016年9月10日播種，一次施足底肥(N240 kg/hm2，P2O5120 kg/hm2，K2O 180 kg/hm2)，并進(jìn)行田間標(biāo)準(zhǔn)化管理。采樣時(shí)，每個(gè)小區(qū)選擇4株作為樣本，每個(gè)樣本分上、中、下3層采集葉片，將葉片立即裝入塑封袋保鮮運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，及時(shí)進(jìn)行葉片SPAD及其對(duì)應(yīng)光譜測(cè)定。選取苗期(3月26日)、蕾薹期(4月13日)、開花期(4月27日)及角果期(5月12日)的油菜葉片數(shù)據(jù)，分生育期建立模型。將油菜葉片SPAD值由小到大順序排列，將樣本按照2∶1的比例構(gòu)建估算模型和驗(yàn)證模型，其中估算模型中樣本有64個(gè)，驗(yàn)證模型中樣本有32個(gè)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 葉片葉綠素SPAD值測(cè)定 采用SPAD-502型手持式葉綠素儀測(cè)定油菜葉片SPAD值，每層選3片葉子進(jìn)行測(cè)定，每片葉子選取不同部位(避開葉脈)均勻測(cè)定10個(gè)SPAD值，求取平均值作為該片葉子的SPAD值，最后求取每層3片葉子的SPAD平均值作為該層葉片最終SPAD值。

1.2.2 葉片光譜值測(cè)定 使用美國SVC HR-1024i非成像波譜儀測(cè)量油菜葉片光譜。利用儀器自帶光源型手持葉片光譜探測(cè)器測(cè)定葉片光譜，光源為內(nèi)置鹵鎢燈，每次光譜測(cè)定前進(jìn)行參考板校正。測(cè)定前對(duì)需要測(cè)定的葉片進(jìn)行排序與編號(hào)，并與葉綠素SPAD測(cè)定值相對(duì)應(yīng)。每層選3片葉子進(jìn)行測(cè)定，在每片葉子不同部位均勻選取10條光譜，取其平均值作為該葉片光譜反射率。計(jì)算每層3片葉子的平均值，作為該樣點(diǎn)該層的最終光譜值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

非成像波譜儀測(cè)定可獲取350～2 500 nm波段內(nèi)1 024個(gè)波段的高光譜數(shù)據(jù)，光譜分辨率分別為3.5，9.5和6.5 nm。由于葉綠素強(qiáng)烈吸收主要集中在藍(lán)光、紅光區(qū)及“紅邊”波段范圍[26]，因此選取400～1 000 nm波段葉片光譜，并將其重采樣為1 nm。對(duì)重采樣后的光譜進(jìn)行連續(xù)統(tǒng)去除處理，處理后光譜曲線吸收谷與反射峰特征明顯，從而可以更好地進(jìn)行光譜吸收特征分析和光譜特征波段選擇[25]。光譜反射率的計(jì)算式為：

Scr=R/Rc。

(1)

式中：Scr為連續(xù)統(tǒng)去除光譜反射率，R為原始光譜反射率，Rc為連續(xù)統(tǒng)線反射率。

連續(xù)統(tǒng)去除后的歸一化光譜的特點(diǎn)是起、止點(diǎn)反射率均為1，其間的點(diǎn)位于(0,1)之間[22]，反射率大小可以體現(xiàn)光譜吸收的強(qiáng)弱。

采用決定系數(shù)(R2)、均方根誤差(RMSE)和相對(duì)誤差(RE)來驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)精度，將樣本實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值進(jìn)行回歸擬合，計(jì)算公式如下：

(2)

(3)

1.4 高光譜參數(shù)選取與模型構(gòu)建

為建立不同高光譜參數(shù)的油菜葉片SPAD值預(yù)測(cè)模型，本研究首先選取原始光譜、連續(xù)統(tǒng)去除光譜在400～1 000 nm與SPAD值相關(guān)性最優(yōu)的波段進(jìn)行建模，評(píng)價(jià)不同模型的預(yù)測(cè)精度；之后提取基于連續(xù)統(tǒng)去除的光譜吸收特征參數(shù)，根據(jù)前人研究結(jié)果[25]，提取的主要參數(shù)有最大吸收深度(H)、吸收波段波長(P)、吸收峰總面積(A)、吸收峰左面積(LA)、吸收峰右面積(RA)、對(duì)稱度(S)和面積歸一化最大吸收深度(NMAD)，構(gòu)建基于連續(xù)統(tǒng)去除的光譜吸收特征參數(shù)的SPAD估算模型，并對(duì)模型精度進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生育期油菜葉片原始光譜和連續(xù)統(tǒng)去除光譜特性

表1列出了不同生育期油菜葉片樣本數(shù)以及SPAD值的最大值、最小值、平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表1可知，從苗期、蕾薹期、開花期到角果期，SPAD平均值逐漸降低，標(biāo)準(zhǔn)偏差均較小。

表1 不同生育期油菜葉片樣本的SPAD值Table 1 SPAD values for rape leaves at different growth periods

鑒于不同生育期油菜葉片原始光譜曲線變化趨勢(shì)一致，故以蕾薹期油菜為例進(jìn)行分析，詳見圖1。

圖1 蕾薹期油菜葉片光譜特性曲線Fig.1 Spectral characteristic curve at bud stage of oilseed rape

由圖1可知，在原始光譜中綠光吸收波段550 nm附近，由于葉綠素反射而形成明顯反射峰；而在藍(lán)光450 nm附近及紅光670 nm附近，葉綠素的吸收產(chǎn)生了2個(gè)較弱的色素吸收帶；在近紅外波段(700～750 nm)反射率急劇上升形成陡坡，之后由于葉片復(fù)雜的葉腔細(xì)胞結(jié)構(gòu)多次散射，在750～1 000 nm波段形成了植物光譜獨(dú)特的近紅外高反射平臺(tái)。對(duì)400～1 000 nm波段進(jìn)行連續(xù)統(tǒng)去除后，在可見光范圍(400～770 nm)光譜曲線中的2個(gè)吸收谷特征被放大，綠光范圍反射峰更加明顯，紅邊斜率增大，這些變化有利于對(duì)光譜進(jìn)行特征波段、光譜吸收特征參數(shù)的提取，也有利于對(duì)各生育期不同SPAD值的油菜葉片光譜差異進(jìn)行更為細(xì)致的分析研究。

分別對(duì)不同生育期油菜葉片可見光(400～770 nm)范圍光譜進(jìn)行連續(xù)統(tǒng)去除處理，結(jié)果見圖2。由圖2可知，由于在藍(lán)光(400～550 nm)和紅光(550～770 nm)范圍葉綠素表現(xiàn)出較強(qiáng)的吸收能力，在綠光(550 nm)附近表現(xiàn)出較強(qiáng)的反射能力，因此光譜反射率在藍(lán)光波段500 nm附近和紅光波段670 nm附近出現(xiàn)吸收谷，反射率均較低；在綠光波段550 nm附近形成反射峰，反射率均較高。在可見光范圍，隨著生育期的推進(jìn)，連續(xù)統(tǒng)去除光譜最大吸收深度以及吸收谷面積呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。

由于葉綠素吸收和利用的光能主要集中在可見光區(qū)域，因此可見光區(qū)域的光譜對(duì)葉綠素含量的變化非常敏感，連續(xù)統(tǒng)去除可以增強(qiáng)植物光譜曲線差異。隨著油菜的生長發(fā)育，其葉片葉綠素及其他組分也發(fā)生變化，如水分含量降低、細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化、花青素含量升高等，因此，對(duì)應(yīng)的光譜反射率也會(huì)有變化。由圖2可知，在400～550與550～770 nm波段的吸收谷中，光譜反射率從蕾薹期、開花期、苗期到角果期依次遞增。根據(jù)前人研究結(jié)果可知[1]，葉綠素含量越高，光合作用能力越強(qiáng)，作物對(duì)光能的吸收和利用越多，因此在蕾薹期和開花期，由于葉片葉綠素含量較高，光譜反射率隨葉綠素的增大而降低。紅光范圍內(nèi)，在500～670 nm波段，反射峰反射率由大到小依次為角果期、苗期、開花期和蕾薹期；在670～770 nm波段，由于葉綠素對(duì)近紅外光表現(xiàn)出強(qiáng)反射，光譜反射率急劇上升。由此可知，葉片葉綠素含量與可見光范圍內(nèi)的光譜有著密切的聯(lián)系。

2.2 基于敏感波段的不同生育期油菜葉片SPAD估算

2.2.1 基于原始光譜的SPAD估算模型 圖3是不同生育期油菜葉片原始光譜與SPAD值之間的相關(guān)關(guān)系。

圖2 不同生育期油菜葉片的連續(xù)統(tǒng)去除光譜曲線
Fig.2 Continuum removal spectral curves at different growth stages of rape leaves

圖3 不同生育期油菜葉片原始光譜與SPAD值的相關(guān)系數(shù)
Fig.3 Correlation between original spectrum and SPAD values of rape leaves at different growth stages

由圖3可知，在400～500 nm波段，開花期油菜葉片原始光譜與SPAD相關(guān)性通過F=0.05顯著性檢驗(yàn)，其他生育期兩者相關(guān)性不顯著；在綠光范圍(500～600 nm)，各個(gè)生育期油菜葉片原始光譜與SPAD值呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)在-0.635～-0.459，且均通過F=0.01顯著性檢驗(yàn)，說明油菜葉片色素含量越高，吸收作用越強(qiáng)，光譜反射率越低，其中蕾薹期原始光譜與SPAD值相關(guān)性最強(qiáng)，角果期原始光譜與SPAD值相關(guān)性最小，與葉綠素含量高低密切相關(guān)；在700～720 nm波段，4個(gè)生育期原始光譜與SPAD值相關(guān)性均通過F=0.01顯著性檢驗(yàn)；在750～1 000 nm波段，蕾薹期和開花期原始光譜與SPAD值相關(guān)性均通過F=0.05顯著性檢驗(yàn)，呈顯著正相關(guān)。

根據(jù)原始光譜與SPAD值的相關(guān)關(guān)系，選取各個(gè)生育期相關(guān)系數(shù)最大波段的光譜反射率建立普通回歸模型，從中選取擬合度高、誤差小的模型作為最佳估算模型，結(jié)果見表2。

表2 基于原始光譜特征波段的不同生育期油菜葉片SPAD值估算模型及其精度Table 2 SPAD estimation models and accuracies for rape leaves at different growth stages based on original spectral characteristic band

注：R539是539 nm處的反射率，其他同此；x表示原始光譜特征波段反射率，y表示SPAD值。

Note:R539is reflectance at 539 nm and others are the same；xrepresents the original spectral characteristic band reflectance andyindicates SPAD value.

表2顯示，在4個(gè)生育期中，估算模型與驗(yàn)證模型的決定系數(shù)R2均通過顯著性檢驗(yàn)，其中蕾薹期估算模型與驗(yàn)證模型的R2均最高。

2.2.2 基于連續(xù)統(tǒng)去除光譜的SPAD估算模型 由圖4可知，當(dāng)波長為400～770 nm時(shí)，SPAD與連續(xù)統(tǒng)去除光譜之間的相關(guān)系數(shù)相較于原始光譜有所提高。550和700～750 nm波段SPAD與連續(xù)統(tǒng)去除光譜之間的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值均在0.6以上，選取相關(guān)性最大的波段，作為各個(gè)生育期連續(xù)統(tǒng)去除光譜的特征波段，建立普通回歸模型，結(jié)果見表3。由表3可知，相較于原始光譜，利用連續(xù)統(tǒng)去除特征波段光譜與SPAD構(gòu)建的估算模型和驗(yàn)證模型，其決定系數(shù)R2均增大。

2.3 基于光譜吸收特征參數(shù)的不同生育期油菜葉片SPAD估算

在波長400～550和550～770 nm光譜曲線中，提取不同生育期油菜連續(xù)統(tǒng)去除光譜的吸收特征參數(shù)，計(jì)算其與SPAD值的相關(guān)性，結(jié)果如表4所示。

圖4 不同生育期油菜連續(xù)統(tǒng)去除光譜與葉片SPAD值的相關(guān)系數(shù)Fig.4 Correlation coefficients of oilseed rape continuum removal spectrum and leaf SPAD value at different growth stages

表3 基于連續(xù)統(tǒng)去除特征波段的不同生育期油菜葉片SPAD值估算模型及其精度Table 3 SPAD values estimation model and accuracy for rape leaves at different growth stages based on continuum removal characteristic band

注：R734是734 nm處的反射率，其他同此；x表示連續(xù)統(tǒng)去除特征波段反射率，y表示SPAD值。

Note:R734is reflectance at 734 nm and others are the same；xrepresents the continuum removal characteristic band reflectance andyindicates SPAD value.

表4 不同生育期油菜葉片連續(xù)統(tǒng)去除光譜吸收特征參數(shù)與SPAD值的相關(guān)性(n=96)Table 4 Correlation of in continuum removal spectral absorption characteristic parameters and SPAD values for rape leaves at different growth stages

注：*表示通過P<0.05顯著性水平檢驗(yàn)，**表示通過P<0.01顯著性水平檢驗(yàn)。

Note:*indicates significance at theP<0.05 level,and ** indicates significance at theP<0.01 level.

油菜苗期，在400～770 nm波段，參數(shù)A、LA和RA均通過P<0.01顯著性檢驗(yàn)；在550～770 nm波段，NMAD與SPAD值的相關(guān)性最佳，相關(guān)系數(shù)為-0.588。油菜蕾薹期，在400～770 nm波段，參數(shù)P、A、LA、RA和NMAD均通過P<0.01顯著性檢驗(yàn)，其中在550～770 nm波段，NMAD與SPAD值的相關(guān)性最佳，相關(guān)系數(shù)為-0.693。油菜開花期，在400～770 nm波段，參數(shù)H、P和NMAD均通過P<0.01顯著性檢驗(yàn)，其中在400～550 nm波段，RA與SPAD值的相關(guān)性最佳，相關(guān)系數(shù)為-0.749。油菜角果期，在400～770 nm波段，只有RA通過P<0.01顯著性檢驗(yàn);在550～770 nm波段,NMAD與SPAD值的相關(guān)性最佳，相關(guān)系數(shù)為-0.586。

從表4中選取與SPAD值相關(guān)性最好的吸收特征參數(shù)作為自變量構(gòu)建油菜葉片SPAD普通回歸模型，結(jié)果如表5所示。表5顯示，運(yùn)用連續(xù)統(tǒng)去除光譜吸收特征參數(shù)構(gòu)建不同生育期油菜葉片SPAD估算模型，結(jié)果均較原始光譜明顯提高了估算精度。

表5 基于連續(xù)統(tǒng)去除光譜吸收特征參數(shù)的不同生育期油菜葉片SPAD值估算模型及其精度Table 5 SPAD value estimation model and accuracy of rape leaves at different growth stages based on continuum removal spectral absorption characteristic parameters

注：x表示光譜吸收特征參數(shù)，y表示SPAD值。

Note:xrepresents the spectral absorption characteristic parameters andyindicates SPAD value.

選取表4中各個(gè)生育期與葉片SPAD值達(dá)到P<0.01顯著性檢驗(yàn)，且相關(guān)系數(shù)大于0.5的光譜吸收特征參數(shù)，結(jié)合連續(xù)統(tǒng)去除特征波段，建立偏最小二乘回歸模型，結(jié)果如表6所示。表6顯示，各個(gè)生育期建立的模型R2均大于0.5，說明這些模型都能較好地估測(cè)油菜葉片SPAD值，其中蕾薹期估測(cè)模型的決定系數(shù)R2最大，高達(dá)0.73，RMSE和RE值均較小，分別為2.99和 5.00%，說明此模型最穩(wěn)定；其次是開花期的估測(cè)模型，R2為0.66，RMSE和RE只有2.43和3.73%，模型誤差較小。

表6 基于連續(xù)統(tǒng)去除光譜吸收最優(yōu)特征參數(shù)構(gòu)建的油菜葉片SPAD值偏最小二乘回歸估算模型及精度(n=64)Table 6 Partial least squares regression estimation model and accuracy for rape leaves SPAD value based on continuum removal of optimal spectral absorption characteristic parameters

將表6所建立的模型，用驗(yàn)證樣本的各特征參數(shù)分別估算葉片SPAD值，將其與實(shí)測(cè)值對(duì)比，進(jìn)行模型精度檢驗(yàn)，結(jié)果見圖 5。由圖5可知，各生育期模型擬合程度良好，表明所建模型對(duì)油菜葉片SPAD值有較好的預(yù)測(cè)效果。

A.苗期；B.蕾薹期；C.開花期；D.角果期A.Seedling stage；B.Bud stage；C.Flowering stage；D.Pod stage圖5 不同生育期油菜葉片SPAD值偏最小二乘回歸估算模型檢驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Testing results of partial least square regression estimation of rape leaves SPAD value at different growth stages

3 討 論

本研究中，不同生育期油菜葉片SPAD值與偏最小二乘回歸估算模型精度有差異，其中苗期、角果期模型精度較低。主要是因?yàn)槊缙谟筒松L發(fā)育初始，葉綠素含量較低，光譜中葉綠素信息較弱；而角果期處于油菜生長發(fā)育末期，葉片內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，水分含量降低、花青素含量升高，影響了光譜中葉綠素信息的表征；而在蕾薹期與開花期，油菜長勢(shì)旺盛，葉綠素不斷積累，故SPAD估算和模型精度大幅提升。

連續(xù)統(tǒng)去除光譜將作物葉片光譜映射到局部連續(xù)統(tǒng)線上，歸一化處理使得局部吸收特征之間的差異被放大[25]，尤其在葉綠素吸收和利用的可見光區(qū)域，連續(xù)統(tǒng)去除光譜的吸收谷與原始光譜相比吸收特征被放大。吸收谷的面積與深度由角果期、苗期、開花期到蕾薹期逐漸變大。隨著生育期的推移，在藍(lán)光波段(400～550 nm)，連續(xù)統(tǒng)去除光譜吸收參數(shù)與SPAD值的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，并在開花期達(dá)到峰值。主要是因?yàn)樵诿缙谇昂螅~片中的葉綠素含量迅速增加，到了蕾薹期油菜營養(yǎng)與生殖生長不斷進(jìn)行，在開花期葉綠素含量較高，到角果期油菜主要以生殖生長為主，葉綠素含量降低，主要營養(yǎng)物質(zhì)向籽粒輸入。在藍(lán)光波段，H、A、LA、RA與SPAD值均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，NMAD與SPAD值呈現(xiàn)較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系。在紅光范圍(550～770 nm)，A、LA、RA與SPAD值呈現(xiàn)較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，這是由于當(dāng)葉綠素含量上升，紅光范圍的吸收整體增強(qiáng)，因此吸收峰總面積及其寬度均增大，NMAD與葉片SPAD值呈現(xiàn)較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與前人研究結(jié)果一致[23]。

4 結(jié) 論

1)連續(xù)統(tǒng)去除光譜與原始光譜相比吸收特征被放大，在400～550與550～770 nm波段的吸收谷中，光譜反射率從蕾薹期、開花期、苗期到角果期依次遞增，最大吸收深度和吸收谷面積逐漸增大。在波長550 nm處，反射峰反射率由大到小依次為角果期、苗期、開花期與蕾薹期。

2)利用連續(xù)統(tǒng)去除光譜特征波段與吸收特征參數(shù)，分別建立各個(gè)生育期油菜葉片SPAD值估算模型，模型的R2均優(yōu)于原始光譜特征波段建立的模型，具有更好的SPAD值估算能力。運(yùn)用連續(xù)統(tǒng)去除光譜特征波段結(jié)合最優(yōu)吸收特征參數(shù)構(gòu)建的偏最小二乘回歸估算模型，是進(jìn)行油菜葉片SPAD估算的最優(yōu)模型。