王 媛，白貴斌，王 娟，曾 瑾，劉曉明，李 勇

(寧夏大學(xué) a西部生物資源保護與利用教育部重點實驗室，b生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)引起的一種以呼吸系統(tǒng)感染為主的人、畜共患的慢性消耗性傳染病[1-3]，是一種跨人、家畜和野生動物傳播的復(fù)雜性疾病，受多種因素的影響[4-5]。雖然從MTB發(fā)現(xiàn)至今已有130多年的歷史，但是結(jié)核病的發(fā)病機制仍未闡明。

肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(type Ⅱ alveolar epithelial cells，AEC Ⅱ)和肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage，AMs)一樣，都是肺臟中結(jié)核分枝桿菌復(fù)制與儲存的靶細(xì)胞，在機體抗MTB感染過程中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)控作用。AEC Ⅱ通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子來調(diào)控宿主先天免疫應(yīng)答，從而建立肺泡內(nèi)細(xì)胞因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[6]。在長期的進化選擇下，MTB可以侵入AEC Ⅱ中定殖和復(fù)制。MTB在AEC Ⅱ內(nèi)的復(fù)制活性比在巨噬細(xì)胞內(nèi)更高，可通過刺激AEC Ⅱ分泌細(xì)胞因子來產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而避免宿主免疫系統(tǒng)的感知與清除[7-9]。AEC Ⅱ也可以通過分泌細(xì)胞因子，募集巨噬細(xì)胞到肺泡區(qū)域參與機體的抗結(jié)核調(diào)控。因此，AEC Ⅱ在抗MTB感染免疫調(diào)控中的作用越來越受到重視。

p53是一種腫瘤抑制因子，可調(diào)控細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯，維持基因組的穩(wěn)定性[10-12]。p53信號通路參與調(diào)控人類許多常見癌癥的發(fā)生。p53可被腫瘤壞死因子TNF-α誘導(dǎo)激活，協(xié)同Sonic Hedgehog(SHH)信號通路來調(diào)節(jié)細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[6]。研究發(fā)現(xiàn)病原菌(如MTB)感染機體的免疫調(diào)控過程中也有p53信號通路的參與。在牛結(jié)核分枝桿菌減毒株(BacillusCalmette-Guérin，BCG)感染AEC Ⅱ的過程中，p53信號通路可抑制TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞死亡[6]。但p53信號通路如何在抗結(jié)核免疫調(diào)控中發(fā)揮作用，尚未見詳細(xì)報道。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB是調(diào)控病原微生物感染宿主免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)的重要因子[13-14]，其在AMs和AEC Ⅱ中的表達(dá)水平隨細(xì)胞表面識別受體TLR-4的激活而增加[15]。p53在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中，也可促進Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)依賴性炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生[15-16]；同時，研究發(fā)現(xiàn)TLR-4和下游信號TRAF6在BCG感染AMs時需要p53信號通路參與調(diào)控[15,17]。由此可見，AEC Ⅱ在抗MTB感染時的免疫調(diào)控機制是比較復(fù)雜的。那么，MTB感染AEC Ⅱ是如何通過p53信號通路調(diào)控細(xì)胞的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的，仍未見報道[16]。為此，本試驗建立了p53基因過表達(dá)和干擾的AEC Ⅱ細(xì)胞系A(chǔ)549模型，研究BCG感染模型細(xì)胞時，p53信號通路相關(guān)信號因子(p53、p300、NF-κB、TLR-4、TRAF6)及炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8)mRNA表達(dá)水平的變化情況，以期揭示p53信號通路在MTB感染AEC Ⅱ中的免疫調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 菌株與細(xì)胞株

牛結(jié)核分枝桿菌減毒株，購于成都生物制品研究所；AEC Ⅱ細(xì)胞系A(chǔ)549和人腎上皮細(xì)胞系293T，購于中國科學(xué)院北京協(xié)和細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑

具有卡那霉素(Kana)抗性的p53基因過表達(dá)載體plRES2-EGFP-p53 WT，購于Addgene；具有氨芐青霉素(Amp)抗性的p53基因干擾載體TP53-RNAi(2645)、TP53-RNAi(2646)、TP53-RNAi(2647)、TP53-RNAi(2648)和空載體con048，購于上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素溶液(100×)、2.5 g/L胰酶、胎牛血清(FBS)、LipofectamineTM3000 Reagent、蛋白彩色預(yù)染Marker，購于Thermo Fisher scientific；胰化蛋白胨、酵母浸出物、瓊脂、氯化鈉(NaCl)、Opti-MEMTM Medium、Tween-80、二甲基亞砜(DMSO)，購于Sigma；兔源一抗p53、p300、NF-κB-p65、TLR-4、鼠源一抗TRAF6和β-actin，購自Cell signaling Technology；二抗IRDye 800CW goat anti-mouse IgG(H+L)、IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG(H+L)，購于Licor公司；Middlebrook 7H9培養(yǎng)基、Middlebrook OADC Enrichment，購于BD公司；TIANGEN無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、TIANGEN培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒、無核酶水(DNaes/RNase-Free)，購于北京天根生化科技有限公司；TransScript Frist-Strand cDNA Synthesis試劑盒、TransScript?Top/Tip Green qPCR SuperMix、6 Protein Loading Buffer，購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；凱基全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒，購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 p53基因過表達(dá)和干擾載體的驗證

將p53基因干擾載體和過表達(dá)載體菌液在含對應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基中擴增后，用TIANGEN無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?93T細(xì)胞(密度為1×106個/mL)接種于6孔板，次日待細(xì)胞融合度達(dá)70%時，利用LipofectamineTM3000 Reagent轉(zhuǎn)染p53基因干擾及過表達(dá)載體，每組重復(fù)3次。將轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h后，觀察其綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)情況，并收集細(xì)胞樣品，以β-actin為內(nèi)參蛋白進行Western bolt篩選驗證。利用Image J軟件對Western bolt試驗結(jié)果進行圖片灰度值分析，以目的蛋白及內(nèi)參β-actin灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。以轉(zhuǎn)染空載體con048的293T細(xì)胞為對照組(CK)。

1.4 p53基因過表達(dá)和干擾A549細(xì)胞模型的建立

將篩選得到的p53基因過表達(dá)和干擾載體在含相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基上擴增后，用TIANGEN無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，用超微量分光光度計(nanodrop 8000)測定質(zhì)粒濃度及純度后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆?。將A549細(xì)胞(密度為5×105個/mL)接種于6孔板，次日待細(xì)胞融合度達(dá)60%時，利用LipofectamineTM3000 Reagent將篩選得到的p53基因過表達(dá)和干擾載體轉(zhuǎn)染其中，每組重復(fù)3次,37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h后，觀察A549細(xì)胞中GFP的表達(dá)情況，同時收集細(xì)胞樣品，以β-actin為內(nèi)參蛋白，進行Western bolt試驗，檢測p53和NF-κB蛋白的相對表達(dá)水平。利用Image J軟件對Western bolt試驗結(jié)果進行圖片灰度值分析，以β-actin為內(nèi)參，獲得目的蛋白的相對表達(dá)水平。以未經(jīng)任何處理的A549細(xì)胞為空白對照組(CK)。

1.5 BCG感染對模型A549細(xì)胞p53信號通路相關(guān)因子表達(dá)的影響

以感染復(fù)數(shù)(MOI)為10的BCG感染未經(jīng)任何處理的A549細(xì)胞及p53基因過表達(dá)和干擾的A549細(xì)胞(BCG+處理)，并以未感染的各類A549細(xì)胞為參照(BCG-處理)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞樣品備用,每組細(xì)胞處理重復(fù)3次。選用β-actin基因為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量PCR(Realtime-PCR)法檢測上述A549細(xì)胞樣品中p53信號通路相關(guān)信號因子(p53、p300、NF-κB、TLR-4、TRAF6)及炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8)mRNA的表達(dá)情況，并采用Western blot試驗分析p53信號通路相關(guān)信號因子的表達(dá)情況。

1.5.1 實時熒光定量PCR 參考GenBank中各基因的序列，根據(jù)Realtime-PCR引物設(shè)計原則，采用Primer 5.0軟件設(shè)計試驗所需的引物，并交由生工生物工程(上海)有限公司合成。各引物信息詳見表1。

利用TIANGEN培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取上述A549細(xì)胞總RNA，用超微量分光光度計(nanodrop 8000)測定樣品總RNA濃度及純度。以樣品最小RNA濃度為準(zhǔn)，調(diào)整所有待測樣品達(dá)到同一濃度。利用TransScript Frist-Strand cDNA Synthesis試劑盒反轉(zhuǎn)錄5 μg總RNA，反應(yīng)體系為20 μL。將反轉(zhuǎn)錄所得cDNA按5倍稀釋后進行RT-PCR，反應(yīng)體系為：2×TransScript?Top/Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，ddH2O 7 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板cDNA(50 ng/μL)1 μL。使用Qtower 2.0熒光定量PCR儀檢測：94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，循環(huán)40次。采用2-ΔΔCt法分析各基因mRNA的相對表達(dá)水平。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Real-time fluorescent quantitative PCR primers

1.5.2 Western blot分析 利用凱基全蛋白提取試劑盒提取A549細(xì)胞樣品總蛋白，用凱基BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，計算各組樣品的質(zhì)量濃度(μg/μL)。

進行Westernblot分析時，p53、NF-κB、TRAF6、β-actin蛋白配制10%分離膠，p300、TLR-4配制8%分離膠；各樣品均采用5%濃縮膠。各組樣品上樣量均為50 μg。點樣后，恒壓80 V電泳2 h，恒流300 mA濕轉(zhuǎn)3 h。轉(zhuǎn)膜完畢后，用TBS配制的體積分?jǐn)?shù)5%牛奶于室溫下封閉2 h。用經(jīng)封閉液稀釋的一抗于4 ℃過夜孵育；次日室溫平衡30 min后，用體積分?jǐn)?shù)0.3% TBS-Tween-20快速洗膜3次，5 min/次。洗膜后加入熒光二抗，室溫避光振蕩孵育1 h；洗膜同上。

利用雙色紅外激光成像系統(tǒng)(Odyssey Sa)進行曝光，利用Image J軟件對曝光圖片進行灰度值分析，以目的蛋白及內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 20軟件、GraphPad Prism 5軟件和Image J軟件進行分析，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，LSD檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 p53基因過表達(dá)和干擾載體作用效果的驗證

將p53基因干擾和過表達(dá)載體分別瞬時轉(zhuǎn)染到293T中，培養(yǎng)48 h后，在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，p53基因過表達(dá)和干擾載體轉(zhuǎn)染的293T中，GFP陽性細(xì)胞率約為70%，較空載體con048轉(zhuǎn)染的293T對照細(xì)胞(陽性細(xì)胞率為80%)低(圖1)，表明目的載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞中。

由圖2可知，plRES2-EGFP-p53 WT載體對293T中的p53蛋白的過表達(dá)效果非常明顯；在4個干擾載體中，TP53-RNAi(2648)載體對293T中p53蛋白的干擾效果最明顯，故后續(xù)試驗選擇TP53-RNAi(2648)載體作為干擾載體。

2.2 p53基因過表達(dá)和干擾A549細(xì)胞模型的建立

熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，未經(jīng)任何處理的空白對照組A549細(xì)胞無GFP表達(dá)(圖3-A)；p53基因干擾載體TP53-RNAi(2648)轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞中，GFP陽性細(xì)胞比例約為30%(圖3-B)；p53基因過表達(dá)載體plRES2-EGFP-p53 WT轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞中，GFP陽性細(xì)胞的比例約為40%(圖3-C)。表明TP53-RNAi(2648)和 plRES2-EGFP-p53 WT已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞中。

A.轉(zhuǎn)染空載體con048的293T細(xì)胞;B.轉(zhuǎn)染過表達(dá)載體plRES2-EGFP-p53 WT的293T細(xì)胞;C～F.分別為轉(zhuǎn)染干擾載體TP53-RNAi(2645)、TP53-RNAi(2646)、TP53-RNAi(2647)和TP53-RNAi(2648)的293T細(xì)胞A.293T cells transfected with empty vector con048;B.293T cells transfected with expression vector plRES2-EGFP-p53 WT;C-F.293T cells transfected with interference vectors TP53-RNAi (2645),TP53-RNAi (2646),TP53-RNAi (2647) and TP53-RNAi (2648),respectively

圖2 p53基因過表達(dá)和干擾載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后p53蛋白的相對表達(dá)水平Fig.2 Relative expression level of p53 protein after p53 gene overexpression and interference vector transfection into 293T cells

A.空白對照；B.轉(zhuǎn)染TP53-RNAi(2648)的A549細(xì)胞；C.轉(zhuǎn)染plRES2-EGFP-p53 WT的A549細(xì)胞A.CK;B.A549 cells transfected with TP53-RNAi (2648);C.A549 cells transfected with plRES2-EGFP-p53 WT圖3 p53基因過表達(dá)和干擾載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后的GFP表達(dá)情況(100×)Fig.3 GFP expression of cells transfected with p53 gene and interfered with vector transfected A549 cells for 48 h (100×)

由表2可知，p53基因干擾載體組A549細(xì)胞p53蛋白表達(dá)水平較對照組極顯著下降，NF-κB蛋白表達(dá)水平較對照組極顯著升高；p53基因過表達(dá)組A549細(xì)胞p53蛋白表達(dá)水平較對照組極顯著升高，NF-κB蛋白表達(dá)水平較對照組極顯著下降。

表2 p53基因過表達(dá)和干擾的A549細(xì)胞中p53和NF-κB蛋白的相對表達(dá)水平Table 2 Relative expression levels of p53 and NF-κB protein in A549 cells overexpressing and interfered with p53 gene

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Note:Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05),and different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01).

2.3 BCG感染模型A549細(xì)胞p53信號通路相關(guān)因子mRNA和蛋白水平的表達(dá)分析

2.3.1 mRNA水平表達(dá)分析 由表3可知，3組A549細(xì)胞中， BCG+處理的p53、p300、TLR-4、NF-κB和TRAF6基因mRNA表達(dá)水平顯著或極顯著高于BCG-組，這表明BCG感染可引起p53信號通路和NF-κB信號通路的活化。

p53干擾組BCG-處理的p53和p300基因mRNA表達(dá)水平較CK組BCG-處理極顯著降低，而TLR-4、NF-κB和TRAF6基因mRNA的表達(dá)水平極顯著升高；p53過表達(dá)組BCG-處理的p53和p300基因mRNA表達(dá)水平較CK組BCG-處理極顯著升高，而TLR-4、NF-κB和TRAF6基因mRNA的表達(dá)水平顯著或極顯著降低。這表明p53基因的表達(dá)可能與p300基因存在正調(diào)控作用，而與NF-κB信號通路相關(guān)基因存在負(fù)調(diào)控關(guān)系。

p53干擾組BCG+處理的p53基因mRNA表達(dá)水平相對于CK組BCG-處理極顯著升高，p300基因mRNA表達(dá)水平差異不顯著，而TLR-4、TRAF6和NF-κB基因的mRNA表達(dá)水平極顯著升高；p53過表達(dá)組BCG+處理的p53、p300、TLR-4、TRAF6和NF-κB基因mRNA表達(dá)水平較CK組BCG-處理極顯著升高。BCG+處理后，p53和p300基因的mRNA表達(dá)水平與p53基因表達(dá)量呈正相關(guān)，TLR-4和NF-κB基因的mRNA表達(dá)水平與p53基因表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。NF-κB信號通路中，TRAF6基因的mRNA表達(dá)水平本應(yīng)與p53表達(dá)量負(fù)相關(guān)，但本研究呈正相關(guān)，這一現(xiàn)象有待進一步分析?？傊?，在BCG+處理下，p53基因協(xié)同p300基因的表達(dá)來負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路相關(guān)基因的表達(dá)。

2.3.2 蛋白水平表達(dá)分析 由表4可知，3組A549細(xì)胞中，BCG+處理的p53、p300、TLR-4、NF-κB和TRAF6蛋白表達(dá)水平顯著或極顯著高于BCG-組，與其mRNA的表現(xiàn)一致，這進一步證明了BCG的感染活化了A549細(xì)胞中p53信號通路和NF-κB信號通路。

p53干擾組和過表達(dá)組經(jīng)BCG-處理，p53、p300、TLR-4、NF-κB和TRAF6蛋白相對于CK組的表達(dá)變化規(guī)律與其mRNA水平表現(xiàn)一致，這在蛋白水平上表明p53蛋白的表達(dá)可協(xié)同p300來負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路。

表3 BCG感染p53基因過表達(dá)和干擾A549細(xì)胞后p53信號通路相關(guān)因子mRNA的表達(dá)分析Table 3 Relative expression of p53 gene overexpression and interfered with mRNA expression of p53 signaling pathway in A549 cells

注：BCG-.BCG未感染處理;BCG+.BCG感染處理。同一基因，數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示與對照組BCG-處理差異顯著(P<0.05)，標(biāo)不同大寫字母表示與對照組BCG-處理差異極顯著(P<0.01);數(shù)據(jù)后標(biāo)“*”和“**”分別表示與相應(yīng)組的BCG-處理差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。下表同。

Note:BCG-.BCG uninfected treatment;BCG+.BCG infected treatment.Different lowercase and uppercase letters indicate that the same gene is significantly (P<0.05) and extremely significantly (P<0.01) different from the BCG uninfected control group.“*” and “**” indicate significant (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01) between BCG infection treatment and BCG uninfected treatment for same gene,respectively.The same below.

表4 BCG感染p53基因過表達(dá)和干擾A549細(xì)胞后p53信號通路相關(guān)基因蛋白的相對表達(dá)分析Table 4 Relative expression of p53 gene overexpression and interference with p53 signaling pathway-related gene proteins in A549 cells

p53干擾組經(jīng)BCG+處理，p53、p300、TLR-4、NF-κB和TRAF6蛋白相對于CK組BCG-處理的表達(dá)變化規(guī)律與其mRNA水平表現(xiàn)一致。p53過表達(dá)組BCG+處理，p53、TLR-4和NF-κB蛋白的表達(dá)相對于CK組BCG-均與其mRNA表達(dá)變化規(guī)律一致；p300蛋白的表達(dá)變化規(guī)律與其p53基因過表達(dá)組mRNA一致，即感染后發(fā)生上調(diào)，但表達(dá)水平顯著低于CK組BCG+處理；TRAF6蛋白表達(dá)水平與其mRNA水平相反，但卻證實了其與p53基因的過表達(dá)成負(fù)相關(guān)，這符合NF-κB信號通路其他相關(guān)信號的調(diào)控規(guī)律。經(jīng)BCG+處理后，p53蛋白表達(dá)量與p53和p300蛋白水平呈正相關(guān)，與NF-κB信號通路的TLR-4、NF-κB-p65和TRAF6蛋白表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。這些試驗結(jié)果在蛋白水平上進一步證明了在BCG+下，p53可協(xié)同p300的表達(dá)來負(fù)調(diào)控NF-κB信號通路參與A549細(xì)胞的抗結(jié)核分枝桿菌的感染。

2.4 BCG感染模型A549細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)分析

炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)分泌是AEC Ⅱ抗BCG感染的一個重要方面。BCG感染模型A549細(xì)胞后,炎癥細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)結(jié)果見表5。

表5 BCG感染p53基因過表達(dá)和干擾A549細(xì)胞后炎癥細(xì)胞因子mRNA的相對表達(dá)分析Table 5 Relative expression of inflammatory cytokine mRNA in BCG-infected p53 gene overexpressing and interfered with A549 cells

由表5可知，3組A549細(xì)胞中，p53干擾組BCG-處理的TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8基因mRNA表達(dá)水平與其對照組相比極顯著上調(diào)；p53過表達(dá)組mRNA表達(dá)水平與其對照組相比依次表現(xiàn)為TNF-α基因顯著下調(diào)，IFN-γ基因極顯著下調(diào)，IL-6基因無顯著差異，IL-8基因極顯著上調(diào)。BCG+處理的TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8基因mRNA表達(dá)水平極顯著高于BCG-組，這表明p53基因通過負(fù)調(diào)控TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的表達(dá)來參與A549細(xì)胞抗BCG感染的免疫調(diào)控。

3 討 論

AEC Ⅱ可以通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子來募集其他免疫細(xì)胞(如單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和多形核細(xì)胞等)，進而清除宿主機體內(nèi)侵染的結(jié)核分枝桿菌[18]。當(dāng)BCG感染宿主時，會引起機體不同的信號通路(如p53)被活化，進而激活不同的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)特異基因的表達(dá)，從而引發(fā)機體抗結(jié)核免疫調(diào)控作用[10,19]。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)在機體免疫調(diào)控中，p53信號通路與NF-κB基因之間存在某種“cross-talk”[20]，但是它們?nèi)绾卧诜闻萆掀ぜ?xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染的免疫機制中發(fā)揮作用尚不清楚。

p53基因通過結(jié)合到靶基因特定的序列而激活許多下游基因的轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮其生物學(xué)功能；p300基因通過調(diào)節(jié)p53蛋白的泛素化作用和降解而控制p53蛋白的穩(wěn)定性。p53基因也可被包含p53、MDM2和p300/CBP的三元絡(luò)合物降解[6,21-22]。p53介導(dǎo)的靶基因轉(zhuǎn)錄亦需p300輔助和局部組蛋白乙酰化來影響基因的轉(zhuǎn)錄與凋亡[22-23]。NF-κB基因是一類參與許多炎癥和感染有關(guān)細(xì)胞過程中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子[24]，其中NF-κB-p65基因通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中涉及的多個基因的表達(dá)而對機體的免疫發(fā)揮至關(guān)重要的作用[25]。抑制NF-κB能夠增強巨噬細(xì)胞對MTB的清除作用[13,26]。TLR-4基因可通過識別NF-κB信號調(diào)節(jié)許多基因(如炎性細(xì)胞因子和黏附分子)的表達(dá)來誘發(fā)機體免疫反應(yīng)[27-28]；TRAF6基因是TLR-4基因的上游信號，其被TLR-4基因激活后，啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來進一步促進NF-κB基因活化，誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)多種細(xì)胞因子，參與機體天然免疫應(yīng)答[28-30]。本試驗結(jié)果表明，BCG+處理后的3組A549細(xì)胞均能引起p53信號通路相關(guān)因子p53和p300，以及NF-κB信號通路的NF-κB、TLR-4、TRAF6在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在A549細(xì)胞抗BCG感染中，p53基因協(xié)同p300基因來負(fù)調(diào)控NF-κB的表達(dá)，這一規(guī)律與前人的研究結(jié)論[24,31]相符；TLR-4和TRAF6基因也與p53基因存在負(fù)調(diào)控，這也與前人的研究結(jié)果[32]一致。由此可見，AEC Ⅱ細(xì)胞識別結(jié)核分枝桿菌時依賴p53信號通路中的p53協(xié)同p300基因，負(fù)調(diào)控NF-κB、TLR-4與TRAF6基因來共同協(xié)調(diào)控制。

BCG感染AEC Ⅱ誘導(dǎo)多種炎癥因子的分泌(如TNF-α[6]、IFN-γ、IL-6和IL-8[8,33]等)，激活先天免疫細(xì)胞殺傷病原微生物，從而在抗結(jié)核感染免疫中起重要作用[23,32-35]。在BCG+處理的3組A549細(xì)胞中，p53基因的表達(dá)量變化能促進或抑制炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的表達(dá)，它們之間主要表現(xiàn)為負(fù)調(diào)控作用，以介導(dǎo)AEC Ⅱ的抗結(jié)核免疫調(diào)控。