夏金健，徐寶山，馬信龍，張楊，郭悅，楊陽(yáng)，張維昊，杜立龍，邵鵬飛，何冠宇

腰痛是全球范圍的常見疾病，癥狀重者可導(dǎo)致活動(dòng)受限甚至殘疾，引起巨額的醫(yī)療花費(fèi)和嚴(yán)重的社會(huì)負(fù)擔(dān)[1]。椎間盤退變導(dǎo)致的纖維環(huán)破裂和髓核突出是引起腰痛的主要原因。癥狀重者往往需要手術(shù)治療，雖可改善癥狀，但存在手術(shù)并發(fā)癥且術(shù)后長(zhǎng)期效果不佳[2]。其主要原因是破裂缺損的纖維環(huán)會(huì)引起椎間盤退變加速，甚至復(fù)發(fā)[3]。因此修復(fù)破裂缺損的纖維環(huán)至關(guān)重要。

組織工程技術(shù)為纖維環(huán)的再生修復(fù)提供了重要方法。理想的組織工程纖維環(huán)支架需具有良好的生物相容性、可降解性和力學(xué)性能，并且模擬天然纖維環(huán)的微觀結(jié)構(gòu)[4]。為此，本研究采用熔融紡絲技術(shù)，以聚己內(nèi)酯（PCL）和聚乳酸聚乙醇酸共聚物（PLGA）混合物作為原料，旨在構(gòu)建一種具有生物相容性、適宜降解且具有良好力學(xué)性能的組織工程支架，并探討其作為組織工程纖維環(huán)的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要材料 （1）組織來源。經(jīng)在天津醫(yī)院婦產(chǎn)科行剖宮產(chǎn)手術(shù)的產(chǎn)婦同意，獲取新鮮無(wú)污染的人臍帶，用于原代臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞（HWJ-MSCs）的取材。（2）主要試劑、儀器。PCL（Sigma，美國(guó)）；PLGA（濟(jì)南岱罡生物有限公司，質(zhì)量比PLLA∶PGA=50∶50）；FBS、高糖DMEM 培養(yǎng)液（GIBCO，美國(guó)）；二甲基甲酰胺（化學(xué)純，天津康科德科技有限公司）；4%多聚甲醛固定液（化學(xué)純，上海嘉辰化工有限公司）；Live/dead 染色試劑（Abcam，英國(guó)）；CCK-8 細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（DOJIND0，日本）；恒溫培養(yǎng)箱（Hera-cell，德國(guó)）；數(shù)顯電動(dòng)攪拌器（上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司）；CL-2 型恒溫加熱磁力攪拌器（河南予華儀器有限公司）；電加熱熔融紡絲機(jī)（南開大學(xué)分子生物研究所，天津）；Leica 體式顯微鏡（Leica 公司，德國(guó)）；掃描電子顯微鏡（SEM，Hitachi，日本）；力學(xué)加載裝置（天津理工大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，天津）；共聚焦熒光顯微鏡（Olympus，日本）；酶標(biāo)儀（PerkinElmer，美國(guó)）。

1.2 混合材料制備 本實(shí)驗(yàn)以比例為65∶35 的PCL-PLGA混合材料支架為實(shí)驗(yàn)組；以純PCL 支架作為對(duì)照組。將2種材料經(jīng)恒溫加熱并攪拌，隨后將混合充分的材料收集備用，見圖1。

1.3 支架制備 制作支架參考Kelnar的方法[5]，使用電加熱熔融紡絲機(jī)制備纖維支架管，制作參數(shù)及過程見圖2。最終得到直徑5 mm的紡絲管膜。將成品支架稱質(zhì)量記為Wa，然后浸泡在二甲基甲酰胺溶液中使PLGA 充分溶解后，清洗干燥至恒重時(shí)再次稱質(zhì)量，記為Wb，得出各組支架的實(shí)際PCL組成比例，即為Wa/Wb×100%，每組選取5個(gè)支架分別重復(fù)測(cè)量5次取均值。

1.4 支架基本性能評(píng)估

1.4.1 孔徑、纖維直徑、孔隙率 截取5 mm 長(zhǎng)的成品支架，經(jīng)體式顯微鏡拍照記錄后固定在樣品臺(tái)上，經(jīng)噴金后放入掃描電鏡下拍照觀察。每組支架選取5張電鏡照片，每張照片隨機(jī)選取不同的3 個(gè)位置測(cè)量支架直徑纖維（μm）、孔徑（μm）。參考Hoyer等[6]的方法，將樣品置入盛有乙醇的量筒中，根據(jù)置入前后乙醇體積變化經(jīng)計(jì)算測(cè)得支架孔隙率。每組支架重復(fù)測(cè)量5次取均值。

1.4.2 力學(xué)性能檢測(cè) 測(cè)定過橫截圓環(huán)面積的支架兩端固定在力學(xué)加載裝置中，分別反復(fù)壓縮（V1=1 mm/min）或拉伸（V2=10 mm/min），獲得壓縮或拉伸“力-形變量”的曲線，根據(jù)支架形變量和受力面積計(jì)算出壓縮彈性模量與拉伸彈性模量。每組支架重復(fù)測(cè)量5次取平均值。

Fig.1 Preparation process of mixed materials圖1 混合材料制備流程

Fig.2 Melt spinning and parameters圖2 熔融紡絲過程及參數(shù)

1.4.3 體外降解 每組（n=25）支架分別稱質(zhì)量，記為W1。參考 Pan 等[7]的方法，將每個(gè)樣本分別置于一個(gè) 15 mL 無(wú)菌無(wú)酶離心管內(nèi)，每個(gè)離心管加入10 mL 1×PBS（pH=7.4），并加入疊氮化鈉（W/W=0.1%）、盤尼西林（100 U/mL）和鏈霉素（100 U/mL），37 ℃恒溫震蕩。每組分別從第4 周開始每隔4周取出5 個(gè)支架，經(jīng)沖洗后烘干至恒重后稱質(zhì)量，記為W2。計(jì)算體外質(zhì)量剩余率 A=（W1-W2）/W1×100%，并取平均值。隨后在體式顯微鏡和掃描電子顯微鏡下觀察其結(jié)構(gòu)變化。

1.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.5.1 分離培養(yǎng)人臍帶沃頓膠間充質(zhì)干細(xì)胞 參考Balasubramanian 等[8]的方法提取 HWJ-MSCs。大致步驟如下：將臍帶去掉臍動(dòng)脈、臍靜脈和臍帶外膜，只留下臍帶沃頓膠。將沃頓膠剪成2 mm3小塊放入小瓶中，加入0.2%Ⅰ型膠原酶并加入Hanks溶液稀釋混勻。4 ℃消化過夜后將裝有沃頓膠和消化液的小瓶放置于37 ℃搖床200 r/min 震蕩2 h 充分消化。將溶液通過200目無(wú)菌鋼網(wǎng)過濾后放入無(wú)菌離心管中，1 300 r/min 離心7 min。離心后棄一半上清液，再次加入Hanks 溶液1 300 r/min 離心7 min，得到的沉淀即為原代細(xì)胞。將細(xì)胞移入T25培養(yǎng)瓶中并加入含1%青霉素和鏈霉素及20%FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中孵育，隔天換液。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合80%～90%密度時(shí)進(jìn)行傳代，P3代細(xì)胞被用于本實(shí)驗(yàn)研究。

1.5.2 組織工程纖維環(huán)體外構(gòu)建 將支架切成2 mm厚的圓環(huán)薄片，滅菌后在孔板中經(jīng)含血清培養(yǎng)液浸泡過夜后，吸干培養(yǎng)液，將消化好的 P3 代 HWJ-MSCs 以 2×106/mL 的密度接種在支架上。孵育2 h后，向每個(gè)孔中加入200 μL培養(yǎng)液，再次放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，隔天換液。

1.5.3 材料細(xì)胞生物相容性檢測(cè) 分別在負(fù)載細(xì)胞后的第1、5天取出細(xì)胞支架復(fù)合體，經(jīng)無(wú)菌PBS清洗和4%多聚甲醛固定30 min后加入細(xì)胞Live/dead染色工作液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育20 min，然后再用無(wú)菌PBS清洗。隨后將支架取出放置于共聚焦皿中，使用共聚焦熒光顯微鏡觀察細(xì)胞存活情況。

1.5.4 材料毒性檢測(cè) 細(xì)胞支架復(fù)合體培養(yǎng)1、3、5、7 d時(shí)分別加入20 μL CCK-8工作液，隨后置于37 ℃恒溫箱孵育3 h。最后避光使用酶標(biāo)儀檢測(cè)4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品在450 nm 波長(zhǎng)處的光密度（OD）值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)分析結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間的差異性，采用單因素方差分析比較組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)差異性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 支架形態(tài)結(jié)構(gòu)及性能特征

2.1.1 支架材料比例驗(yàn)證 經(jīng)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組支架PCL 的質(zhì)量占比均與制料時(shí)一致。PLGA 溶解后的實(shí)驗(yàn)組支架在體視顯微鏡下仍表現(xiàn)出規(guī)則的纖維走向及規(guī)則的孔隙形狀，可見PCL 和PLGA 兩種材料混合充分，且?guī)缀鯖]有任何材料損失，而對(duì)照組支架PLGA 溶解前后在大體觀察及體式顯微鏡下觀察時(shí)未見明顯差異，見圖3A、B。

Fig.3 Pictures before and after SDS immersion of each group of scaffolds圖3 各組支架PLGA溶解前后圖片

2.1.2 支架觀察 大體下可見2組環(huán)形熔融紡絲支架整體形狀規(guī)則，由PCL纖維均勻環(huán)繞而成；體視顯微鏡鏡下可見2組支架各層纖維呈平行斜交的規(guī)則走向，見圖3A。掃描電鏡圖片可見絲與絲交錯(cuò)形成大量菱形孔隙，各孔隙成角接近60°，且各孔空間疊加較緊密，見圖4。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組支架的纖維直徑（μm：50.914±1.367vs.49.674±1.193，n=5，t=1.528，P=0.165）、孔徑（μm：70.288±1.157vs.71.524±1.128，n=5，t=1.710，P=0.126）、孔隙率（72.344%±0.805%vs.73.148%±0.766%，n=5，t=1.618，P=0.144）差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.1.3 力學(xué)性能測(cè)試 實(shí)驗(yàn)組支架的壓縮彈性模量（MPa：1.415±0.110vs.2.365±0.193，n=5，t=9.825，P＜0.001）和拉伸彈性模量（MPa：5.467±0.231vs.8.956±0.220，n=5，t=24.470，P＜0.001）均較對(duì)照組下降，見圖5。

Fig.4 SEM figure of scaffolds(×1 000)圖4 支架掃描電鏡圖（×1 000）

Fig.5 Comparison of mechanical parameters between the two groups圖5 2組支架的力學(xué)參數(shù)比較

2.1.4 體外降解結(jié)果 體視顯微鏡照片顯示，實(shí)驗(yàn)組支架在體外模擬環(huán)境中出現(xiàn)了纖維折斷、粉碎的情況，表現(xiàn)出降解趨勢(shì)，20周時(shí)混合支架破碎，完整性被破壞，見圖6A～C；通過SEM 可以更直觀地觀察到，4 周時(shí)實(shí)驗(yàn)組支架纖維橫截面表現(xiàn)出一定程度的裂縫，見圖6G。而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在第12 周時(shí)實(shí)驗(yàn)組纖維可見許多更細(xì)小的纖維從中剝離的趨勢(shì)，見圖6H；第20 周時(shí)出現(xiàn)了支架碎裂，完整性缺失的情況，見圖6I。而對(duì)照組PCL 支架纖維在3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的SEM中未觀察到明顯變化，見圖6J～L。實(shí)驗(yàn)組質(zhì)量剩余率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的稱質(zhì)量結(jié)果之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組質(zhì)量剩余率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

Fig.6 Microscopy and SEM images of the degradation process of the two groups of scaffolds in vitro圖6 2組支架體外降解過程的體式及SEM圖片

2.2 支架干細(xì)胞復(fù)合體構(gòu)建

2.2.1 干細(xì)胞提取擴(kuò)增 提取干細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，生長(zhǎng)狀態(tài)表現(xiàn)為典型的干細(xì)胞的長(zhǎng)梭條狀，細(xì)胞近核部較為飽滿，頭端和尾端較細(xì)長(zhǎng)。顯微鏡下P3代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞傳代后第3 天的狀態(tài)，可清楚地觀察到干細(xì)胞形態(tài)，見圖7。

Fig.7 The morphology of the extracted stem cells under a microscope（×200）圖7 提取干細(xì)胞顯微鏡下形態(tài)觀察（×200）

2.2.2 Live/dead 染色 支架接種細(xì)胞后，每天可觀察到培養(yǎng)液pH 值變化明顯。細(xì)胞Live/dead 染色的結(jié)果顯示，各組支架上細(xì)胞存活（綠色熒光）良好，第1天2組支架均有少量活細(xì)胞存在于觀察視野中，見圖8A、C。但第5 天可觀察到實(shí)驗(yàn)組支架上活細(xì)胞數(shù)量明顯較對(duì)照組支架多，見圖8B、D。上述2個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組支架均未觀察到死細(xì)胞（紅色熒光）。

Fig.8 Live/dead staining of scaffold-loaded cells(×200)圖8 各組支架負(fù)載細(xì)胞的Live/dead染色（×200）

2.2.3 支架細(xì)胞毒性檢測(cè) 結(jié)果顯示，各組OD值均有隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加的趨勢(shì)，但實(shí)驗(yàn)組總體漲幅明顯高于對(duì)照組，培養(yǎng)的第1天，各組支架的培養(yǎng)液OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；從第3天開始實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，2組間差異逐漸增加，第 7 天時(shí) 2 組間差異明顯（P＜0.01）。見表2。

3 討論

3.1 纖維環(huán)組織工程支架的仿生結(jié)構(gòu) 近年來，纖維環(huán)組織工程成為纖維環(huán)修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外專家研究的生物支架制備技術(shù)種類很多，包括靜電紡絲、冷凍干燥技術(shù)、濕紡、3D 打印等技術(shù)。Nerurkar等[9]曾利用靜電紡絲制作出斜向60°交叉層疊的PCL纖維膜支架來模仿纖維環(huán)結(jié)構(gòu)；Alvim Valente 等[10]曾使用冷凍干燥技術(shù)制作了 PCL 和PLGA的混合支架；本課題組采用濕法紡絲技術(shù)模擬天然纖維環(huán)結(jié)構(gòu)，制備出PCL 三維圓周取向的微米纖維支架[11]；也有研究者以絲素蛋白為原料，采用定向結(jié)晶技術(shù)構(gòu)建出微孔結(jié)構(gòu)支架[12]。但通過這些方法得到的支架取向性較差，達(dá)不到人體纖維環(huán)60°規(guī)則排列的結(jié)構(gòu)模式，而且孔徑規(guī)格大小并不統(tǒng)一，不利于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。熔融紡絲又稱熔體紡絲，是一種以聚合物為原料，通過將原料加熱并從噴絲孔中擠出，經(jīng)空氣冷卻固定成粗細(xì)均勻的纖維絲的技術(shù)。Brown 等[13]應(yīng)用熔融紡絲的方法成功制作出纖維成角、孔徑和空隙率均一的PCL 管狀支架。本實(shí)驗(yàn)以熔融紡絲為方法構(gòu)建出的纖維環(huán)組織工程支架，其取向性模擬了人體纖維環(huán)60°成角的特征。電鏡下可見支架纖維表面光滑且排列規(guī)則，因而孔隙的形狀及分布高度規(guī)則；經(jīng)檢測(cè)其較大的孔隙率、孔徑和規(guī)則的孔隙也將為細(xì)胞吸附和增殖提供適宜的場(chǎng)地條件。

Tab.1 Comparison of the remaining ratios of degradation at different time points between two groups表1 各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組體外降解質(zhì)量剩余率比較 （n=5，%，±s）

Tab.1 Comparison of the remaining ratios of degradation at different time points between two groups表1 各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組體外降解質(zhì)量剩余率比較 （n=5，%，±s）

＊＊P＜0.01

時(shí)間對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t 4周99.11±0.57 94.15±0.83 11.710＊＊8周98.96±0.55 82.56±0.55 38.113＊＊10周98.80±0.64 78.41±0.88 46.118＊＊12周98.90±0.47 62.90±0.84 86.332＊＊16周98.70±0.55 49.17±0.54 20 125.486＊＊F 0.399 2 811.616＊＊

Tab.2 CCK-8 assay for cell proliferation in experimental and control groups at various time points表2 CCK-8法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況 （n=5，OD值，±s）

Tab.2 CCK-8 assay for cell proliferation in experimental and control groups at various time points表2 CCK-8法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況 （n=5，OD值，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t第1天0.24±0.01 0.25±0.01 1.472第3天0.37±0.03 0.45±0.04 3.616＊第5天0.56±0.07 0.88±0.04 7.135＊＊第7天1.08±0.11 1.60±0.05 8.905＊＊F 117.084＊＊1 002.127＊＊

3.2 纖維環(huán)組織工程支架的生物降解性和力學(xué)性能 PLGA 和PCL 作為經(jīng)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)可用于臨床的高分子材料，其安全性是毋庸置疑的。PCL 擁有良好的力學(xué)性能，但降解周期較長(zhǎng)；PLGA 具有較好的降解活性，但因其質(zhì)地較脆而導(dǎo)致力學(xué)性能差強(qiáng)人意[14]。Kelnar 等[5]將PCL與PLGA 混合在一起，結(jié)果表明材料混合可以有效控制降解速度，同時(shí)混合材料的生物相容性較純PLGA 并沒有明顯下降。本研究降解實(shí)驗(yàn)顯示在PCL 中摻入PLGA 后，其降解性有明顯改善，同時(shí)力學(xué)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的彈性模量雖然較對(duì)照組有所下降，但仍在人體正常纖維環(huán)力學(xué)強(qiáng)度范圍內(nèi)。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明破裂纖維環(huán)經(jīng)修復(fù)后6個(gè)月時(shí)椎間盤的生物力學(xué)強(qiáng)度可恢復(fù)到正常水平的52.30%，術(shù)后12個(gè)月的生物力學(xué)強(qiáng)度恢復(fù)率可達(dá)91.79%[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組支架第3 個(gè)月時(shí)的體外質(zhì)量剩余率接近50%，其降解速率與已知的椎間盤自我修復(fù)過程基本相適應(yīng)。在降解檢測(cè)過程中，實(shí)驗(yàn)組支架在20周時(shí)出現(xiàn)支架纖維破碎、結(jié)構(gòu)完整性丟失的情況。我們考慮這一方面是由于體外降解過程一直在震蕩條件下完成的，因而支架會(huì)受到外界額外的力學(xué)影響；另一方面，我們只模擬了體內(nèi)的液體環(huán)境而忽略了體內(nèi)的生物因素，當(dāng)支架植入體內(nèi)后，體內(nèi)組織細(xì)胞填充到支架孔隙中，產(chǎn)生額外的支撐作用。

3.3 纖維環(huán)組織工程支架對(duì)種子細(xì)胞生物相容性的影響 Cui等[16]通過細(xì)胞Live/dead染色和MTT檢測(cè)驗(yàn)證了PLGA 對(duì)細(xì)胞的生物相容性優(yōu)于PCL。Ouyang 等[17]經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）在PLGA 材料上的增殖能力遠(yuǎn)高于PCL。本研究通過細(xì)胞Live/dead 染色和CCK-8 細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果證實(shí)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在混合支架上的5 d增殖速率明顯快于PCL組。

綜上所述，本研究首次以PCL-PLGA 混合材料為原料，通過熔融紡絲技術(shù)構(gòu)建出既具有生物相容性、同時(shí)也具備適宜降解性以及良好力學(xué)性能的仿生纖維環(huán)組織工程支架。通過多種技術(shù)手段檢測(cè)，我們認(rèn)為PCL-PLGA 混合支架在力學(xué)強(qiáng)度、降解速率以及干細(xì)胞相容性等方面都有著優(yōu)異的表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)所有的檢測(cè)均是基于環(huán)狀外形的組織工程支架的基礎(chǔ)上而實(shí)現(xiàn)的，接下來我們將進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并嘗試截取部分圓環(huán)支架在小動(dòng)物纖維環(huán)缺損模型上進(jìn)行體內(nèi)修復(fù)，以便進(jìn)一步驗(yàn)證此種支架的修復(fù)潛力。但本研究仍有不足之處：首先，本實(shí)驗(yàn)選取的PLGA其構(gòu)成比為50∶50，雖然此比例的PLGA具有良好的生物相容性，同時(shí)可以借助PCL提高其力學(xué)性能，但也應(yīng)考察其他構(gòu)成比的PLGA 與PCL結(jié)合后的性能。其次，PLGA材料在降解過程中會(huì)釋放酸性物質(zhì)的問題仍有待解決。