劉 帥，鄭 健，姜 鑫，張立陽，趙洪波，張永根*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，黑龍江哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學實驗實習與示范中心，黑龍江哈爾濱 150030）

隨著我國畜牧業(yè)發(fā)展水平的提高，全株玉米青貯因其營養(yǎng)價值高、適口性好和易保存等優(yōu)點在反芻動物飼料供應中占有非常重要的地位，對“節(jié)糧型”畜牧業(yè)發(fā)展起到積極的推動作用[1]。然而，很多地區(qū)運用常規(guī)發(fā)酵方法對全株玉米進行發(fā)酵，其表面附著乳酸菌數(shù)量不足，不能有效縮短青貯過程中有氧呼吸階段，造成腐敗微生物滋生，營養(yǎng)成分消耗嚴重，導致青貯品質(zhì)下降和飼料資源浪費。

目前，國內(nèi)外主要利用各種微生物制劑提高玉米青貯的發(fā)酵特性和營養(yǎng)品質(zhì)，其中乳酸菌作為最為安全有效的添加劑常被應用于各類青貯飼料發(fā)酵。作為青貯添加劑的優(yōu)良乳酸菌必須具有較強的附著能力和生長能力[2]。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）作為乳酸菌的一種，最早由Goldin 等從健康人的腸道中分離而得到1 株革蘭式陽性菌[3]。LGG 對胃酸和膽汁具有較強耐受性和對腸道黏膜有較強親和性而被作為益生菌使用[4]。LGG 具有強大的粘附性能，可以清除體內(nèi)病原體粘附，以及產(chǎn)生對食源性病原體拮抗的物質(zhì)[5]。此外，劉玉婷等[6]研究發(fā)現(xiàn)，LGG 能夠利用甘薯廢渣產(chǎn)生大量乳酸。目前有關(guān)利用LGG 發(fā)酵青貯飼料的研究鮮有報道。為此，本試驗采用LGG 作為發(fā)酵菌劑，探究其對全株玉米青貯品質(zhì)及瘤胃降解率的影響，以期為LGG 的推廣應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 全株玉米選用黑龍江省安達市當?shù)厍噘A玉米龍輻單208 號，采用青貯收割機收刈乳熟初期和臘熟末期的全株玉米（按照玉米乳線超過2/3 時），切碎至1.5 cm 左右長度。LGG 購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC），編號CICC 6141。菌株的活化和培養(yǎng)使用乳酸菌培養(yǎng)基（MRS）進行，配方：酪蛋白胨10.0 g，牛肉膏 10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，Tween 80 1.0g，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·H2O 0.05 g，CaCO320.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 6.8，菌株活化后以2%接種量接種于MRS 培養(yǎng)基中，于37℃、200 r/min 條件下擴大培養(yǎng)36 h，收集菌體并調(diào)整濃度≥109CFU/mL，備用。

1.2 試驗設(shè)計 采用單因素試驗設(shè)計，設(shè)對照組（CON）和試驗組（LGG），分別對新鮮收獲全株玉米進行無處理和添加105CFU/g 鮮重的LGG 處理，壓實裝入聚乙烯袋（35 cm×45 cm），每袋約2 kg，每個處理3 個重復，壓實后抽真空封口，25℃左右貯藏。于0、24、36、48 d采集樣品，用于后續(xù)指標測定。原料及青貯后樣品采集參照《飼料采樣》（GB/T 14699.1-2005）進行[7]。

1.3 常規(guī)營養(yǎng)指標測定 干物質(zhì)（DM）、粗灰分（Ash）、粗蛋白質(zhì)（CP）、粗脂肪（EE）等常規(guī)營養(yǎng)含量按照AOAC 方法[8]進行分析；中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量依照Van Soest 分析體系中提供的方法采用纖維分析儀（美國ANKOM Fiber Analyzer）進行測定[9]；淀粉含量利用淀粉總量檢測試劑盒（愛爾蘭 Megazyme K-TSTA）進行測定。

1.4 發(fā)酵指標測定 pH 采用Sartorius PB-10 型酸度計（賽多利斯科學儀器北京有限公司）測定；乙酸（AA）、丙酸（PA）和丁酸（BA）含量采用氣相色譜法（島津GC-2010）測定[10]；氨態(tài)氮（NH3-N）采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定[11]；乳酸（LA）采用高效液相色譜法（Waters-600）測定[12]。本試驗青貯綜合品質(zhì)評定依照青貯飼料評定標準（試行）[13]，將有機酸和NH3-N 結(jié)合，規(guī)定兩者各占50%，然后將有機酸得點除以2 與NH3-N 得點相加，進而得出綜合得點。綜合得點與質(zhì)量評價表顯示，0～20 為極差，20～40 為差，40～60 為一般，60～80 為良好，80～100 為優(yōu)質(zhì)。

1.5 試驗動物及飼養(yǎng)管理 選取3 頭安裝永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛，體重（600±20）kg。每日飼喂2 次（07:00和18:00），自由飲水?；A(chǔ)日糧為全混合日糧（TMR），按照《奶牛營養(yǎng)需要》[14]配制。日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。

1.6 瘤胃降解特性測定 將發(fā)酵48 d 的全株玉米青貯樣品取出，65℃烘48 h，稱取7 g 粉碎經(jīng)1 mm 篩的全株玉米青貯風干樣品，放入孔徑為50 μm，長×寬為12 cm ×8 cm 的尼龍袋內(nèi)，袋口用尼龍繩綁好，每4 個袋綁在一根半軟塑料管上，并用尼龍繩扎好。每頭牛每個時間點設(shè)置2 個平行。晨飼前投入奶牛瘤胃中，分別于體內(nèi)培養(yǎng)24、36、48 h 后取出，在自來水下細流沖洗，直至尼龍袋中流出的水清澈明亮、無味為止。65℃烘干至恒重，稱重并記錄。裝入雙層密封袋保存，進行營養(yǎng)成分分析。瘤胃降解參數(shù)計算模型[15]及有效降解率（ED）計算公式如下：

表1 日糧組成及營養(yǎng)成分（DM 基礎(chǔ)）

式中，p 為在t 培養(yǎng)時間某一營養(yǎng)物質(zhì)的降解率，a 為快速可降解部分；b 為慢速可降解部分；c 為慢速降解部分降解的速率常數(shù)；t 為培養(yǎng)時間點。

式中，a、b、c 同上，k 為待測飼料的瘤胃流通速度（h-1），k 取0.025 h-1[16]。

1.7 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)使用Excel 2010 進行整理，采用SAS 9.2 統(tǒng)計軟件中的ANOVA 過程進行單因素方差分析，平均值的多重比較采用Duncan's 法進行，P＜0.05為差異顯著，結(jié)果用平均值±標準誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 LGG 對全株玉米青貯常規(guī)營養(yǎng)價值的影響 如表2所示，隨著發(fā)酵時間的延長，2 組DM 含量均呈下降趨勢，48 d 時LGG 組顯著高于CON 組。36 d 后LGG 組NDF 和ADF 顯著低于CON 組。與CON 組相比，LGG組CP 含量在48 d 時顯著高于CON 組。2 組淀粉含量均下降，36 d 后LGG 組顯著高于CON 組。青貯過程中EE 含量較低，處理間差異不顯著。

2.2 LGG 對全株玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)影響 如表3 所示，LGG 組各采樣時間的pH 均顯著低于CON 組，NH3-N含量呈上升趨勢，2 組間差異不顯著。如表4 所示，2 組LA 含量均呈上升趨勢，36 d 后LGG 組顯著高于CON 組；AA 和PA 含量較低，24 d 時LGG 組顯著高于CON 組。本試驗無BA 產(chǎn)生。CON 組綜合品質(zhì)得點為59.5，為一般青貯品質(zhì)。LGG 組綜合品質(zhì)得點為68，為良好青貯品質(zhì)。

表2 全株玉米青貯的常規(guī)營養(yǎng)價值（風干基礎(chǔ)） %

表3 全株玉米青貯的pH 和NH3-N 含量

表4 全株玉米青貯的有機酸含量 %

2.3 LGG 對全株玉米青貯瘤胃降解特性影響

2.3.1 LGG 對全株玉米瘤胃降解率影響 如圖1 所示，隨著瘤胃培養(yǎng)時間的延長，DM、CP 和NDF 在奶牛瘤胃中的降解率均快速增加。LGG 組DM 瘤胃降解率在各時間點始終高于對照組，且在8、24、36、48、72 h差異顯著?？赡苁怯捎谠谇噘A過程中添加LGG，改善了全株玉米青貯的發(fā)酵品質(zhì)，改變其養(yǎng)分組成，增加了DM 瘤胃降解率。LGG 組CP 降解率在0～8 h 低于CON 組，在8～72 h 高于對照組，且在16、24、36、72 h 差異顯著。對于NDF 瘤胃降解率，在0～12 h 2 組處于相近水平，在12～72 h LGG 組高于CON 組，且在24、36、48、72 h 后差異顯著。

圖1 LGG 對全株玉米青貯DM、CP 和NDF 瘤胃降解率的影響

2.3.2 LGG 對全株玉米青貯瘤胃降解參數(shù)的影響 如表5 所示，LGG 處理后全株玉米青貯DM 的c 值和ED 均顯著高于CON 組。與CON 組相比，LGG 處理組顯著提高了CP 的a 值、c 值和ED。而LGG 處理則主要提高了NDF 的b 值和ED（P＜0.05）。

表5 LGG 對全株玉米青貯瘤胃降解參數(shù)的影響

3 討 論

3.1 LGG 對全株玉米青貯常規(guī)營養(yǎng)成分影響 營養(yǎng)價值是評價青貯飼料最為重要的指標之一。DM 含量直接反映了底物營養(yǎng)成分的濃度，以往研究發(fā)現(xiàn)在青貯玉米中添加乳酸菌可顯著減少DM 損失[16-17]。本研究中LGG組的DM 含量在發(fā)酵48 d 后顯著高于CON 組，其原因主要為全株玉米發(fā)酵底物充足，添加LGG 促進了青貯前期LA 發(fā)酵，加速了青貯內(nèi)環(huán)境的酸化，進而抑制了有害微生物的活性，從而減少DM 損失[16-17]。本試驗中，LGG 組的ADF 和NDF 含量均低于CON 組，在36 d 后差異顯著。王海林等[18]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌制劑處理顯著降低了去穗玉米結(jié)青貯飼料中NDF 和ADF含量，這與本試驗結(jié)果一致。纖維含量降低可能是由于青貯初期細胞呼吸和酶解過程所導致，也可能是由于添加LGG 增加了青貯中有效乳酸菌數(shù)量，大量乳酸菌發(fā)酵利用部分纖維而導致NDF 和ANF 含量較CON 組有所降低。有研究表明，乳酸菌的發(fā)酵活動是利用半纖維素進行生長繁殖[19]。Li 等[20]報道，在玉米秸稈中接種復合乳酸菌劑CP 含量顯著升高。這與本研究的CP 變化一致，可能是由于LGG 通過降低全株玉米在儲存過程中蛋白質(zhì)的降解作用或抑制腐敗微生物的分解作用，

從而降低了總氮中NH3-N 含量，間接提高了CP 含量。徐煒等[21]使用全株裹包青貯方式制作苜蓿青貯，添加乳酸菌提高了青貯飼料中EE 含量。本試驗中2 組EE含量有略微提高，但差異不顯著，原因可能是微生物對EE 不會產(chǎn)生作用，發(fā)酵造成DM 損失，進而使EE 含量增加，但DM 含量過高導致EE 含量變化較小。

3.2 LGG 對全株玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響 全株玉米是制作青貯的主要原料，只要形成良好的厭氧環(huán)境，青貯就容易成功。但其自身的乳酸菌數(shù)量往往較低，不能在較短時間內(nèi)快速成為優(yōu)勢菌群，從而造成青貯原料營養(yǎng)的損失，且開窖后容易發(fā)生二次發(fā)酵，引起青貯飼料營養(yǎng)的進一步損失，甚至腐爛變質(zhì)。在青貯過程中加入乳酸菌劑可以提高其青貯發(fā)酵品質(zhì)[22]。劉玉婷等[6]研究發(fā)現(xiàn)，添加LGG 能顯著降低青貯飼料的pH 并提高LA含量。本試驗中，隨著發(fā)酵天數(shù)增加，LGG 組與CON組的pH 均下降，且LGG 組CON 組差異顯著，表明添加LGG 能更好地為發(fā)酵提供酸性環(huán)境，進而抑制有害菌生長，保證飼料品質(zhì)。本試驗結(jié)果表明，在青貯第36 天，LGG 組的LA 和AA 含量均高于CON 組，表明添加的LGG 能很好定植，并能在青貯發(fā)酵飼料中起到重要作用。BA 是由腐敗菌和酪酸菌分別分解蛋白質(zhì)、葡萄糖和乳酸而生成的產(chǎn)物，其含量的高低反映青貯飼料品質(zhì)的優(yōu)劣，BA 含量越多，青貯品質(zhì)越差[23]。本試驗在所有樣品中均未檢測到BA，表明青貯品質(zhì)良好。

3.3 LGG 對全株玉米青貯瘤胃降解率的影響 DM 瘤胃降解率是影響反芻動物干物質(zhì)采食量（DMI）的一個重要因素。伴隨著植物成熟，植物的細胞內(nèi)容物增加而可消化細胞壁含量降低，導致干物質(zhì)降解率降低[24]，此外，營養(yǎng)組分的不同以及快速降解或慢速降解部分比例不同，也會導致DM 瘤胃降解率出現(xiàn)差異。本試驗中，在全株玉米樣品中接種LGG 菌株發(fā)酵48 d 后，其DM有效降解率顯著增加，說明LGG 處理不僅提高了發(fā)酵品質(zhì)，同時提高了全株玉米青貯的可降解組分。此外，LGG 處理同樣顯著增加了CP 和NDF 的ED。苗樹君[25]研究指出，利用乳酸菌制劑處理去穗玉米秸青貯可提高其CP 和NDF 的瘤胃有效降解率。張佩華等[26]研究表明，經(jīng)過微生物發(fā)酵處理能夠提高玉米秸稈在瘤胃內(nèi)各個時間點的NDF 降解率。上述研究結(jié)果均與本試驗結(jié)果一致。NDF 的瘤胃降解率是表示粗飼料營養(yǎng)價值的一個重要指標，飼料NDF 組成會影響到NDF 瘤胃內(nèi)的降解率。本研究結(jié)果表明，LGG 處理能夠改善全株玉米青貯中NDF 組分，利于瘤胃降解。

4 結(jié) 論

本試驗中，添加105CFU/g LGG 可提高全株玉米青貯的DM、CP、淀粉含量，降低其NDF 含量，快速降低全株玉米青貯pH，進而改善有機酸和NH3-N 含量等發(fā)酵品質(zhì)，同時也可以提高DM、CP 和NDF 在瘤胃內(nèi)的ED。