田 浪，溫貴蘭*，張升波，楊佰啟，李昌紅，徐 麗，陳 廣，張喜懿

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)實驗室，貴州貴陽 550025；2.貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽 550016）

從江香豬主產(chǎn)于貴州省從江縣，屬于中國稀有微型地方優(yōu)良品種豬，從江香豬具有基因純合、近交不退化、適應(yīng)性強和抗病力強等優(yōu)點，是豬相關(guān)疾病研究的理想動物模型，具有重要的研究價值[1-2]。近年來隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模不斷擴大，豬的各種病毒性疾病發(fā)生也不斷增多，造成重大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重制約了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，研制高效、經(jīng)濟、安全廣譜抗豬病毒性疾病的藥物制劑顯得尤為重要。

干擾素γ（Interferonγ，IFNγ）是由Dijkmans 等于1990 年發(fā)現(xiàn)的一種由NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用[3-4]。豬IFNγ 在豬細(xì)胞免疫和體液免疫有著重要作用，特別在抗豬病毒性疾病方面發(fā)揮獨特作用。有研究報道，豬IFNγ 對豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、豬瘟病毒、口蹄疫病毒、皰疹病毒、星狀病毒等具有明顯的抑制作用[5-7]，在抗豬病毒性疾病的藥物制劑研究中具有廣闊的開發(fā)利用前景[8]。傳統(tǒng)的利用細(xì)菌、酵母、細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)動物藥物蛋白活性低或者成本高昂，隨著分子生物技術(shù)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的快速發(fā)展，用植物生產(chǎn)動物藥物蛋白已成為動物藥物蛋白生產(chǎn)的一個新的研究領(lǐng)域。

本研究利用GenBank 登錄的豬IFNγ 基因序列設(shè)計1 對特異性IFNγ 引物，采用RT-PCR 方法從貴州從江香豬源肝臟組織擴增IFNγ 基因序列，將其克隆至植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌并運用真空滲透法感染新鮮生菜葉片，檢測IFNγ 基因在生菜中表達(dá)情況，以期為從江香

1.1 主要材料 貴州從江香豬源肝臟組織采自貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)綠生源畜牧科技公司香豬生態(tài)福利養(yǎng)殖場；新鮮意大利生菜（Lactuca sativa L.var.ramosa Hort.）購自貴州省花溪區(qū)某農(nóng)貿(mào)市場；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）GZBJ201712 株、Marc 145 細(xì)胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 根癌農(nóng)桿菌LBA4404 感受態(tài)細(xì)胞購自上海維地生物技術(shù)有限公司；RNA 提取試劑盒、乙酰丁香酮、2-（N-嗎啡啉）乙磺胺（MES）、2×Es Taq DNA 聚合酶、HiFiScript cDNA Synthesis Kit 試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、限制性內(nèi)切酶Sam I、限制性內(nèi)切酶Xba I、DL10000 DNA Marker、 DL2000 DNA Marker、GUS 染液試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；豬IFNγ 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；植物雙元表達(dá)載體PBI121 購自上海繼和生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 引物的設(shè)計與合成 參考GenBank 登錄的豬IFNγ基因序列（登錄號：GQ415073），利用DNA Star 軟件設(shè) 計IFNγ 引物 序列：IFNγ-SmaI-F：5′-CCCCCGG GATGAGTTATACAACTTATTTC-3′，IFNγ-XbaI-R：5′-GCTCTAGATTATTTTGATGCTCTCTGGC-3′，預(yù) 擴增片段為501 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 總RNA 提取及cDNA 合成 取貴州從江香豬源肝臟組織于研缽進(jìn)行研磨，12 000 r/min 離心10 min 取上清，根據(jù)RNA 提取試劑盒操作步驟提取總RNA，同時逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成cDNA。cDNA 可直接用于PCR 反應(yīng)或置于-20℃保存。

1.5 從江香豬源IFNγ PCR 擴增 以1.4 逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行IFNγ PCR 擴增，PCR 反應(yīng)體系20 μL：2×Es TaqDNA 聚 合 酶10 μL；IFNγ-SmaI-F 0.5 μL；IFNγ-XbaI-R 0.5 μL；cDNA 2 μL；ddH2O 7 μL。振蕩混 勻 瞬時離心，PCR 擴增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s；5℃退火30 s；72℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；豬源IFNγ 藥用植物蛋白的研究開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

72℃再延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定。

1.6 從江香豬源IFNγ 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 通過生工膠回收試劑盒將1.5 擴增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，回收的PCR產(chǎn)物與植物表達(dá)載體 PBI121 分別用Sma I 和Xba I 進(jìn)行雙酶切，37℃水浴，酶切 4 h，酶切體系（40 μL）：10×Buffer 4 μL；0.1% BSA 2 μL；Sma I 2 μL；Xba I 2 μL；回收產(chǎn)物15 μL；ddH2O 15 μL。用膠回收試劑盒對酶切進(jìn)行純化回收，將回收產(chǎn)物與PBI121 16℃連接4 h，連接體系（10 μL）：回 收 產(chǎn) 物4.5 μL；PBI121 0.5 μL；Solution I 5.0 μL。將重組質(zhì)粒命名為PBI121-IFN γ。

將連接產(chǎn)物（PBI121-IFN γ）和空載體（PBI121-Vec）轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404 中，將轉(zhuǎn)化細(xì)菌接種到含卡那、利福平的LB 平板上，倒置平板于28℃培養(yǎng)過夜；PCR 篩選陽性克隆，將陽性克隆接種于含卡那、利福平的LB 液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜；用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒提取質(zhì)粒DNA，PCR 與酶切鑒定，送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。

1.7 從江豬源IFNγ 在生菜中的表達(dá)與檢測 新鮮生菜去除損傷葉片，用自來水漂洗2～3 次，再用無菌水漂洗2～3 次后超凈工作臺內(nèi)風(fēng)干，參照文獻(xiàn)[9]對從江豬源IFNγ 在生菜中進(jìn)行真空瞬時表達(dá)，在溫度22℃、光照強度2 000 Lx 植物光照培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)2 d（每天光照16 h，黑暗8 h），收取生菜葉進(jìn)行GUS 染色檢測和ELISA 檢測。GUS 染色檢測參照GUS 染液試劑盒說明書進(jìn)行。

取生菜葉加入植物蛋白提取緩沖液（NaCl 8.9 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g；ddH2O 定 容至1 000 mL，4℃保存），冰浴研磨，4℃，12 000 r/min離心10 min，上清液即為生菜蛋白液，ELISA 檢測參照豬IFNγ 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 從江豬源IFNγ 生菜中表達(dá)蛋白抗PRRSV 活性檢測將1.7 提取的蛋白液按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書進(jìn)行。將Marc145 細(xì)胞以每孔100 μL 細(xì)胞液分裝入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h。96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)Marc145 細(xì)胞至單層后，分別加入100 μL 4 倍倍比稀釋的從江豬源IFNγ（PBI121-IFN γ）和空載體（PBI121-Vec），每一稀釋度設(shè)3 個重復(fù)，放入37℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱24 h，棄掉蛋白液。

向接蛋白細(xì)胞孔加入100 TCID50 的PRRSV 病毒液，同時設(shè)置陽性對照組（加病毒不加干擾素）和陰性對照組（不加干擾素和病毒），繼續(xù)培養(yǎng)72 h 并觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathic Effect，CPE）。

2 結(jié)果與分析

2.1 從江香豬源IFNγ PCR 擴增結(jié)果 采用IFN-γ 引物以1.4 合成的cDNA 為模板對IFNγ 基因片段進(jìn)行PCR擴增，擴增結(jié)果顯示，目的條帶約為501 bp，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。

圖1 IFNγ PCR 組織擴增凝膠成像電泳圖

2.2 從江香豬源IFN γ 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 對從江豬源IFNγ 植物表達(dá)載體PBI121-IFNγ 進(jìn)行PCR 與酶切鑒定，凝膠電泳檢測（圖2、3），測序獲得基因序列與GenBank 公布的參考豬源IFNγ 基因序列進(jìn)行相似性對比，發(fā)現(xiàn)同源性均達(dá)到99%。

2.3 從江豬源IFNγ 生菜中表達(dá)與檢測結(jié)果 取含從江香豬IFNγ 質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌感染的生菜葉片進(jìn)行GUS染色，若生菜表達(dá)GUS，在適宜條件下，該酶可將X-Gluc水解生成藍(lán)色產(chǎn)物，用肉眼或在顯微鏡下可觀察到，對照組未見藍(lán)色產(chǎn)物（圖4），初步證明從江豬源IFNγ轉(zhuǎn)入生菜中。取含PBI121-IFNγ 和PBI121-Vec 質(zhì)粒生菜葉片提取生菜蛋白，由表1 可知，從江豬源IFNγ 在生菜中成功表達(dá)。

圖2 PBI121-IFNγ 質(zhì)粒PCR 擴增凝膠成像電泳圖

圖3 PBI121-IFNγ 雙酶切鑒定結(jié)果

圖4 PBI121-IFNγ 生菜中 GUS 染色顯微效果（10×40）

表1 ELISA 檢測生菜中瞬時表達(dá)的從江豬源IFNγ 蛋白

2.4 從江豬源IFNγ 生菜中表達(dá)蛋白抗PRRSV 活性檢測結(jié)果 提取從江豬源IFN-γ 生菜中表達(dá)蛋白按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書進(jìn)行測定，測得蛋白濃度為1.5 mg/mL。細(xì)胞病變抑制法分析表明，從江香豬源PBI121-IFNγ 生菜中表達(dá)蛋白表現(xiàn)出一定的抗病毒活性，IFN-γ 經(jīng)4-6稀釋仍能夠有效抑制100TCID50 的PRRSV 對Marc145 細(xì)胞的致病作用（表2）。

3 討 論

豬干擾素（Interferon，IFN）是機體受到病毒入侵刺激后由干擾素誘生劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種最理想抗病毒藥物蛋白[10]。豬IFN 分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，其中豬IFNγ 為Ⅱ型干擾素，主要通過誘導(dǎo)MHC Ⅰ、MHC Ⅱ類分子的表達(dá)提高抗原提呈能力、參與輔助性 T 細(xì)胞的調(diào)節(jié)、提高單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力、提高嗜中性白細(xì)胞的吞噬能力來發(fā)揮抗病毒能力。豬IFNγ 在豬抗病毒感染的抵御過程中有著重要的作用[11]。本實驗在植物表達(dá)載體的構(gòu)建中，選擇了植物表達(dá)載體常用載體PBI121，在擴增豬IFNγ 基因的特異性引物兩端引入Sma I、Xba I 酶切位點，使得基因片段更易與植物表達(dá)載體PBI121 連接，成功從貴州從江香豬源肝臟組織擴增IFNγ 基因序列，其cDNA 序列長度為501 bp，這一結(jié)果與吳文學(xué)等[12]報道的結(jié)果一致；成功構(gòu)建了從江香豬源IFNγ 植物表達(dá)載體。將構(gòu)建好的江香豬源IFNγ植物表達(dá)載體利用根癌農(nóng)桿菌LBA4404 真空滲透法感染生菜葉片雖獲得了有免疫反應(yīng)性的從江香豬源IFNγ植物蛋白，但從檢測情況來看還是存在表達(dá)量低的問題，與羅雯等[13]通過生菜表達(dá)EV71 抗原存在同樣的問題，分析原因可能受根癌農(nóng)桿菌菌株、物種間基因表達(dá)系統(tǒng)存在差異、豬源IFNγ 在生菜中表達(dá)時間短以及表達(dá)豬源IFNγ 后樣品檢測時間等因素的影響。筆者實驗室已準(zhǔn)備開展利用不同的根癌農(nóng)桿菌菌株來感染不同品種生菜，以期獲得較高的表達(dá)量。

表2 從江豬源IFN-γ 抑制 PRRSV 致病變結(jié)果

豬IFNγ 在豬體內(nèi)表達(dá)量低，因而提取、純化天然的IFNγ 難度大、價格昂貴。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)體外表達(dá)豬IFNγ 的研究已有報道，可以使豬IFNγ 在體外的表達(dá)且具有抗病毒活性。本實驗采用細(xì)胞病變抑制實驗檢測從江香豬源IFNγ 生菜中表達(dá)蛋白抗病毒活性，IFN-γ經(jīng)4-6稀釋仍能夠有效抑制100TCID50 的PRRSV 對Marc145 細(xì)胞的致病作用，表明對PRRSV 增殖具有較強抑制作用，與梁望旺等[11]利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)豬IFNγ、張瑞華等[14]利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)豬IFNγ、鐘魯龍[15]利用家蠶幼蟲體內(nèi)表達(dá)豬IFNγ 的抗病毒活性研究結(jié)果一致，為從江香豬源IFNγ 藥用植物蛋白的研究開發(fā)提供參考依據(jù)。