覃媛鈺，陳滇黔，羅華倫，吳 磊，張依裕*

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550025；2.高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550025）

1，4，5-三磷酸肌醇受體（Inositol 1，4，5-Trisphosphate Receptors，IPTRs，IP3Rs）是廣泛分布于動物和人類各組織細(xì)胞中的一類跨膜蛋白，它是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上調(diào)節(jié)鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的一個IP3-門控通道[1]。目前已鑒定了3 種亞型，即IP3R1、IP3R2 和IP3R3[2]。IP3Rs在Ca2+信號通道中發(fā)揮著重要作用，用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的Ca2+主要來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)中的內(nèi)部儲存庫，其中肌醇-1，4，5-三磷酸受體或蘭尼堿受體調(diào)節(jié)Ca2+的釋放。大量研究顯示，IP3R1 與腫瘤、休克、肥胖、彌漫性軸索損傷等疾病相關(guān)[3-5]。Chai 等[6]報道，DEX 介導(dǎo)的IP3R1 通過糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件與近端IP3R1 基因啟動子中GRE 的相互作用來影響豬肌肉細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的不平衡。Wang 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子-α能增加GMC 中IP3R1 基因的表達(dá)，并增加特異性蛋白1對IP3R1 基因啟動子的Ca2+釋放和結(jié)合活性。Zhao 等[8]評估了IP3R1 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能，發(fā)現(xiàn)其參與炎癥損傷期間Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)過程。目前，通過多個數(shù)據(jù)庫檢索證明IP3R1 基因與人類疾病密切相關(guān)，但關(guān)于IP3R1 基因在畜禽生產(chǎn)性能及其調(diào)控機(jī)制方面的報道極為少見。鈣質(zhì)沉積對蛋殼的構(gòu)造起決定性作用，因此，探明機(jī)體內(nèi)與Ca2+信號通路有關(guān)的基因?qū)Φ皻て焚|(zhì)的形成有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過探究鴨IP3R1 基因變異、表達(dá)對蛋鴨蛋殼品質(zhì)的影響，旨在為進(jìn)一步探明該基因在家鴨中的生物學(xué)功能和評價其多態(tài)性的育種價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取單籠飼養(yǎng)、健康無病的產(chǎn)蛋中期（43周齡）三穗鴨54 只，逐只收集產(chǎn)蛋記錄，翅靜脈采血1～1.5 mL，-20℃保存待用；采血后屠宰6 只，無菌采取肺、心臟、肌胃、胸肌、肝、胰腺、腎、腺胃、子宮、小腸和脾臟11 個組織，-80℃冰箱保存待用。

1.2 蛋殼品質(zhì)檢測、基因組DNA、總RNA 提取及cDNA合成 蛋殼品質(zhì)測定參照《家禽生產(chǎn)學(xué)》[9]中的方法執(zhí)行。所有三穗鴨個體的基因組DNA 按照QlAamp DNA Mini Kit（50）提取試劑盒（購于天根生物科技有限公司）操作說明書進(jìn)行提取，總RNA 提取按照Trizol 試劑盒（購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）操作說明書的步驟對每個個體的每個組織進(jìn)行提取，采用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸濃度測定儀檢測后稀釋成100 ng/μL。cDNA 合成按照2×T5Fast qPCR Mix（SYBR Green I）Master Mix（購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）操作說明進(jìn)行合成。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫登錄鴨IP3R1 基因序列（NW_004677051.1）和鴨β-Actin 基因序列（EF667345），運(yùn)用Primer Premier 5.0 設(shè)計3 對引物：P1 引物擴(kuò)增區(qū)域g.256734-g.257578，位于第18 內(nèi)含子內(nèi)；P2 引物擴(kuò)增區(qū)域g.253551-g.254386，位于部分外顯子14 到部分內(nèi)含子15；目的基因表達(dá)引物IE 和內(nèi)參基因表達(dá)引物AE，序列信息見表1，由上海英濰捷生物技術(shù)公司合成。

1.4 IP3R1 基因表達(dá)檢測 采用常規(guī)PCR 檢測IP3R1 基因和β-Actin 基因表達(dá)引物的特異性，反應(yīng)總體積20 μL：RNase-Free Water 7 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上游引物、下游引物和DNA（10 pmol/μL）各1 μL；PCR 反應(yīng)程 序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，30 個循環(huán)，采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

以β-Actin 基因作為內(nèi)參對照，實(shí)時熒光定量PCR 檢測IP3R1 基因在各組織中的表達(dá)程度。實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×Ts Fast qPCR Mix 5 10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各0.8 μL，H2O 補(bǔ)足20 μL。每個樣品設(shè)置3 個重復(fù)，IP3R1 基因反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60.0℃退火延伸30 s，共39 個循環(huán)。

1.5 IP3R1 基因多態(tài)性檢測 對IP3R1 基因的多態(tài)性進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)體系同1.4，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性8 min；94℃變性50 s，退火50 s，72℃延伸60 s，35 個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝電泳檢驗(yàn)，切膠回收送上海英濰捷生物技術(shù)公司進(jìn)行測序。

1.6 統(tǒng)計分析 應(yīng)用生物分析軟件DNAstar 中的EditSeq和MegAlign 程序，結(jié)合Chromas 軟件對測序結(jié)果序列進(jìn)行比對，查找SNP 位點(diǎn)，計算每個位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)（Ne）、遺傳雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）和Hard-Weinberg 平衡；同時查找其SNP 位點(diǎn)用Excel 2013 處理分析數(shù)據(jù)，采用公式2-△△Ct計算IP3R1 基因在各個組織中的相對表達(dá)量；采用SPSS 16.0 軟件中一般線性模型分析IP3R1 基因各多態(tài)位點(diǎn)與蛋品質(zhì)的顯著性差異，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 IP3R1 基因表達(dá)引物和多態(tài)性引物的特異性檢測由圖1 和圖2 可知，4 對引物的PCR 產(chǎn)物條帶與預(yù)期片段相符，清晰明亮，通過測序表明目的片段與GenBank登錄序列相一致，可用于基因的表達(dá)和多態(tài)性分析。

圖1 IE 和AE 表達(dá)引物PCR 檢測

圖2 P1 和P2 多態(tài)引物PCR 檢測

表1 引物序列

2.2 IP3R1 基因?qū)崟r熒光定量PCR 檢測 由圖3 和圖4可見，分別擴(kuò)增β-Actin 和IP3R1 基因的表達(dá)引物AE和IE 的熒光定量PCR 檢測結(jié)果表現(xiàn)出擴(kuò)增曲線、熔點(diǎn)曲線和熔解峰結(jié)果優(yōu)良，可用于實(shí)時熒光定量分析。

如圖5 顯示，IP3R1 基因mRNA 在產(chǎn)蛋中期三穗鴨11 個組織中均存在不同程度的表達(dá)，除胸肌和肌胃、子宮和腺胃、小腸和脾臟、 胰腺和肝臟的mRNA 表達(dá)量差異不顯著外，其他各組織間mRNA 表達(dá)量達(dá)到顯著差異（P＜0.05），其中肺、心臟、肌胃和胸肌呈高度特異表達(dá)，肝臟、胰腺、腎臟呈中度表達(dá)，其他組織呈相對低的表達(dá)豐度，總體表達(dá)量的順序依次為肺＞心臟＞肌胃＞胸?。靖危疽认伲灸I＞腺胃＞子宮＞小腸＞脾臟。

2.3 IP3R1 基因多態(tài)性檢測 由圖6 可知，在IP3R1 基因內(nèi)含 子 14 發(fā) 現(xiàn)g.253779 T＞C 、g.253967 C＞A 2 個SNPs，其中g(shù).253779 T＞C產(chǎn)生TT、TC和CC 3種基因型；g.253967 C＞A 產(chǎn)生CC、CA 和AA 3 種基因型。在IP3R1 基因內(nèi)含子18 發(fā)現(xiàn)g.257089G＞A、g.257159C＞G 、g.257237T＞G共3 個SNPs，其中g(shù).257089G＞A，檢測到GG 和GA 2 種基因型；g.257159C＞G，檢測到CC 和CG 2 種基因型；g.257237T＞G，檢測到TT、TG 和GG 3 種基因型。

2.4 IP3R1 基因多態(tài)位點(diǎn)遺傳多樣性分析 由表2 可知，g.253779 T＞C、g.253967 C＞A、g.257089G＞A、g.257159C＞G和g.257237T＞G 的優(yōu)勢基因型分別為TC、CC、GA、CC和TT，其頻率分別為0.389、0.481、0.722、0.611 和0.389，優(yōu)勢等位基因分別為T、C、G、C 和T，其頻率分別為0.528、0.666、0.639、0.806 和0.556；5 個SNPs 位點(diǎn)的PIC 均在0.25～0.50，表明5 個多態(tài)位點(diǎn)均為中度多態(tài)位點(diǎn)；卡方（χ2）檢驗(yàn)表明，除g.257089G＞A 位點(diǎn)外，其于4 個SNPs 位點(diǎn)的基因型分布均未偏離Hard-Weinberg 平衡。

2.5 IP3R1 基因多態(tài)位點(diǎn)與鴨蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析如表3 結(jié)果顯示，g.257159C＞G 位點(diǎn)對蛋重和蛋殼重的影響均達(dá)極顯著和顯著水平，CC 基因型個體的蛋重和蛋殼重極顯著或顯著低于CG 基因型個體；g.257237T＞G位點(diǎn)對蛋形指數(shù)的影響達(dá)顯著水平，TG 基因型個體的蛋形指數(shù)顯著低于TT 和GG 基因型個體；其他各位點(diǎn)不同基因型蛋殼性狀指標(biāo)間的差異未達(dá)到顯著水平。

圖3 AE 引物熒光定量PCR 檢測

圖4 IE 引物熒光定量PCR 檢測

圖5 IP3R1 基因組織表達(dá)譜

圖6 IP3R1 基因測序比對

表2 IP3R1 基因SNPs 遺傳多樣性

3 討 論

優(yōu)質(zhì)的蛋殼品質(zhì)不僅能夠減少鴨蛋在加工過程中的損失，更重要的是可以有效防止細(xì)菌污染蛋品。蛋殼主要由碳酸鈣結(jié)晶構(gòu)成，因此在整個蛋殼形成過程中，Ca2+作為生物體內(nèi)重要的信號分子發(fā)揮著重要作用[10]。目前，對IP3R1 的報道主要集中在人類疾病和小鼠模型上[11-13]，而IP3R1 在畜禽上的研究相對較少。Sun 等[14]報道，cADPR 通過IP3Rs 通道激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上貯存的Ca2+釋放到細(xì)胞質(zhì)進(jìn)而影響家禽蛋品品質(zhì)。Liu等[15]報道，G 蛋白偶聯(lián)受體P2RY2 在生產(chǎn)不同蛋殼強(qiáng)度的蛋雞子宮組織內(nèi)差異表達(dá)，可能通過激活PLC觸發(fā)IP3，激活I(lǐng)P3Rs 介導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+釋放。PLC 作為IP3R1 的上游基因催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸裂解成二?；视秃虸P3，其擴(kuò)散到胞質(zhì)溶膠中并激活其受體通道IP3R[16]。Zhang 等[17]研究表明，IP3Rs 對雞的蛋殼厚度和強(qiáng)度有顯著影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IP3R1 基因在三穗鴨在不同組織之間的表達(dá)差異較大，其中在鴨的肺、心臟、肌胃和胸肌中為高度特異表達(dá)，肝臟、胰腺、腎呈中度表達(dá)，其他組織呈相對低的表達(dá)豐度，推測IP3R1 的特異性表達(dá)可能導(dǎo)致該基因在鴨機(jī)體各組織中的功能特異性。前人研究顯示[18]，IP3Rs 是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)主要存在的亞型，在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)均有表達(dá)，目前未檢索到IP3R1 基因的組織表達(dá)。本研究對三穗鴨IP3R1 基因的g.256734～g.257578 和g.253551～g.254386區(qū)域進(jìn)行SNPs 檢測，共查找出5 個SNPs 位點(diǎn)13 個基因型，5 個SNPs 位點(diǎn)優(yōu)勢基因型分別為TC、CC、GA、CC 和TT，其頻率分別為0.389、0.481、0.722、0.611和0.389，PIC 均在0.25～0.50，為中度多態(tài)位點(diǎn)，表明三穗鴨的突變位點(diǎn)均有較穩(wěn)定的遺傳力，具有育種選擇潛力；g.257089G＞A 位點(diǎn)嚴(yán)重偏離了Hardy-Weinberg平衡，這與三穗鴨的長期人工選育有關(guān)，而g.257089G＞A位點(diǎn)的基因型GA 高于其他幾個位點(diǎn)的基因型，更好地驗(yàn)證了GA 基因型的優(yōu)勢性。其余4 個SNPs 位點(diǎn)的基因型分布均未偏離Hard-Weinberg 平衡，說明其位點(diǎn)可能經(jīng)歷了長期育種選擇后重新達(dá)到了Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，很好地適應(yīng)了產(chǎn)地的生活環(huán)境，形成了優(yōu)質(zhì)的鴨品種。

表3 IP3R1 基因5 個SNPs 位點(diǎn)與三穗鴨蛋品質(zhì)的關(guān)聯(lián)性分析

Duan 等[19]選擇了15 個離子轉(zhuǎn)運(yùn)基因中的99 個SNPs 進(jìn)行基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ATP2A3、ITPR1、SLC8A3、SCNN1a 可以作為蛋殼質(zhì)量遺傳改良的基因。馮靜等[20]研究指出，蛋重和蛋殼品質(zhì)是衡量蛋殼品質(zhì)的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，g.257159C＞G 位點(diǎn)對蛋殼重的影響達(dá)到顯著水平，其CG 基因型更有利于三穗鴨蛋殼的形成；g.257237T＞G 位點(diǎn)對蛋形指數(shù)的影響達(dá)到顯著水平，正常鴨蛋的蛋形指數(shù)一般在1.3～1.4，適宜的蛋形指數(shù)能夠提高孵化率和減少破損[21-22]，因此在育種選擇時可將TT 和GG 基因型作為主要的優(yōu)勢基因型，盡可能選擇蛋形指數(shù)優(yōu)良的品系，以保持三穗鴨的優(yōu)良遺傳性狀。綜合研究結(jié)果可知，在5 個SNPs 位點(diǎn)中，g.257159C＞G 和g.257237T＞G 的突變對蛋形指數(shù)、蛋重和蛋殼重有顯著性影響，說明這2 個位點(diǎn)對鴨蛋殼品質(zhì)的質(zhì)量有重要意義，可將這2 個位點(diǎn)作為三穗鴨蛋殼品質(zhì)的分子輔助選擇的候選標(biāo)記位點(diǎn)，也為今后選育高質(zhì)量的產(chǎn)蛋鴨提供科學(xué)依據(jù)。為獲得真實(shí)可靠的分子遺傳標(biāo)記，下一步還應(yīng)該擴(kuò)大篩查范圍、增加研究的樣本數(shù)，觀察IP3R1 基因其他區(qū)段的多態(tài)性是否也對蛋殼形成有一定影響。