宋玉坤，張 博，吳 昊，王 輝，郜 宇，努日比婭姆·買買提托合提，趙 茜，王旭光，劉國世，阿布力孜·吾斯曼*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；3.徽商生態(tài)牧業(yè)有限公司，新疆吐魯番 838100）

冷凍保存技術(shù)作為精液長期保存方法，可以提高種公羊的利用率、隔絕疾病擴(kuò)散和保種[1]，但由于綿羊精子不耐凍，解凍后常常出現(xiàn)精子活率、頂體完整率、受胎率降低等，導(dǎo)致綿羊精液冷凍保存技術(shù)未能在生產(chǎn)中廣泛推廣[2]。綿羊的精液冷凍保存技術(shù)研究已取得了許多重要成果，但未得到突破性進(jìn)展。吐魯番黑羊是新疆吐魯番托克遜縣農(nóng)牧民長期自然選育形成的優(yōu)質(zhì)地方品種，其對炎熱干旱環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)且羔羊肉品質(zhì)優(yōu)良[3]。近幾年吐魯番黑羊數(shù)量急劇減少，優(yōu)化吐魯番黑羊精液冷凍保存技術(shù)顯得尤為重要。

十二烷基硫酸鈉（SDS）是一種表面活性劑，可作為精子冷凍稀釋液保護(hù)劑。在稀釋液中添加SDS 以提高精液冷凍保存效果的研究已在多種動物上開展，解凍后的精液品質(zhì)得到改善[4-5]，而在綿羊精液冷凍稀釋液中添加SDS 的研究尚未見報道。本研究比較了在不同稀釋液配方Tris-葡萄糖-檸檬酸鈉和蔗糖-葡糖糖-檸檬酸鈉為基礎(chǔ)液中添加不同濃度SDS 對吐魯番黑羊精液冷凍效果的影響，并與法國卡蘇商品化OPtidyl 稀釋液做對照，進(jìn)而篩選出適合吐魯番黑羊精液冷凍稀釋液配方和SDS 添加濃度，為綿羊精液冷凍保存技術(shù)的推廣及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 實(shí)驗(yàn)羊?yàn)橥卖敺锌诉d縣徽商生態(tài)牧業(yè)有限公司的性欲正常、體況健壯、2～4 歲的5 只吐魯番黑羊種公羊。

1.2 試劑及配制

1.2.1 主要試劑 十二烷基硫酸鈉購于法國mofa，青霉素和鏈霉素購自Amresco 公司，其余藥品均采購自Sigma 公司。

1.2.2 稀釋液配制 實(shí)驗(yàn)采用3 種稀釋液，Tris-葡萄糖-檸檬酸鈉為I 液，蔗糖-葡糖糖-檸檬酸鈉為II 液，法國卡蘇商品化OPtidyl 稀釋液（REF:020996，500 mL）做對照為III 液。I 液和II 液均為一步法稀釋，成分見表1。首先配制基礎(chǔ)液，高壓消毒后過濾，加20%（v/v）新鮮卵黃，青、鏈霉素各10 萬單位，添加6%（v/v）甘油，配制成冷凍稀釋液。III 液為2.5×濃儲，用超純水進(jìn)行稀釋使用。

1.2.3 熒光染料配制 JC-1 為5 mg/mL，生理鹽水稀釋8 倍后約為1 mmol/mL；PI 為1 mmol/mL，F(xiàn)ITC-PNA為0.1 mg/mL。

1.3 精液采集 采用常規(guī)的假陰道法采集精液，每只公羊每天采精2 次，采完后迅速送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行初步的精液品質(zhì)檢查，精液的顏色、氣味和密度正常，精子活率在70%以上才可用于實(shí)驗(yàn)。將檢測合格后的公羊精液混合均勻，放到滅菌試管中備用。

1.4 精液處理 精液常規(guī)檢查后，在30℃環(huán)境下用不同稀釋液進(jìn)行6 倍等溫稀釋。隨即將精液平均分9 份，分別裝在15 mL 滅菌離心管中，用3 種冷凍稀釋液分別添加不同濃度的SDS（0、1%、2%），共9 管。把精液與稀釋液輕輕混勻后分裝到0.25 mL 細(xì)管中，用封口粉封口，裹上8～10 層紗布放入4℃冰箱，1～1.5 h 后溫度降至7～10℃放冰袋降溫，3 h 降溫至4℃。

1.5 精液冷凍保存 將自制碼架置于泡沫盒中，低溫溫度計探頭與碼架相連，且探頭與細(xì)管處于同一高度，往泡沫盒中倒入液氮，使低溫溫度計顯示溫度在-80～-120℃，此時碼架與液氮面距離約3 cm。將平衡好的細(xì)管精液攤放在碼架上，熏蒸8 min 后投入液氮。然后裝到指型管放到紗布袋內(nèi)，轉(zhuǎn)移到液氮罐中。

1.6 精液解凍 從液氮罐中取出細(xì)管凍精，迅速放到37℃解凍杯中15 s，隨后取出細(xì)管精液用于樣品檢測。

1.7 精液品質(zhì)檢測 用微量移液槍取少量平衡后或解凍后的精液滴到精子計數(shù)板上，待到精子鋪滿計數(shù)槽，將計數(shù)板置于精子分析儀上，用精子分析系統(tǒng)（CASA）進(jìn)行常規(guī)分析。

1.8 精液質(zhì)膜完整性檢測 根據(jù)CASA 常規(guī)分析后，篩選出在試驗(yàn)組中冷凍復(fù)蘇后精子活力參數(shù)最佳的4組，進(jìn)行精子的質(zhì)膜完整性測定。采用HyPo-osmotic swelling test 方法檢測精子質(zhì)膜的完整性，按照精液與低滲液1∶10 的比例37℃混合孵育30 min，孵育結(jié)束后取10 μL 滴片，200×相差顯微鏡下觀察，精子尾部形成一個圓環(huán)則為精子質(zhì)膜完整的精子，沒有形成圓環(huán)的則為質(zhì)膜損傷的精子。

1.9 精液流式細(xì)胞儀檢測 選取上述4 個樣品，25℃孵育3 h 后離心去除上清液，再用PBS 稀釋，每組再取3份十分之一的精液用PBS 稀釋至1 000 μL，分別加入PI 和FITC-PNA 用于檢測頂體完整率，加入JC-1 用于檢測線粒體膜電位（MMP）。其中加入JC-1 后37℃避光孵育30 min，其他處理孵育5 min。孵育完畢后上流式細(xì)胞儀檢測。

1.10 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用Excel 2016 進(jìn)行整理，SPSS 23.0 軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)和方差分析，結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。每組數(shù)據(jù)重復(fù)6 次實(shí)驗(yàn)以上。

2 結(jié) 果

2.1 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍前后運(yùn)動形態(tài)的影響 如表2 所示，各組之間在平衡后活力、畸形率、直線運(yùn)動速率差異不顯著。冷凍后I 液1% SDS 組精子活率最高，與I 液2% SDS 組精子活率無差異，顯著高于其他7 組。冷凍后III 液1% SDS 組畸形率顯著低于II液0% SDS 組、II 液2% SDS 組 和III 液2% SDS 組，與其他組差異不顯著。冷凍后I 液1% SDS 組的直線運(yùn)動速率最高，顯著高于I 液0% SDS 組、II 液2% SDS組和III 液0% SDS 組，與其他組差異不顯著。綜合形態(tài)運(yùn)動指標(biāo)，I 液1% SDS 組、I 液2% SDS 組、II 液1%SDS 組和III 液1% SDS 組精液冷凍效果較好，可作進(jìn)一步檢測以確定最優(yōu)冷凍配方。

2.2 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍后質(zhì)膜完整性的影響 表3 顯示，I 液1% SDS 組質(zhì)膜完整率顯著高于I液2% SDS 組和II 液1% SDS 組，與III 液1% SDS 組無顯著差異。

表1 吐魯番黑羊精液冷凍稀釋液成分

表2 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍前后形態(tài)運(yùn)動的影響

表3 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍后質(zhì)膜完整性的影響（n=6） %

2.3 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍后頂體完整率的影響 如表4 所示，I 液1% SDS 組的頂體完整活精子比率顯著高于II 液1% SDS 組，與其他2 組沒有顯著差異。各組的活精子頂體完整率沒有顯著差異。I 液1% SDS組的頂體完整率與III 液1% SDS 組無顯著差異，但高于I 液2% SDS 組和II 液1% SDS 組（P＜0.05）。

表4 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍后頂體完整率的影響（n=6） %

2.4 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍后線粒體膜電位的影響 由表5 可知，I 液1% SDS 組高線粒體膜電位精子比率顯著高于II 液1% SDS 組，與其他2 組沒有顯著差異。

表5 不同稀釋液添加SDS 對精液冷凍后線粒體膜電位的影響（n=6） %

3 討 論

3.1 冷凍稀釋液對吐魯番黑羊精液冷凍效果的影響 精液冷凍稀釋液主要作用是改善精子外環(huán)境的滲透壓與pH，防止精子細(xì)胞內(nèi)成分流失，為精子運(yùn)動提供能量，降低高度稀釋對精子產(chǎn)生的損傷并起到冷凍保護(hù)作用，給精子適應(yīng)外界環(huán)境創(chuàng)造有利條件[6]。從發(fā)現(xiàn)甘油可以作為冷凍保護(hù)劑之后，畜禽精液冷凍技術(shù)的研究和應(yīng)用工作廣泛開展[7]。由于冷凍過程中帶來的機(jī)械損傷，冷凍解凍后的精液仍有部分精子死亡和失去運(yùn)動能力[8]。因此，冷凍后精子活率和膜結(jié)構(gòu)完整性對解凍復(fù)蘇后的受精能力至關(guān)重要[9]，所以人們一直在探索有效的稀釋液成分來提高冷凍效率。目前研究報道，Tris 具有良好的滲透性和緩沖性，并且添加適量濃度時對精子毒性較低，冷凍稀釋液中添加Tris 能提高精子活力以及頂體完整率[10]。綿羊的精液具有相對較高代謝水平的特殊性，在有氧環(huán)境下可以致使精子氧化導(dǎo)致中毒死亡[11]。葡萄糖、果糖、蔗糖以及乳糖等均可通過提高冷凍復(fù)蘇后質(zhì)膜穩(wěn)定性保護(hù)精子[12-13]。非滲透性保護(hù)劑蔗糖可與精子質(zhì)膜直接發(fā)生反應(yīng)，降低冷凍過程中冰晶對精子造成的損傷[14]。本實(shí)驗(yàn)表明，添加相同濃度的SDS 時，Tris-葡萄糖-檸檬酸鈉冷凍稀釋液冷凍-解凍后精子活率最高，精子畸形率和運(yùn)動速率也均優(yōu)于蔗糖-葡糖糖-檸檬酸鈉和OPtidyl 稀釋液組。3 種稀釋液添加1%SDS時，Tris-葡萄糖-檸檬酸鈉組在質(zhì)膜完整性、頂體完整率和高線粒體膜電位上顯著優(yōu)于蔗糖-葡糖糖-檸檬酸鈉組，與OPtidyl 稀釋液組沒有顯著差異。造成I 液和II 液效果差異性的原因在于Tris 是滲透性保護(hù)劑，使精子能更好地耐受低滲和高滲；而蔗糖是非滲透性，當(dāng)稀釋液的滲透壓和pH 不穩(wěn)定時，可能就會造成精子的損傷以及死亡。

3.2 添加SDS 對吐魯番黑羊精液冷凍效果的影響 SDS主要作用是防止低溫對精子的機(jī)械損傷，對精子膜結(jié)構(gòu)有保護(hù)、修補(bǔ)作用，能夠顯著提高冷凍解凍后精子活率、頂體完整率及質(zhì)膜完整率[15]。在稀釋液中添加卵黃可以維持稀釋液的膠體滲透壓，保護(hù)精子質(zhì)膜完整性和頂體膜減緩陽離子肽造成的損傷[16]。SDS 與卵黃類脂協(xié)同完成對質(zhì)膜及頂體膜結(jié)構(gòu)的保護(hù)，減少頂體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的滲透和流失[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在3 種冷凍稀釋液中添加1%SDS 時，精液冷凍解凍后的精子活率、畸形率和直線運(yùn)動速率均顯著優(yōu)于不添加SDS 組和添加2%SDS 組；Tris-葡萄糖-檸檬酸鈉冷凍稀釋液添加1% SDS 組質(zhì)膜完整性和頂體完整率較2%SDS 組均顯著提高，添加1%SDS 組的高線粒體膜電位精子比率與2%SDS 組沒有顯著差異，但有提高趨勢。SDS 是一種對細(xì)胞微毒的陰離子表面活性劑，當(dāng)添加2%SDS 時，過量的SDS 容易對精子造成損傷，進(jìn)而降低冷凍效果，所以II 液和III 液中添加2%SDS 解凍后精子活率低于不添加和添加1%SDS 組。綜合各指標(biāo)，在稀釋液中添加1%SDS 對綿羊精液冷凍效果最佳，這與李新紅等[18]在藍(lán)狐冷凍稀釋液中添加SDS 時所得的結(jié)果相似。在綿羊凍融精子保護(hù)效果方面，SDS 與卵黃之間的劑量存在相關(guān)性，二者之間充分混合后具有協(xié)同作用。SDS 起的保護(hù)作用可能是通過卵黃間接實(shí)現(xiàn)的，經(jīng)過SDS 乳化后的卵黃，分解出卵黃中更多的類脂物，這些類脂物更易進(jìn)入精子質(zhì)膜，從而更有效保護(hù)凍融精子的膜結(jié)構(gòu)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)條件下，在Tris-葡萄糖-檸檬酸鈉冷凍稀釋液中添加1% SDS 可以顯著提高吐魯番黑羊的精液冷凍保存效果。