李秋亞，孫 婷，王東凱

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銀杏內(nèi)酯B多晶型的制備、表征與性質(zhì)研究

李秋亞1,2，孫 婷2，王東凱1*

（1. 沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016；2. 沈陽沃森藥物研究所，遼寧 沈陽 110016）

研究銀杏內(nèi)酯B多晶型的制備、表征與性質(zhì)。對銀杏內(nèi)酯B進行多晶型篩查，并制備了6種不同的晶型（A～F型），分別采用單晶X射線衍射法（SXRD）、差示掃描量熱法（DSC）、熱重分析法（TG）對樣品進行表征分析，并進一步研究銀杏內(nèi)酯B不同晶型對谷氨酸導致的PC12細胞損傷保護作用的優(yōu)劣。各晶型PXRD、DSC、TG圖譜均存在明顯的差異，可用上述方法進行鑒別。無溶劑晶型F型為穩(wěn)定晶型，通過細胞實驗證明了晶型F對PC12細胞的保護作用更強。銀杏內(nèi)酯B晶型F為優(yōu)勢用藥晶型。

藥劑學；多晶型；晶型制備；表征分析；銀杏內(nèi)酯B

藥物的分子排列結(jié)構(gòu)不同產(chǎn)生的兩種或兩種以上晶格的結(jié)構(gòu)，形成了多種晶型的現(xiàn)象，這種藥物通常稱之為多晶型藥物。由于結(jié)構(gòu)導致的理化性質(zhì)的差異，不同的晶型在外觀、顏色、硬度、密度、溶解度、熔點以及溶出率等方面存在顯著的差異，以此導致了藥物在安全性、穩(wěn)定性以及療效方面的不同[1-4]。

銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B）來源于銀杏葉，分子式為C20H24O10，原料是白色結(jié)晶性粉末。銀杏內(nèi)酯B屬銀杏二萜內(nèi)酯類化合物，有抗血小板聚集[5]、對缺血損傷的保護[6-7]、抗動脈粥樣硬化及抗炎[8-9]等藥理作用，主要用于缺血性心腦血管疾病的治療。

銀杏內(nèi)酯B存在多晶型現(xiàn)象，作者通過溶劑去除法、溫度轉(zhuǎn)晶法等共發(fā)現(xiàn)6種晶型物質(zhì)。采用粉末X射線衍射法（PXRD）、差示掃描量熱法（DSC）和熱重分析法（TG）等不同晶型分析技術(shù)對獲得的晶型物質(zhì)進行表征分析研究，并通過研究銀杏內(nèi)酯B不同晶型對谷氨酸導致的PC12細胞損傷的保護作用，比較銀杏內(nèi)酯B不同晶型的藥理作用，以明確銀杏內(nèi)酯B的優(yōu)勢藥用晶型。

1 儀器與材料

D8 AdvanceX射線衍射儀、SMART APEX-Ⅱ單晶X射線衍射儀(德國Bruker-AXS公司)，TGA 8000熱重分析儀（美國PerkinElmer公司），SmarVapor RE-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國SmarVapor公司），VAC真空干燥箱、HH電熱恒溫鼓風干燥箱（廣東宏展科技有限公司）,1000TH藥品穩(wěn)定性實驗箱（北京蘭貝石恒溫技術(shù)很有限公司），UPH-IV超純水機（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

谷氨酸、DMSO、MTT（美國Sigma公司），LDH試劑盒（南京建成生物公司），F(xiàn)ura-2 /AM、RIPA裂解液、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（碧云天生物公司），高分化PC12細胞（中科院上海細胞所）。

2 方法與結(jié)果

2.1 銀杏內(nèi)酯B多晶型的制備

2.1.1 晶型A的制備

稱取樣品50 mg，在50 ℃的條件下溶于1 mL乙腈中，向溶液中緩慢滴加1 mL水，冷卻至室溫析晶，靜置1 d后抽濾，濾餅于40 ℃真空干燥4 h，獲得晶型A樣品。

2.1.2 晶型B的制備

稱取樣品50 mg加至2 mL甲醇中，置于40 ℃水浴中加熱待樣品完全溶解后，使用旋蒸儀快速去除溶劑，設定溫度35 ℃、氣壓90 kPa、轉(zhuǎn)速90 r?h-1，所得固體物質(zhì)即晶型B樣品。

2.1.3 晶型C的制備

稱取樣品50 mg加至4 mL二氧六環(huán)中，置于40 ℃水浴中加熱待樣品完全溶解后，使用旋蒸儀快速去除溶劑，設定氣壓90 kPa 、轉(zhuǎn)速90 r?h-1、溫度35 ℃，所得固體物質(zhì)即晶型C樣品。

2.1.4 晶型D的制備

稱取樣品50 mg加至3 mL DMSO中，置于40 ℃水浴中加熱完全溶解后，緩慢加入1 mL水，冷卻至室溫析晶，靜置2 d后抽濾，濾餅于40 ℃真空干燥4 h，獲得晶型D樣品。

2.1.5 晶型E的制備

稱取樣品50 mg加至2 mL吡啶中，置于40 ℃水浴中加熱完全溶解后，緩慢加入1 mL水，冷卻至室溫析晶，靜置1 d后抽濾，濾餅于40 ℃真空干燥4 h，獲得晶型E樣品。由于晶型E樣品不穩(wěn)定，所以后面的研究未對該晶型進行測定。

2.1.6 晶型F的制備

稱取樣品100mg，放入電熱恒溫鼓風干燥箱中，設定溫度為200℃，靜置30 min，獲得晶型F樣品。

2.2 五種晶型樣品的物質(zhì)狀態(tài)表征

采用PXRD、DSC、TG等不同原理的分析方法，對實驗中獲得的銀杏內(nèi)酯B 5種不同的晶型進行表征分析，結(jié)果4種晶型樣品為含有結(jié)晶溶劑物質(zhì)，只有1種為無結(jié)晶溶劑物質(zhì)。

2.2.1 PXRD法表征

取上述制得的晶型A～D和F共5種樣品，分別稱量50 mg，使用粉末X射線衍射儀測定。使用的X射線發(fā)生器：CuKa，40 kV，150 mA。掃描范圍2= 3°～80°，掃描速度8°?min-1，掃描步長為0.02°，接收狹縫RS = 0.15 mm。5種樣品的PXRD測定結(jié)果見圖1。

結(jié)果表明，各晶型的粉末X射線衍射圖譜（2范圍3°～80°）中衍射峰的位置、數(shù)量、強度等均存在明顯的差異，因此可以利用PXRD法對實驗中不同晶型樣品進行鑒別。其中，銀杏內(nèi)酯B晶型A與原料藥一致，銀杏內(nèi)酯B晶型B～D樣品為晶態(tài)物質(zhì)。

2.2.2 DSC法表征

稱取銀杏內(nèi)酯B晶型A～D、F樣品各3 mg放于鋁制坩堝中，使用差示掃描量熱儀進行DSC法測定，初始溫度30 ℃，升溫速率10 ℃?min-1，溫度上限500 ℃，測定結(jié)果見表1。

Table 1 DCS results of five crystal forms of ginkgolid B

結(jié)果表明，銀杏內(nèi)酯B各晶型的DSC圖譜有明顯差異，吸熱峰、放熱峰位置均不相同，因此可以使用DSC法進行鑒別。銀杏內(nèi)酯B四種晶型A～D在高溫條件下發(fā)生轉(zhuǎn)晶，向晶型F轉(zhuǎn)變。晶型F在高溫狀態(tài)下無變化。

2.2.3 TG法表征

分別精確稱量晶型A 6.75 mg、晶型B 7.98 mg、晶型C 7.44 mg、晶型D 9.35 mg和晶型F 8.12 mg，放置于鋁制坩堝中，使用熱重分析儀進行TG法測定銀杏內(nèi)酯B五種晶型樣品含有結(jié)晶溶劑量。儀器設定初始溫度30 ℃，升溫速率10 ℃?min-1，溫度上限500 ℃。實驗結(jié)果見表2與圖2。

Table 2 TG results of five solid phases of ginkgolide B

Note：——It means there is no solvent

從圖2中可以看出，銀杏內(nèi)酯B晶型A～D均有明顯的失重臺階，且存在差異。通過計算確定銀杏內(nèi)酯B 5種晶型的結(jié)晶溶劑含量，晶型A含有1.1個水，晶型B含有0.9個甲醇，晶型C含有0.8個二氧六環(huán)，晶型D含有0.9個DMSO。也證明了銀杏內(nèi)酯B晶型F為無溶劑合物。在一定條件下，各晶型均向晶F型轉(zhuǎn)變。

2.3 銀杏內(nèi)酯B晶型A和F對谷氨酸誘導PC12細胞損傷的保護作用

因為晶型F不含有機溶劑且穩(wěn)定性較好，為確定晶型F是否為優(yōu)勢藥用晶型，對比晶型F與原料藥（晶型A）的差異，設計了不同的藥理實驗。

2.3.1 銀杏內(nèi)酯B對谷氨酸處理PC12細胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

取對數(shù)生長期的PC12細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度至1×105mL-1，接種至24孔板中，并按照預設谷氨酸以及藥物濃度進行處理。處理結(jié)束后每孔加入終濃度為1 μmol?L-1的Fura-2/AM探針并重新放于培養(yǎng)箱中孵育15 min，PBS溶液沖洗2次，置多功能酶標儀檢測，激發(fā)波長為355 nm，發(fā)射波長為538 nm。按試劑盒說明檢測細胞內(nèi)鈣離子濃度。

2.3.2 銀杏內(nèi)酯B對谷氨酸處理PC12細胞LDH釋放量的影響

取對數(shù)生長期的PC12細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度至1×105mL-1，接種至24孔板中，并按照預設谷氨酸以及藥物濃度進行處理。處理結(jié)束后收集各組細胞上清液100 μL，按試劑盒說明測定LDH活性。空白對照孔的PC12細胞經(jīng)裂解后釋放出全部的LDH，作為LDH的參比總濃度同時計算其他各組的LDH濃度，分別除以LDH總濃度，進而計算得到各組釋放LDH的百分比。

2.3.3 銀杏內(nèi)酯B對谷氨酸處理PC12細胞MDA水平的影響

取對數(shù)生長期的PC12細胞，調(diào)節(jié)細胞濃度至1×105mL-1，接種至24孔板中，并按照預設谷氨酸以及藥物濃度進行處理，PBS溶液沖洗2次，加入裂解液裂解細胞，隨后取上清液分別于532 nm測定吸光度值，實驗結(jié)果見圖3。

A—The effects of ginkgoide B on influencing the concentration of intracellular Ca2+ of glutamate-treated PC12 cells. B—The effects of ginkgoide B on influencing the LDH release of glutamate-treated PC12 cells. C—The effects of ginkgoide B on influencing the intracellular MDA levels of glutamate-treated PC12 cells. Results were presented as mean ± S.E.M. Statistical analysis was performed by one-way ANOVA with Tukey's HSD test. ***P< 0.001 vs. the control group. ###P < 0.001, ##P < 0.01 vs. the Glu group. ### $P< 0.05 vs. the Glu + GB-A group

結(jié)果表明：銀杏內(nèi)酯B原藥與晶型F均能顯著降低谷氨酸導致的細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，且銀杏內(nèi)酯B晶型F的抑制作用更加明顯，差異具有統(tǒng)計學意義；銀杏內(nèi)酯B原藥與晶型F均能夠顯著抑制谷氨酸導致的PC12細胞LDH的釋放，但原藥與晶型F相比無顯著性差異；銀杏內(nèi)酯B原藥與晶型F均能顯著降低谷氨酸導致的細胞內(nèi)MDA水平的升高，且銀杏內(nèi)酯B晶型F的抑制作用更加明顯，差異具有統(tǒng)計學意義。綜合以上結(jié)果，銀杏內(nèi)酯B晶型F在保護PC12細胞的藥理作用上優(yōu)于銀杏內(nèi)酯B晶型A。

3 結(jié)論與討論

作者通過多種晶型篩查技術(shù)確定了銀杏內(nèi)酯B不同晶型的制備條件。分別采用單晶X射線衍射法（SXRD）、粉末X射線衍射法（PXRD）、差示掃描量熱法（DSC）和熱重分析法（TG）對各晶型樣品進行表征分析，各個晶型的物理化學性質(zhì)差異較大，易于區(qū)分。并研究銀杏內(nèi)酯B晶型A和F對谷氨酸誘導PC12細胞損傷的保護作用，使用鈣超載、細胞膜通透性以及氧化應激等分子機制比較銀杏內(nèi)酯B晶型A和F的藥理作用，初步確定晶型F為優(yōu)勢藥用晶型。接下來的研究將主要集中在不同劑型中銀杏內(nèi)酯B晶型F作為優(yōu)勢藥用晶型與原型藥作用的差異。

[1] 居文政, 陶開春, 胡津麗. 藥物多晶型與臨床藥效[J]. 中國藥師, 200, 3(2): 369-370.

[2] HE S M, ZHOU Z W, LI X T, et al. Clinical drugs undergoing polymorphic metabolism by human cytochrome P450 2C9 and the implication in drug development[J]. Current Medicinal Chemistry, 2011, 18(5): 667-713.

[3] HEINZ A, STRACHAN C J, GORDON K C, et al. Analysis of solid-state transformations of pharmaceutical compounds using vibrational spectroscopy[J]. Journal of Pharmacy & Pharmacology, 2010, 61(8): 971-988.

[4] 劉嘉, 鄭明. 藥物多晶型的研究進展[J]. 西北藥學雜志, 2017, 32(3): 394-396.

[5] OBERPICHLER H, SAUER D, ROBERG C, et al. PAF Antagonist ginkgolide B reduces postischemic neuronal damage in rat brain hippocampus[J]. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow & Metabolism, 1990, 10(1): 133-135.

[6] MACLENNAN K M, DARLINGTON C L, SMITH P F. The CNS effects of Ginkgo biloba extracts and ginkgolide B[J]. Progress in Neurobiology, 2002, 67(3): 235-257.

[7] 黃賤英, 孫建寧, 梅世昌. 銀杏內(nèi)酯B對缺血/再灌腦損傷大鼠的保護作用[J]. 中國藥理學通報, 2008, 24(2): 269-272.

[8] 馬麗娜, 陳北冬, 趙艷陽, 等. 銀杏內(nèi)酯 B 對內(nèi)皮細胞的保護作用及分子機制研究[J]. 中國藥理學通報, 2013, 29(2): 189-193.

[9] LI R, CHEN B, WU W, et al. Ginkgolide B suppresses intercellular adhesion molecule-1 expression via blocking nuclear factor kappa B activation in human vascular endothelial cells stimulated by oxidized low-density lipoprotein[J]. Pharmacol Sci, 2009, 110(3): 362-369.

Polymorphism preparation and characterization of ginkgolide B

LI Qiuya1,2, SUN Ting2, WANG Dongkai1*

(1.,,110016,; 2.,110016,)

To explore the preparation, characterization and properties of ginkgolide B-related polymorphs.By the methods of single crystal X-ray diffraction (SXRD), powder X-ray diffraction (PXRD), differential scanning calorimetry (DSC) as well as thermogravimetric analysis (TG), six kinds of crystal structure of ginkgolide B (form A-F) were prepared. To confirm the dominant crystal form of ginkgoide B, the protective effects of different crystal structures of ginkgolide B were further detected on glutamate-treated PC12 cells.The results indicated that there were significant differences among the crystal structures of ginkgolide B by using PXRD, DSC and TG. Furthermore, we observed that the form F was the most stable crystal form and showed better neural protective effects compared with the original form.The form F is the dominant crystal form of ginkgoide B.

pharmaceutics; polymorphs; polymorphs preparation; polymorphs characterizations; ginkgolide B

2019-04-01

李秋亞(1990-), 男(漢族), 遼寧沈陽人, 碩士研究生, E-mail 460345214@qq.com;

王東凱(1962-), 男(漢族), 遼寧沈陽人, 教授, 博士, 博士生導師, 主要從事藥物新技術(shù)與新劑型的研究, Tel. 024-43520528, E-mail wangdksy@ 163. com。

R94

A

（2019）04–0100–07

10.14146/j.cnki.cjp.2019.04.002

(本篇責任編輯：趙桂芝)