孔藝涵，梁 雪，張 宇

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二乙基二硫代氨基甲酸銅納米核脂質(zhì)體的制備與工藝優(yōu)化

孔藝涵，梁 雪，張 宇*

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

為臨床提供可靜脈注射的二乙基二硫代氨基甲酸銅（Cu(DDC)2）納米核脂質(zhì)體。采用反向微乳液聚合-薄膜水化法制備Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體，以粒徑及包封率作為評價(jià)指標(biāo)，對處方工藝進(jìn)行優(yōu)化，在最佳處方的基礎(chǔ)上，對制劑的凍干工藝進(jìn)行考察。Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體最佳處方與工藝為：水相藥物加入到8 mL體積比為71∶29的環(huán)己烷-Igepal CO-520中分別制備CuCl2及二乙基二硫代氨基甲酸鈉（DDTC）反相微乳，將上述反相微乳混合后采用異丙醇破乳，通過高速離心的方法收集Cu(DDC)2納米粒。用氯仿和乙醇混合溶液將DOPA-Cu(DDC)2納米粒重新分散后，加至含有（2,3-二油酰氧基-丙基）三甲基氯化銨[(2,3-dioleoyloxy-propyl)-trimethylammonium chloride，DOTAP]、膽固醇和DSPE-PEG2000的乙醇溶液中，通過薄膜水化法制備最終的Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體。該處方工藝可行，凍干后的制劑可以長期儲存，為Cu(DDC)2日后的注射給藥進(jìn)一步打下基礎(chǔ)。

藥劑學(xué)；脂質(zhì)體；反相微乳液聚合法；薄膜水化法；二乙基二硫代氨基甲酸銅；油水難溶性藥物

雙硫侖（disulfiram，DSF）從戒酒藥到抗腫瘤藥物的轉(zhuǎn)型研究已經(jīng)多年，研究人員發(fā)現(xiàn)DSF與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的銅離子形成的二乙基二硫代氨基甲酸銅（Cu(DDC)2）能夠抑制26S蛋白酶體的活性[1]，從而間接阻斷NF-κB通路[2]，抑制NF-κB表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞的生存、增殖和轉(zhuǎn)移[3]。

目前有關(guān)Cu(DDC)2的制劑較少，這與Cu(DDC)2本身的理化性質(zhì)有關(guān)。因其水溶性極差，在水中溶解度小于1 mg?L-1，各種表面活性劑對其增溶作用也不顯著，另外Cu(DDC)2脂溶性也較差。目前文獻(xiàn)報(bào)道的制備Cu(DDC)2脂質(zhì)體方法為預(yù)先制備含CuSO4的脂質(zhì)體，加入二乙基二硫代氨基甲酸鈉（DDTC）孵育[4]，但是這種方法包封率較低，藥物容易泄露。其他的Cu(DDC)2制劑報(bào)道為將Cu(DDC)2制備成白蛋白納米?；蚴杷鞍准{米粒，但是白蛋白類原料比較昂貴，且不易獲得。為了提高Cu(DDC)2的包封率，本文作者采用反向微乳液聚合-薄膜水化法制備Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體，先制備1,2-二油酰--甘油-3-磷酸（鈉鹽）（1,2-dioleoyl--glycerol-3-phosphate sodium salt，DOPA）包裹的Cu(DDC)2納米粒，再用外層磷脂進(jìn)行包裹，制備Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體，提高藥物的包封率，為Cu(DDC)2日后的注射給藥打下基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

EYELA OSB-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司），Scientz-IIE超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），ATL-124分析天平（賽多里普斯科學(xué)儀器有限公司），HC-3018R低溫冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），PF-101T 集熱式恒溫磁力攪拌（鞏義市英峪予華儀器廠），D/Max 2500 PC X-ray diffractomer (Rigaku, Japan)，JEM-2100 透射電子顯微鏡（日本電子，JEOL），Nano-ZS-ZEN3700馬爾文粒度測定儀（英國馬爾文公司）。

注射用膽固醇、（2,3-二油酰氧基-丙基）三甲基氯化銨[(2,3-dioleoyloxy-propyl)-trimethylammonium chloride，DOTAP]、DSPE-PEG2000（上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司），二乙基二硫代氨基甲酸鈉三水合物（DDTC）、壬基酚聚氧乙烯醚（Igepal?CO-520）（Sigma-Aldrich），1,2-二油酰--甘油-3-磷酸（鈉鹽）（DOPA，上海東尚醫(yī)藥科技有限公司），環(huán)己烷、無水乙醇、異丙醇（分析純，天津康科德科技有限公司），氯化銅（分析純，天津博迪化工股份有限公司），Tritonx-100（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：迪馬C18柱（200 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（體積比80∶20）；檢測波長：435 nm；流速：1.0 mL?min-1；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 Cu(DDC)2在常用有機(jī)溶劑中的溶解度測定

分別取Cu(DDC)2100 mg （過量）加入2 mL下述常用有機(jī)溶劑中（環(huán)己烷、氯仿、二氯甲烷、四氫呋喃、乙醇、乙醚、甲基叔丁基醚、丙酮、二甲基亞砜、,-二甲基甲酰胺、甲苯、異丙醇、乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙二醇），并置于西林瓶中磁力攪拌分散，充氮?dú)夂竺芊庥?7 ℃恒溫?fù)u床中放置72 h達(dá)到溶解平衡后，將各樣品于1.2×104r?min-1離心5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行測定或經(jīng)定量稀釋后利用液相測定，計(jì)算溶解度[5]，結(jié)果見圖1。

Fig. 1 Solubility of Cu(DDC)2 in common organic solvent

圖1結(jié)果表明，Cu(DDC)2在常用的各有機(jī)溶劑中溶解度均較差，在氯仿、二氯甲烷、,-二甲基甲酰胺中略大，在其余有機(jī)溶劑中均較小，而且四氫呋喃會使Cu(DDC)2降解，在后續(xù)制備制劑過程中予以重視。

2.3 Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體的制備

將500 mmol?L-1DDTC水溶液150 μL、20 g?L-1DOPA氯仿溶液320 μL加入到8 mL環(huán)己烷- Igepal CO-520（體積比71∶29）中制備DDTC反相微乳；另將500 mmol?L-1CuCl2水溶液150 μL加入到相同的油相中制備CuCl2反相微乳。兩個(gè)微乳混合攪拌24 h，加入異丙醇16 mL進(jìn)行破乳，以1.750 0×104g離心30 min收集得到DOPA-Cu(DDC)2納米粒。采用異丙醇洗滌表面過量的環(huán)己烷及表面活性劑，N2吹干。用氯仿300 μL和乙醇900 μL的混合溶液將DOPA-Cu(DDC)2納米粒重新分散，離心除去大粒子，加入20 mmol?L-1DOTAP 300 μL、20 mmol?L-1膽固醇300 μL、20 mmol?L-1DSPE-PEG2000的乙醇溶液150 μL，65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，形成薄膜，加入65 ℃預(yù)熱去離子水5 mL，于380 W功率下進(jìn)行探頭超聲，得Cu(DDC)2實(shí)心核脂質(zhì)體。

2.4 Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體的制備-處方工藝篩選

2.4.1 表面活性劑的篩選

本文作者考察了Tritonx-100以及IgepalCO-520作為表面活性劑制備的反相微乳液的性質(zhì)，結(jié)果見表1。結(jié)果表明Igepal CO-520的表面活性優(yōu)于Tritonx-100，且制備的空白反相微乳液粒徑更小，因此選取Igepal CO-520作為表面活性劑。

Table 1 Screeningofsurfactant(blank reverse microemulsion particle size

2.4.2 反相微乳液擬三元體系相圖的繪制

將表面活性劑Igepal CO-520與油相環(huán)己烷按不同的質(zhì)量比(分別為0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0)每份共10 g配成一系列的擬二組分體系，將上述二組分體系在25 ℃的恒溫槽中恒溫?cái)嚢?，待油相與表面活性劑形成均一相，開始加入去離子水至反應(yīng)體系由澄清變渾濁即為反相微乳區(qū)臨界點(diǎn)，記錄加入去離子水的質(zhì)量，分別計(jì)算三相在體系中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在Origin軟件中繪制擬三元相圖[6]，結(jié)果見表2和圖2。

圖2結(jié)果表明，當(dāng)Igepal CO-520與油相環(huán)己烷的質(zhì)量比大于1∶1時(shí)，Igepal CO-520過多導(dǎo)致三元體系過于黏稠，且體系的容水量較小，因此制備反相微乳時(shí)Igepal CO-520與油相環(huán)己烷的質(zhì)量比應(yīng)小于1∶1。

Table 2 Phase vanishing point composition of phase diagram of microemulsion region in different Igepal CO-520/cyclohexane mass ratio ternary system

Fig. 2 Pseudo-ternary phase diagrams of system composed by destilled water, cyclohexane and Igepal CO-520

2.4.3 破乳劑的篩選

為了收集DOPA包裹的Cu(DDC)2納米粒，需要將反相微乳破壞，通過高速離心的手段獲得[7]。篩選合適的破乳劑對下一步的制備至關(guān)重要，破乳劑首先需要能夠與環(huán)己烷互溶以破壞反相微乳，且Cu(DDC)2在破乳劑的溶解度要盡可能小。本文作者篩選了甲醇、乙醇、異丙醇、丙二醇作為破乳劑，結(jié)果見表3。

Table 3 Screening of demulsifier

篩選結(jié)果顯示，丙二醇作為破乳劑可以收集到更多的DOPA包裹的Cu(DDC)2納米粒，但是會引起納米粒的聚集，導(dǎo)致粒徑增大，其余3種醇作為破乳劑效果類似，因Cu(DDC)2在異丙醇中溶解度最小，最終確定異丙醇作為破乳劑。

2.4.4 DOPA-Cu(DDC)2分散介質(zhì)

為了進(jìn)行外層磷脂的包裹，需要分散DOPA包裹的Cu(DDC)2納米粒，采用氯仿-乙醇混合溶劑作為分散介質(zhì)，并對氯仿-乙醇的比例進(jìn)行了考察，結(jié)果見表4。

Table 4 Screening of the ratios of chloroform to ethanol

結(jié)果表明，氯仿與乙醇的體積比為1∶3時(shí)，制備得到的Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體粒徑最小，分布最均勻，增大氯仿或乙醇在混合溶液中的比例，均會導(dǎo)致粒徑增大，因此最終確定氯仿與乙醇的體積比為1∶3。

2.4.5 磷脂用量的考察

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)磷脂的用量為20～60 g?L-1時(shí)所制備的脂質(zhì)體較穩(wěn)定。脂質(zhì)體的粒徑隨著磷脂用量的增加而增大，并且當(dāng)磷脂的用量增加到80 g?L-1以上，脂質(zhì)體在顯微鏡下可以觀察到磷脂塊，說明磷脂為過量。因此，本項(xiàng)研究中分別考察了磷脂用量為20、40和60 g?L-1時(shí)對脂質(zhì)體粒徑及粒度分布及包封率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)磷脂質(zhì)量濃度為60 g?L-1時(shí)，所制備的脂質(zhì)體粒度分布均一、包封率高。因此，磷脂的最終用量確定為60 g?L-1。

2.5 包封率的測定

取脂質(zhì)體溶液2 mL置于離心管中，6 000 r?min-1離心10 min，除去下層未包封的藥物沉淀，游離于溶液中的藥物分子忽略不計(jì)。取上層溶液0.5 mL，加入異丙醇4 mL，渦旋10 min，6 000 r?min-1離心10 min，取上清液測定含量為d，藥物總量為加入的理論量t。包封率EE=d/t×100%。結(jié)果顯示 Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體的平均包封率為74%。

為了保證包封率測定方法的準(zhǔn)確性，同時(shí)進(jìn)行了游離Cu(DDC)2溶液加入到Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體中的回收率測定。每3個(gè)為一組分別加入本底濃度80%、100%和120%的對照溶液，按前面所述方法進(jìn)行操作，計(jì)算回收率，結(jié)果見表5。

Table 5 Recovery tests of Cu(DDC)2

回收率結(jié)果表明，此方法適用于Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體包封率的測定。

2.6 X-射線粉末衍射分析

為了驗(yàn)證帶有負(fù)電荷的DOPA磷脂是否可以與過量的Cu2+結(jié)合從而實(shí)現(xiàn)對Cu(DDC)2的包裹，分別對Cu(DDC)2原料藥、DOPA-Cu(DDC)2納米粒、DOPA磷脂以及DOPA與Cu(DDC)2原料藥的物理混合物進(jìn)行粉末衍射分析。衍射角度3°~50°，以每秒0.05°的速率進(jìn)行掃描，繪制XRD圖譜。從圖3看出，原料藥Cu(DDC)2具有較多尖銳的特征衍射峰，即10.2°、11.8°、12.4°等[8]，DOPA與Cu(DDC)2原料藥的物理混合物仍具有Cu(DDC)2的一部分特征峰。而被DOPA磷脂包裹后，各個(gè)特征峰消失，驗(yàn)證了DOPA磷脂對Cu(DDC)2的包裹。

?—Cu(DDC)2; ?—DOPA+Cu(DDC)2; ?—DOPA coated Cu(DDC)2; ?—DOPA

2.7 Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體的表征

Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體形態(tài)采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%磷鎢酸負(fù)染法用透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）進(jìn)行觀察，加速電壓200 kV，放大倍率80 000X，結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體為球形納米粒子，表面規(guī)整，粒徑分布比較均勻。

Fig. 4 TEM analysis of Cu(DDC)2 solid nuclear liposome

2.8 Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體凍干保護(hù)劑的考察

采用如圖5所示凍干曲線對凍干保護(hù)劑進(jìn)行篩選。首先對單一凍干保護(hù)劑進(jìn)行考察，量取Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體2 mL，分別加入不同量的蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、環(huán)糊精、麥芽糖和葡萄糖粉末，冷凍干燥結(jié)束后，觀察其外觀，并用相同體積的純凈水復(fù)溶，結(jié)果見表6。

Fig. 5 Description of freeze-drying curve

Table 6 Effect of different cryoprotectants on the freeze-dried products

Notes: a﹢—Compacted cake, a﹣—Eruption and non-cake; b﹢—Easy, b﹣—Hard; c﹢—＜350 nm, c﹣—Microscale

結(jié)果顯示，用葡萄糖、乳糖、麥芽糖凍干后外觀有坍塌、萎縮等現(xiàn)象；用環(huán)糊精、蔗糖凍干后加蒸餾水復(fù)溶成原體積，振搖均勻，都不能很快分散成均勻的納米粒混懸液，都存在不同程度的大粒子聚集現(xiàn)象。從凍干后外觀及再分散性能看，甘露醇及海藻糖對制劑保護(hù)作用明顯。

單一凍干保護(hù)劑復(fù)溶后粒徑不能滿足要求，因此考慮使用海藻糖和甘露醇作為復(fù)合凍干保護(hù)劑對制劑的保護(hù)效果，分別考察不同比例的海藻糖及甘露醇作為復(fù)合凍干保護(hù)劑，冷凍干燥結(jié)束后，用相同體積的純凈水復(fù)溶，測定粒徑，結(jié)果見表7。

Table 7 Effect of different combination of cryoprotectant on the freeze-dried products

從復(fù)溶結(jié)果來看，以粒徑及分散系數(shù)PDI綜合考慮，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%甘露醇+質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%海藻糖對制劑的保護(hù)效果最好，擬采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%甘露醇+質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%海藻糖作為最終復(fù)合凍干保護(hù)劑。

3 討論

a. 反相微乳液為一種不同于常規(guī)的微乳液體系，油相及表面活性劑占絕大比例，而水相只有很小的比例，反相微乳液的水相在微乳液中形成幾納米到幾十納米的“微水池”，兩個(gè)反相微乳液的水相經(jīng)過離子交換反應(yīng)可以在微水池中反應(yīng)形成粒徑可控的產(chǎn)物。

b. Cu(DDC)2為雙硫侖與銅離子螯合的產(chǎn)物，也可以為雙硫侖在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物DDTC與銅離子螯合形成。Cu(DDC)2水溶性極差，在水中溶解度小于1 mg?L-1，各種表面活性劑對其增溶作用也不顯著，另外Cu(DDC)2脂溶性也較差，導(dǎo)致常規(guī)劑型無法制備粒徑可控的Cu(DDC)2制劑。

c. 因雙硫侖為水不溶性的藥物，所以采用水溶性的DDTC制備反相微乳。通過制備CuCl2反相微乳及DDTC反相微乳，兩個(gè)反相微乳液的混合會使得水相中的藥物在微反應(yīng)池中通過離子交換形成Cu(DDC)2，而銅離子的過量加入會與微乳中帶負(fù)電荷的磷脂DOPA結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)DOPA對Cu(DDC)2的包裹，制備粒徑可控的DOPA包裹的Cu(DDC)2納米粒。進(jìn)一步通過薄膜水化法，加入帶正電荷的磷脂DOTAP，從而實(shí)現(xiàn)磷脂的雙層包裹，得到最終的Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體。

4 結(jié)論

作者通過反相微乳聚合-薄膜水化法成功制備了Cu(DDC)2納米核脂質(zhì)體，制備得到的脂質(zhì)體粒徑分布均勻，包封率高，復(fù)溶性能良好，不僅為Cu(DDC)2日后的注射給藥打下基礎(chǔ)，而且也為其它油水均難溶性藥物制劑的研究提供了有益參考。

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Preparation and process optimization of solid core liposomes of copper diethyl dithiocarbamate

KONG Yihan, LIANG Xue, ZHANG Yu*

(,,110016,)

To provide clinically available intravenous copper diethyl dithiocarbamate (Cu(DDC)2) nanonuclear liposomes.Cu(DDC)2nano-nuclear liposomes were prepared by reverse microemulsion polymerization-film hydration method. The particle size and encapsulation efficiency were used as evaluation indexes to optimize the formulation process. On the basis of the best prescription, the lyophilization process of the formulation was investigated.The optimal formulation and process of Cu(DDC)2nano-nuclear liposome were as follows: the aqueous phase drug was added to 8 mL of cyclohexane-Igepal CO-520 (∶=71∶29) to prepare CuCl2reverse microemulsion and sodium diethyl dithiocarbamate (DDTC) reverse microemulsion. The inverse microemulsion was mixed and emulsified with isopropyl alcohol. And Cu(DDC)2nanoparticles were collected by high speed centrifugation. The DOPA-Cu (DDC)2nanoparticles were redispersed with a mixed solution of chloroform and ethanol, and the solution of DOTAP, cholesterol the DSPE-PEG2000 in ethanol was added. The final Cu(DDC)2nano core liposome was prepared by thin film hydration.The prescription process is feasible, and the lyophilized preparation can be stored for a long time, which further lays a foundation for the injection of Cu (DDC)2.

pharmaceutics; liposome; reverse microemulsion polymerization; thin film hydration; Cu(DDC)2; oil-water insoluble drugs

2019-03-23

遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20180551031)

孔藝涵(1994-), 男(漢族), 遼寧沈陽人, 碩士研究生, E-mail 605452698@qq.com;

張宇(1982-), 男(漢族), 吉林四平人, 副教授, 博士, 碩士生導(dǎo)師, 主要從事藥物新劑型研究, Tel. 024-43520558, E-mail zywinner01@ 163.com。

R94

A

（2019）04–0091–09

10.14146/j.cnki.cjp.2019.04.001

(本篇責(zé)任編輯：趙桂芝)