熊靜平 范曉棠 張躍新

門靜脈血栓(Portal vein thrombosis，PVT)指肝臟的門靜脈主干、肝內(nèi)分支、脾門靜脈、腸系膜上及下靜脈的血栓形成。門靜脈血栓在普通人群中發(fā)病罕見(jiàn)，過(guò)去認(rèn)為PVT同樣是肝硬化的罕見(jiàn)并發(fā)癥，近年來(lái)，伴隨著PVT的診斷技術(shù)的不斷更新和普及，PVT確診率也在不斷提高。Handa等[1]關(guān)于肝硬化患者PVT患病率的研究結(jié)果顯示PVT患病率可高達(dá)10%～20%。

陳鋒等[2]的Meta分析研究結(jié)果顯示血脂異常(血HDL水平降低、TG水平升高)是靜脈血栓的危險(xiǎn)因素。血脂異常往往與脂蛋白的代謝相關(guān)。肝硬化PVT在其發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中是否存在脂蛋白的變化，可以從肝硬化患者脂蛋白變化的角度出發(fā)，觀察PVT發(fā)生、發(fā)展中有變化的脂蛋白，探討其是否與肝硬化PVT的發(fā)病有關(guān)。

iTRAQ作為一種定量方法，已被證明在研究許多疾病[3-4]中是有效和準(zhǔn)確的。在本研究中，我們用iTRAQ結(jié)合色譜質(zhì)譜分析研究了22例PVT患者和23例非PVT患者的血清樣本，篩選兩組間血清的脂蛋白相關(guān)差異蛋白，并對(duì)三個(gè)與脂肪代謝有關(guān)的蛋白行進(jìn)一步分析。這些差異蛋白可能與肝硬化合并門靜脈血栓的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，為肝硬化門靜脈血栓的潛在生物標(biāo)記物。

資料與方法

一、一般資料

所有的病例均來(lái)自2015年11月至2016年11月于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染疾病中心住院診治的自身免疫性肝病相關(guān)肝硬化、酒精性肝硬化及隱匿性肝硬化的患者(為避免病毒性肝炎導(dǎo)致的肝硬化患者血清中有病毒復(fù)制影響蛋白質(zhì)的質(zhì)和/或量，排除乙肝肝硬化及丙肝肝硬化患者)，研究方案及研究?jī)?nèi)容均獲得新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。在患者簽署了知情同意后靜脈采血5 mL,于4℃冰箱靜置2 h后3 000 r/min離心。10 min后，取上清液置于EP管中-80℃冰箱冷凍。

二、 病例納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

肝硬化診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[5]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，肝硬化合并PVT與未合并PVT采用彩色多普勒超聲或(和)計(jì)算機(jī)斷層掃描血管造影診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除布加綜合征、肝腫瘤和其他惡性腫瘤、肝移植、非肝臟疾病并PVT，使用抗血小板或抗凝藥物的病例。

三、 與脂肪消化吸收相關(guān)差異蛋白質(zhì)篩選及生物信息學(xué)分析

使用去血清高豐度親和色譜柱Agilent Multiple Affinity Removal LC Column-Human 14去除高豐度蛋白質(zhì), 得到低豐度組分溶液。采用BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量, 各樣品分別取100 μg肽段，按照AB SCIEX公司iTRAQ標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書(shū)[6]進(jìn)行標(biāo)記。將每組標(biāo)記后的肽段混合，采用Agilent 1 260 infinity II HPLC系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)。每份樣品采用納升流速Easy nLC系統(tǒng)進(jìn)行色譜分離。經(jīng)分離后的血清樣本用Q-Exactive質(zhì)譜儀做質(zhì)譜分析。用KAAS (KEGG Automatic Annotation Server)軟件[7]對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行KEGG通路注釋。

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)(Fisher’s Exact Test)，評(píng)價(jià)與脂蛋白相關(guān)差異蛋白質(zhì)及脂蛋白相關(guān)差異蛋白在脂肪消化和吸收通路中的富集水平。

結(jié) 果

一、兩組間檢測(cè)的脂肪代謝相關(guān)蛋白

兩組間共檢測(cè)出800個(gè)蛋白，與脂肪代謝相關(guān)的蛋白共有17個(gè)，其中7個(gè)蛋白在兩組間有差異。其中APOA1上調(diào)，APOB、APOC1、APOC2、APOC4、APOM、FABP1下調(diào)見(jiàn)表1。

表1 兩組間脂蛋白相關(guān)蛋白與兩組間差異蛋白

二、 兩組間檢測(cè)的脂肪代謝相關(guān)差異蛋白的GO注釋

APOC1與羧酸代謝過(guò)程相關(guān)；APOA1、APOB與體內(nèi)平衡過(guò)程相關(guān)；APOC4、APOC2與小分子生物合成的過(guò)程相關(guān)；APOA1與有機(jī)氮化合物生物合成的過(guò)程相關(guān)；APOC1與有機(jī)氮化合物分解過(guò)程相關(guān)；APOC1與細(xì)胞胺代謝過(guò)程相關(guān)；APOC1與有機(jī)酸生物合成的過(guò)程相關(guān)；APOC1、APOC4、APOC2與羧酸生物合成的過(guò)程相關(guān)；APOC4、APOC2、APOC1、APOA1與脂類生物合成的過(guò)程相關(guān)；APOA1與調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生與分化相關(guān)；APOC4、APOC2、APOA1與分解過(guò)程的正性調(diào)節(jié)相關(guān)；APOA1與調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生相關(guān)；APOC4、APOC2、APOC1、APOM、APOA1、APOB與血漿脂蛋白粒子組織相關(guān)；APOC4、APOC2、APOC1、APOM、APOA1、APOB與復(fù)雜脂蛋白的亞基組織；APOC4、APOC2、APOC1與細(xì)胞酮代謝過(guò)程相關(guān)；APOC4、APOC2、APOC1對(duì)細(xì)胞酮代謝過(guò)程調(diào)節(jié)相關(guān)；APOC4、APOC2、APOC1、APOM、APOA1、APOB與血漿脂蛋白粒子重構(gòu)相關(guān)；APOC4、APOC2、APOC1、APOM、APOA1、APOB與復(fù)雜大分子的重構(gòu)相關(guān)；APOC1、APOC2、APOC4、APOM、APOA1、APOB與甾醇運(yùn)輸相關(guān)；APOC4、APOC2、APOC1、APOM、APOA1、APOB與膽固醇運(yùn)輸相關(guān)；FABP1與過(guò)氧化氫相關(guān)的細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)。

各功能與脂蛋白數(shù)目的分布情況見(jiàn)圖1。

三、兩組間檢測(cè)的脂肪代謝相關(guān)差異蛋白的KEGG注釋

通過(guò)KEGG注釋分析發(fā)現(xiàn)兩組間在脂肪代謝與吸收通路中顯著富集的蛋白共3個(gè)、兩組間脂蛋白相關(guān)差異蛋白共7個(gè)，兩組間在脂肪代謝與吸收通路中顯著富集的蛋白共3個(gè)占兩組間總的差異蛋白(86個(gè))的百分比為3.49%，兩組間所有脂肪代謝與吸收的差異蛋白占總的檢測(cè)蛋白(800個(gè))的百分比為0.87%。結(jié)果見(jiàn)圖2，可見(jiàn)脂肪代謝與吸收通路中顯著富集的蛋白比例明顯高于脂蛋白相關(guān)差異蛋白比例。

討 論

高密度脂蛋白(HDL)及HDL的載脂蛋白通過(guò)抗氧化、抗炎、清除毒性磷脂、改善內(nèi)皮功能保護(hù)血管，發(fā)揮抗血栓和促纖溶作用。Apoa1編碼的載脂蛋白A1(Apoa1)是HDL的主要蛋白質(zhì)成分，在脂多糖的中和與清除方面發(fā)揮了重要作用[8]，可逆向轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇[9]，抑制內(nèi)毒素引起的的炎癥反應(yīng)[10]。Apoa1在肝臟及小腸合成，肝臟損害可以導(dǎo)致對(duì)Apoa1的合成減少，葉文桃等[11]的研究結(jié)果顯示肝硬化的患者Apoa1水平較健康對(duì)照組明顯減少。在本項(xiàng)研究中，肝硬化PVT組Apoa1的水平較肝硬化非PVT組增加(Ratio=1.98112)。與HDL抗靜脈血栓形成的作用相反，其原因有待進(jìn)一步探討。

Mahfouz等[12]的研究結(jié)果表明，低密度脂蛋白(LDL)可以造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞在積聚、血管平滑肌細(xì)胞增殖及向內(nèi)皮下遷移，吞噬大量脂質(zhì)轉(zhuǎn)變成泡沫細(xì)胞，最后形成血栓。APOB是LDL受體的配體，它清理體內(nèi)低密度脂蛋白，參與合成與分泌VLDL、轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪和膽固醇等。Morelli VM等[13]的研究結(jié)果表明載脂蛋白B水平降低是靜脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)因素。ApoB在肝臟合成，肝臟損害可以導(dǎo)致對(duì)ApoB的合成減少，葉文桃等[11]的研究結(jié)果顯示肝硬化的患者ApoB水平較健康對(duì)照組人明顯減少。在我們的研究中，APOB在肝硬化PVT組下調(diào)(Ratio=0.74296)。肝硬化PVT的患者可能因APOB水平較肝硬化無(wú)PVT患者更低，使肝硬化PVT的患者體內(nèi)低密度脂蛋白水平較無(wú)PVT患者高，易形成PVT。

圖1 兩組間脂蛋白相關(guān)差異蛋白的GO注釋

圖2 兩組間脂肪代謝與吸收通路中 顯著富集的蛋白與差異蛋白的分布情況

FABP1在肝臟中表達(dá)具有以下功能：結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)長(zhǎng)鏈脂肪酸、參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；抗氧化；調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖[14-17]。在本研究中，F(xiàn)ABP1的水平在PVT組下調(diào)(Ratio=0.74745)。FABP1的水平下調(diào)可能導(dǎo)致PVT組患者血脂水平較無(wú)PVT組高，易形成血栓。本研究為小樣本的研究，對(duì)于Apoa1上調(diào)、FABP1、APOB下調(diào)導(dǎo)致肝硬化患者引起門靜脈血栓，需要行進(jìn)一步驗(yàn)證并行大樣本功能研究。