沈琦，張殿鵬，郝雅蕎,3，羅翔蓮,3，楊佳瑤，魏步云，李歐，趙洪新

1.浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江省植物與次生代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院 植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京 100097；3.沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034

出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）又稱黑酵母，隸屬于半知菌類短梗霉屬，是具有細(xì)胞和菌絲2種形態(tài)，生活史極為復(fù)雜的類酵母型真菌，廣泛存在于水、土壤、深海底泥、植物表面等自然環(huán)境中[1]。不同來源的出芽短梗霉生長過程中可產(chǎn)普魯蘭多糖、黑色素、重油等具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的代謝產(chǎn)物，特別是普魯蘭多糖是應(yīng)有極為廣泛，極具開發(fā)價(jià)值的微生物多糖。

出芽短梗霉產(chǎn)生的普魯蘭多糖是類似葡聚糖、黃原膠的胞外、黏質(zhì)水溶、非離子線性多糖，是一種特殊的微生物胞外多糖，分子式為其基本結(jié)構(gòu)為由α-1，4糖苷鍵連接的麥芽三糖重復(fù)單位，經(jīng)α-1，6糖苷鍵聚合而成的直鏈狀多糖，相對分子質(zhì)量為 4.8×104～2.2×106，分子大小由菌株、培養(yǎng)條件等多種因素決定[2-4]。普魯蘭多糖具有結(jié)構(gòu)靈活、可塑性、成膜性、黏結(jié)性、耐熱性、耐酸堿性等特性，在食品、石油、化工、醫(yī)藥行業(yè)，特別是藥物載體、靶向治療、醫(yī)學(xué)成像、組織工程、血漿置換、疫苗、分子伴侶活性等新興領(lǐng)域有特殊的應(yīng)用，是性能優(yōu)良的天然生物材料[5-7]。又因普魯蘭多糖無毒無害，對人體無副作用，2006年被確定為新增的4種食品添加劑之一[8]。

Bernier首次報(bào)道了產(chǎn)糖芽霉菌（Pullularia pullulans），即出芽短梗霉代謝過程中可產(chǎn)特殊的胞外黏質(zhì)多糖，因而關(guān)于普魯蘭多糖的研究受到廣泛關(guān)注[9]。經(jīng)過幾十年的努力，對約100株不同來源的出芽短梗霉從菌株篩選、產(chǎn)糖條件、發(fā)酵工藝、誘變育種、基因工程改造等方面做了大量工作，取得了豐富的研究成果[10-11]。但是不同菌株的產(chǎn)糖能力差別巨大，原始菌通常為20 g/L左右，極少數(shù)達(dá)60 g/L以上，且多數(shù)以專利的形式被一些公司占有，所以尋找和開發(fā)產(chǎn)糖高、副產(chǎn)物少的新菌株，一直受研究人員的高度關(guān)注。

本研究的出發(fā)菌株RM1603是實(shí)驗(yàn)室從太湖近岸植物根際土壤中分離得到的一株可產(chǎn)胞外多糖的類真菌，分子鑒定確定其分類歸屬為出芽短梗霉。該菌在200 r/min、28℃培養(yǎng)60 h的條件下，胞外粗多糖產(chǎn)量達(dá)32.91 g/L，與目前報(bào)道的100多株出芽短梗霉菌相比，RM1603具有明顯的產(chǎn)糖優(yōu)勢，是一株極具開發(fā)潛力的產(chǎn)糖新菌株。本研究在單因素確定最佳氮源、碳源及無機(jī)鹽的基礎(chǔ)上，利用正交試驗(yàn)探究RM1603最佳發(fā)酵產(chǎn)糖條件，通過薄層層析和紅外光譜確定了多糖結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步提高RM1603的產(chǎn)糖能力奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

出芽短梗霉RM1603于2015年分離于太湖近岸植物根際土壤，由浙江理工大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

蔗糖、酵母浸粉、玉米漿、麥芽浸粉、ZnSO4、（NH4）2SO4、K2HPO4、KH2PO4、KCl購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaCl、蛋白胨、胰蛋白胨、無水乙醇購于上海生物工程有限公司。

變溫?fù)u床（蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，HYG-B）；721紫外分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；離心機(jī)（賽默飛世爾科技中國有限公司，SL16R）；分析天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；傅立葉紅外光譜儀（Thermo公司）。

1.2 單因素實(shí)驗(yàn)

在培養(yǎng)基A基礎(chǔ)上，碳源為蔗糖，以ZnSO4、KCl、KH2PO4、蛋白胨、玉米漿、胰蛋白胨、麥芽浸粉為單因素條件，配制相應(yīng)發(fā)酵培養(yǎng)基，測定發(fā)酵過程中粗多糖的產(chǎn)量[12-13]。

每種培養(yǎng)基設(shè)3組生物學(xué)重復(fù)，150 mL三角瓶中裝50 mL培養(yǎng)基，200 r/min、28℃培養(yǎng)60 h后取20 mL培養(yǎng)物，2000 r/min離心20 min，取上清液10 mL，加入2倍體積的無水酒精，充分振蕩，4℃醇沉12 h（過夜），離心，棄上清液，收集沉淀，80℃烘干（恒重）稱重，得粗多糖質(zhì)量，以粗多糖質(zhì)量為依據(jù)，選出最佳培養(yǎng)基成分。

1.3 正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平（表1）、最佳發(fā)酵工藝條件正交試驗(yàn)因素水平（表2），由此設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)組，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平表

表2 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平表

1.4 產(chǎn)糖曲線

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，RM1603菌株在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基B、最佳發(fā)酵條件下，以發(fā)酵時(shí)間為變量，從發(fā)酵24 h開始至180 h為止，每12 h為一個取樣點(diǎn)測量普魯蘭多糖質(zhì)量，繪制粗多糖產(chǎn)量變化曲線，確定RM1603產(chǎn)糖最佳發(fā)酵時(shí)間，進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵條件。

1.5 多糖結(jié)構(gòu)分析

1.5.1 多糖的分離純化 稱取1 g粗多糖，溶于蒸餾水，定容至25 mL，為粗多糖溶液。溶液中加5 mL氯仿異戊醇試劑，充分振蕩，4000 r/min離心20 min，靜止2 min，取上清，此步驟重復(fù)操作3次，得到不含蛋白雜質(zhì)的上清液，即為多糖溶液。向多糖溶液中加入4倍體積的無水乙醇，4℃靜置8 h后12 000 r/min離心10 min，沉淀為多糖。利用DEAE纖維素柱層析及Sephadex G-100凝膠柱層析法對多糖進(jìn)一步分離純化。

1.5.2 薄層層析分析 稱10 g硅膠干粉，加入0.02 mol/L的NaAC溶液 25 mL，充分?jǐn)嚢杌靹?，平鋪在玻璃板上，振敲使其均勻，自然晾干，制成硅膠板，置于干燥器中待用[14]。

將0.05 g/mL的普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)液和粗提多糖樣品溶液各分成2份，每份3 mL，各取一份添加普魯蘭酶0.06 mL，室溫酶解8 h。將普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)液、多糖樣品液、普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)酶解液、多糖樣品酶解液分別點(diǎn)樣于硅膠層析板上，在展開劑中層析，待液體層析至硅膠板頂部后取出吹干，噴硫酸顯色劑，吹干后于110℃烘箱烘烤，觀察顯色反應(yīng)。

1.5.3 紅外光譜測定[15]取KBr，分別按50∶3和12∶1與純化所得多糖和普魯蘭多糖充分研磨、混勻，在20 MPa壓力下壓片，將KBr空白片（不含樣品）放入傅立葉紅外光譜儀采集參比背景光譜，然后對待測樣品進(jìn)行圖譜采集。

2 結(jié)果

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

為了確定單因素氮源對RM1603產(chǎn)多糖的影響，選擇了酵母浸粉、蛋白胨、玉米漿、胰蛋白胨、麥芽浸粉分別作為惟一氮源，觀察出芽短梗霉菌發(fā)酵所得粗多糖產(chǎn)量。由圖1可知，以酵母浸粉為氮源的粗多糖產(chǎn)量顯著高于其他氮源實(shí)驗(yàn)組，多糖產(chǎn)量最高達(dá)34.55±1.01 g/L，玉米漿和麥芽浸粉次之，蛋白胨和胰蛋白胨作為主要氮源的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)糖最低，由此表明RM1603菌株產(chǎn)糖發(fā)酵的最佳氮源為酵母浸粉。

圖1 不同單因素（氮源、無機(jī)鹽）對RM1603粗多糖產(chǎn)量的影響

2.2 正交試驗(yàn)

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)及結(jié)果

表4 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

根據(jù)表1設(shè)計(jì)培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)組，如表3所示進(jìn)行9組發(fā)酵培養(yǎng)[16]，試驗(yàn)結(jié)果見表3、4。由方差分析結(jié)果可知，影響多糖產(chǎn)量的因素依次為K2HPO4＞酵母浸粉＞（NH4）2SO4＞蔗糖；4 個因素均對多糖產(chǎn)量有顯著影響，優(yōu)化結(jié)果為蔗糖80 g/L、酵母浸粉 2 g/Lg/L。以此為基礎(chǔ)齡60 h、pH6.5、28℃、180 r/min培養(yǎng)72 h，出芽短梗霉菌RM1603多糖產(chǎn)量為43.9 g/L。

表5 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交因素水平及結(jié)果

根據(jù)表2設(shè)計(jì)發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)組，如表5所示進(jìn)行8組發(fā)酵培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果見表5、6。由方差分析結(jié)果可知，影響多糖產(chǎn)量的因素依次為溫度＞種齡＞pH＞轉(zhuǎn)速＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞培養(yǎng)基體積，其中pH、培養(yǎng)基體積、種齡、溫度、轉(zhuǎn)速均對多糖產(chǎn)量有顯著影響。因此，最佳發(fā)酵條件為pH7、培養(yǎng)基體積25 mL、接種量1%、種齡60 h、溫度28℃、轉(zhuǎn)速160 r/min培養(yǎng)72 h。

綜上，整合最佳培養(yǎng)基與最佳發(fā)酵工藝條件后設(shè)7次重復(fù)，發(fā)酵產(chǎn)量分別為48.52、47.98、48.64、47.34、48.44、47.38 g/L，均值48.05 g/L。

2.3 產(chǎn)糖曲線

在180 h內(nèi)，自24 h開始，每12 h的粗多糖產(chǎn)量變化如圖2所示。96 h時(shí)發(fā)酵進(jìn)入平穩(wěn)期，此時(shí)粗多糖產(chǎn)量最高為65.213±0.08 g/L；132 h后粗多糖產(chǎn)量呈下降趨勢，可能由于發(fā)酵液中碳源不足，導(dǎo)致RM1603利用了產(chǎn)出的普魯蘭糖。

表6 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

圖2 出芽短梗霉RM1603的產(chǎn)糖曲線

2.4 多糖鑒定

2.4.1 薄層層析 以涂布于支持板上的支持物為固定相，以合適的溶劑為流動相，對混合樣品多糖進(jìn)行分離、鑒定和定量[14]。由于普魯蘭酶特異性水解普魯蘭多糖中的α-1，6糖苷鍵，對其他糖苷鍵無作用，因此普魯蘭多糖在特異性酶的作用下水解成麥芽三糖。普魯蘭多糖分子較大，留在起點(diǎn)，酶解后產(chǎn)生的麥芽三糖分子較小（圖3A）。圖中標(biāo)準(zhǔn)品與樣品位置基本一致，兩者酶解后產(chǎn)物位置基本一致，說明普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品酶解液與多糖樣品酶解液中都含麥芽三糖，由此推斷該多糖為普魯蘭多糖。

2.4.2 紅外光譜分析 多糖類化合物結(jié)構(gòu)中的一些特殊功能基團(tuán)可以呈現(xiàn)特殊的紅外吸收光譜特征，無論是醛糖、吡喃糖環(huán)或呋喃糖環(huán)的構(gòu)象和糖苷鍵構(gòu)型，還是糖脂、多糖、糖肽、糖蛋白的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象等，均可通過紅外吸收光譜進(jìn)行檢測，因此紅外光譜法是研究多糖化合物的重要方法[15]。紅外光譜圖見 3B，3000 cm-1和 1350～1400 cm-1處為糖類物質(zhì)的特征吸收峰，普魯蘭多糖標(biāo)準(zhǔn)品的特征峰為1200～1030 cm-1處的υc=0峰和930～900 cm-1處的D-吡喃葡萄糖環(huán)振動峰。多糖樣品出現(xiàn)的特征峰與其基本一致，由此證實(shí)該多糖為普魯蘭多糖[4]。

圖3 多糖結(jié)構(gòu)分析

3 討論

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵工藝條件是提高普魯蘭多糖產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的主要途徑，也是挖掘菌株生產(chǎn)能力、開發(fā)其價(jià)值的重要手段。我們在確定氮源和無機(jī)鹽單因素對RM1603產(chǎn)糖影響的基礎(chǔ)上，采取正交試驗(yàn)分析確定優(yōu)化后的高產(chǎn)糖培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵條件，使得RM1603的多糖產(chǎn)量從28.91提高至65.213 g/L，提高了約2.3倍，與文獻(xiàn)報(bào)道的100多株出芽短梗霉的普魯蘭糖產(chǎn)量相比，處于十分靠前的位置[7]。通常出芽短梗霉在發(fā)酵產(chǎn)胞外多糖過程中會產(chǎn)生一定量的黑色素，對普魯蘭多糖的產(chǎn)量和提取都有一定影響[5]。然而RM1603菌株在最佳發(fā)酵時(shí)間96 h內(nèi)，表觀未見黑色素產(chǎn)生，發(fā)酵液仍然呈乳白色，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，發(fā)酵液顏色漸變?yōu)榈S色，132 h后發(fā)酵液由淡黃色漸變?yōu)樯铧S色，且其黏稠度明顯降低，可能與普魯蘭多糖代謝、重油代謝及黑色素代謝等存在偶聯(lián)關(guān)系[18]；薄層層析、紅外光譜分析檢測RM1603菌株所產(chǎn)多糖的結(jié)構(gòu)，與標(biāo)準(zhǔn)普魯蘭多糖對比結(jié)果一致，這與文獻(xiàn)報(bào)道普魯蘭多糖結(jié)果相似[8,14]，RM1603所產(chǎn)胞外多糖為普魯蘭多糖。因此，RM1603具有較強(qiáng)的產(chǎn)多糖能力，發(fā)酵性狀優(yōu)良，是一株極具開發(fā)價(jià)值的出芽短梗霉新菌株。本研究也為從自然界中篩選高產(chǎn)普魯蘭多糖新菌株提供了參考。