李霞，栗安之，李晨

山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006

胰蛋白酶抑制劑，又名抑肽酶，能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻止胰臟中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活。臨床上胰蛋白酶抑制劑可用于預(yù)防和治療急性胰腺炎、纖維蛋白溶解引起的出血及彌漫性血管內(nèi)凝血，還可用于抗休克治療，腹腔手術(shù)后注入腹腔可預(yù)防腸粘連。最近的研究表明，胰蛋白酶抑制劑還能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，其在抗腫瘤方面的效應(yīng)受到廣泛關(guān)注[1]。

蕎麥藥食同源，含有豐富的活性物質(zhì)，如維生素、膳食纖維、微量元素、多種氨基酸等，是惟一含有黃酮類化合物的糧食作物，具有降壓、降糖、降血脂功能，是“三高”患者的理想食物[2]。課題組之前從蕎麥中提取出一種耐熱的胰蛋白酶抑制劑（buckwheat trypsin inhibitor，BTI），通過基因工程手段獲得了重組BTI，并對其性質(zhì)進(jìn)行了詳盡研究[3-4]。BTI由69個(gè)氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量為7900，具有很好的酸堿穩(wěn)定性及很高的耐熱性，100℃處理60 min后對胰蛋白酶的抑制作用仍可保留80%以上[5]。目前，已實(shí)現(xiàn)了BTI的大規(guī)模制備，如用100 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)菌液，100 mL離子交換柱層析及超濾純化制備高純度的BTI[6]。在此基礎(chǔ)上，對BTI的應(yīng)用研究顯得尤為迫切。BTI是胰蛋白酶的抑制劑，與胰蛋白酶有特異親和力，可以利用這種特異親和性分離純化胰蛋白酶，如將BTI固定化后，制成親和填料，由于這種高度的特異性，有望實(shí)現(xiàn)一步層析得到高純度的目的蛋白酶。

目前，固定化技術(shù)發(fā)展迅猛，廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[7-8]、環(huán)境工程[9]、生物傳感器[10]、染料降解[11]等領(lǐng)域。固定化后的酶與游離狀態(tài)相比，具有熱穩(wěn)定性提高、能反復(fù)使用、保存穩(wěn)定性好、抵抗性強(qiáng)、不易水解，以及對變性劑的耐受性好等特點(diǎn)[12]。用于蛋白質(zhì)固定化的方法很多，固定化的載體有海藻酸鈉、殼聚糖、纖維素、樹脂等，其中海藻酸鈉-聚乙烯醇載體由于安全性高、凝膠易成型、硬度適中等多種優(yōu)點(diǎn)受到學(xué)者的廣泛關(guān)注[13]。

在此，我們以海藻酸鈉-聚乙烯醇為載體，研究了CaCl2濃度、載體與BTI體積比和固定化時(shí)間等3個(gè)單因素對固定化后BTI抑制率的影響，依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化BTI最佳固定化條件，以期BTI得到更廣泛的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

海藻酸鈉、聚乙烯醇、無水氯化鈣均購于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；胰蛋白酶（1∶250）購于生工生物工程（上海）股份有限公司；苯甲酰-DL-精氨酰-對硝基苯氨（BApNA）是Sigma公司產(chǎn)品；其余試劑為分析純。

TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；恒溫水浴鍋（北京市長風(fēng)儀器儀表公司）；JY92-IIN超聲破碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；精密pH計(jì)［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；精密電子天平［奧豪斯儀器（上海）有限公司］。

1.2 BTI的制備

在5 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中加入15 μL大腸桿菌pExSec I-BTI工程菌，37℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)過夜；轉(zhuǎn)接2 mL菌液至100 mL LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)6 h至對數(shù)生長期；加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；8000 r/min離心8 min 收集菌體，用 20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5）緩沖液將菌體重懸，冰浴超聲破碎，直到懸浮液透光；破碎的菌液于80℃加熱30 min，12 000 r/min離心15 min，收集上清保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 BTI抑制活性測定方法

按文獻(xiàn)[14]方法，在2.5 mL活性測定體系［0.1 mol/L Tris-HCl（pH8.0），含 0.01 mol/L CaCl2］中加入0.5 mL胰蛋白酶（20 mg/mL）和100 μL BTI，37℃預(yù)熱 5 min，加入 17 μL底物 BApNA（0.15 mol/L，溶劑為DMSO），持續(xù)保溫10 min，加入0.5 mL 33%的醋酸溶液終止反應(yīng)，在410 nm下測定反應(yīng)體系中產(chǎn)物對硝基苯胺（PNA）的吸光度對照組以100 μL測活緩沖液代替抑制劑樣品溶液，計(jì)算抑制率。

1.4 BTI的固定化

以0.2%聚乙烯醇-3%海藻酸鈉溶液為固定BTI的載體[13]。將載體溶液與BTI溶液混合，用15號注射器將混合溶液均勻滴到CaCl2溶液中，在4℃進(jìn)行固定，得到球狀的固定化BTI。固定后，用蒸餾水洗滌3次，稱取1.00 g固定化BTI，按1.3的方法測定計(jì)算抑制率。

1.5 不同單因素對固定化BTI的影響

1.5.1 CaCl2濃度對固定化BTI的影響 配制1%、3%、5%、7%、9%的CaCl2溶液，將載體與BTI溶液按體積比為2∶1混合均勻，于4℃固定30 min，過濾，用蒸餾水洗滌3次，稱取1.00 g固定化抑制劑，按1.3的方法測定D410nm值，計(jì)算抑制率。

1.5.2 載體與BTI體積比對固定化BTI的影響將載體與 BTI溶液分別按體積比為 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1混合，用15號注射器滴到5%CaCl2溶液中，4℃固定30 min后過濾洗滌，稱取1.00 g固定化BTI，按1.3的方法測定D410nm值，計(jì)算抑制率。

1.5.3 時(shí)間對固定化BTI的影響 將載體與BTI溶液按體積比為2∶1混合，用15號注射器滴到5%CaCl2溶液中，4℃分別固定 10、20、30、40、50 min，過濾，蒸餾水洗滌3次，稱取1.00 g固定化的BTI，按1.3的方法測定D410nm值，計(jì)算抑制率。

1.6 BTI固定化的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究CaCl2濃度、載體與BTI體積比和固定化時(shí)間3個(gè)單因素對抑制率的影響。選擇CaCl2濃度為3%、5%和7%，載體與抑制劑溶液體積比為1∶1、2∶1、3∶1，固定化時(shí)間為20、30、40 min，以抑制率為指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)（表1），優(yōu)化BTI固定化條件。

表1 BTI的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Excel 2017軟件，實(shí)驗(yàn)做圖使用Origin 9.0軟件，響應(yīng)面制圖及數(shù)據(jù)分析用Design Expert 8.0.6軟件。

2 結(jié)果

2.1 不同單因素對固定BTI抑制率的影響

2.1.1 CaCl2濃度對固定化BTI抑制率的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1，當(dāng)CaCl2濃度小于5%時(shí)，隨著濃度升高，微球抑制活性明顯增強(qiáng)；而當(dāng)CaCl2濃度大于5%時(shí)，其抑制活性逐漸降低；當(dāng)CaCl2濃度為5%時(shí)，固定化BTI抑制活性最高。其原因可能是Ca2+濃度與形成凝膠孔徑有關(guān)，當(dāng)Ca2+濃度過高時(shí)會使凝膠球的交聯(lián)太過緊密，影響B(tài)TI與胰蛋白酶的結(jié)合，降低其抑制作用。因此，選擇CaCl2濃度為5%。

圖1 CaCl2濃度對固定化BTI抑制率的影響

2.1.2 載體與BTI體積比對固定化抑制劑的影響 如圖2所示，載體比例對固定化BTI抑制活性有明顯影響。當(dāng)載體與BTI溶液體積比為2∶1時(shí)，其抑制活性最高；但當(dāng)二者比例小于2∶1或大于2∶1時(shí)，抑制活性會降低。其原因可能是載體與BTI比例較低時(shí)，載體含量相對不足，導(dǎo)致對BTI包埋不充分；而當(dāng)二者比例大于2∶1時(shí)，載體含量過多，導(dǎo)致固定化過程中Ca2+和Na+置換時(shí)間延長[13]，從而影響固定化BTI的量。因此，選擇載體與BTI的體積比為2∶1。

圖2 載體與抑制劑體積比對固定化BTI抑制率的影響

2.1.3 固定化時(shí)間對固定化BTI抑制率的影響如圖3所示，隨著固定化時(shí)間的延長，BTI抑制活性呈先升高后降低并趨于穩(wěn)定的趨勢，固定化時(shí)間為30 min時(shí)抑制活性達(dá)到最高，抑制率為74.9%。其原因可能是當(dāng)固定化時(shí)間太短時(shí)，Ca2+孔徑較大，抑制劑容易流失；隨著固定化時(shí)間的延長，海藻酸鈉凝膠空間結(jié)構(gòu)更加緊密，BTI的擴(kuò)散阻力會增大，所以抑制活性會降低[15]。因此，選擇BTI的固定化時(shí)間為30 min。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

圖3 固定化時(shí)間對固定化BTI抑制率的影響

2.2.1 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面法被廣泛應(yīng)用于確定多因素實(shí)驗(yàn)的最佳條件，采用數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算出最為合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到不同因素之間以及因素和水平之間的相互關(guān)系，相比正交試驗(yàn)具有精度高、試驗(yàn)周期短等特點(diǎn)[16]。

通過響應(yīng)面方法對CaCl2濃度）、載體與BTI體積比、固定化時(shí)間進(jìn)行三因素三水平優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 回歸模型建立及參數(shù)分析 以CaCl2濃度（A）、載體與抑制劑BTI體積比（B）、固定化時(shí)間（C）為單因素，抑制率為相應(yīng)指標(biāo)，建立回歸模型，方差分析結(jié)果見表3?；貧w方程為y=72.28+6.98A-3.97B+1.60C+2.37AB+0.72AC+2.23BC-9.08A2-3.83B2-3.48C2。

表3為回歸分析結(jié)果，此模型的P＜0.01，說明回歸模型顯著，方程因變量與所有自變量之間的線性關(guān)系良好，實(shí)驗(yàn)方法可行。失擬項(xiàng)P（0.1906）＞0.05，說明差異性不顯著。模型回歸系數(shù)表明該模型擬合程度較好，誤差較小，可以用此模型對固定化BTI的抑制率進(jìn)行分析檢測[17]。由表3可知，模型的A、B、A2、B2、C2均可達(dá)到顯著水平。由F值可以判斷各因素對固定化條件影響的強(qiáng)弱，依次為CaCl2濃度＞載體與抑制劑體積比＞固定化時(shí)間。

2.2.3 固定化條件的響應(yīng)面分析 CaCl2濃度、載體與BTI體積比和固定化時(shí)間之間的交互影響見圖4～6，從曲面的陡勢和等高線的形狀可以直觀了解各因素間的相互作用對固定化結(jié)果的影響?？梢钥吹剑@3組交互影響作用的曲面中心頂點(diǎn)都接近于零，說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳固定化條件在3個(gè)因素的零水平左右[14]。

由圖4可知，當(dāng)固定化時(shí)間為30 min時(shí)，隨著載體與BTI比例的增加，固定化BTI的抑制率呈先升高后降低的趨勢；隨著CaCl2濃度的增加，抑制率也呈先升高后降低的趨勢。在CaCl2濃度的變化范圍處于4.5%～7.0%、載體與抑制劑比例范圍處于1∶1～2.5∶1時(shí)，抑制率達(dá)到最高點(diǎn)。

由圖5所示，當(dāng)載體與BTI比例為2∶1時(shí)，隨著固定化時(shí)間的增加，固定化BTI抑制率呈先升高后降低的趨勢；隨著CaCl2濃度的增加，固定化BTI抑制率也呈先升高后降低的趨勢。在CaCl2濃度的變化范圍處于4.5%～7.0%、固定化時(shí)間范圍處于25～35 min時(shí)，抑制率達(dá)到最高。等高線圖呈圓形，表明載體與抑制劑體積比和時(shí)間的相互作用弱，等高線的曲面比較陡，說明固定化BTI的抑制率對時(shí)間和CaCl2濃度比較敏感。

由圖6可以得出，當(dāng)CaCl2濃度為5%時(shí)，隨著固定化時(shí)間延長及載體與抑制劑比例的增加，都會使抑制率形成先增加后減小的變化趨勢。在載體與抑制劑的比例范圍為1∶1～2.5∶1、固定化時(shí)間范圍為25～35 min時(shí)，抑制率達(dá)到最高。

表3 響應(yīng)面二次回歸模型的方差分析

圖4 CaCl2濃度和載體與抑制劑比例對固定化BTI抑制率的響應(yīng)面和等高線

圖5 固定化時(shí)間和CaCl2濃度對固定化BTI抑制率的響應(yīng)面和等高線

利用Design Expert 8.0.6軟件對模型進(jìn)行分析，得到固定化BTI的最佳條件：CaCl2濃度為5.67%，載體與BTI體積比為1.6∶1，時(shí)間為30.56 min，此時(shí)固定化BTI抑制率為74.3%。根據(jù)實(shí)際操作情況，調(diào)整CaCl2濃度為5.6%，時(shí)間為31 min，載體與抑制劑體積比為1.6∶1，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，通過3次平行試驗(yàn)得到固定化BTI抑制率為72.4%，與預(yù)測值74.3%相近，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的BTI固定化工藝條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，利用本實(shí)驗(yàn)建立的模型在實(shí)踐中可行。

圖6 載體與抑制劑比例和固定化時(shí)間對固定化BTI抑制率的響應(yīng)面和等高線

3 討論

本實(shí)驗(yàn)用物理包埋法對BTI進(jìn)行固定化，根據(jù)CaCl2濃度、載體與BTI體積比和固定化時(shí)間3個(gè)單因素結(jié)果，利用響應(yīng)面法對固定化條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了最佳固定化條件及主要影響因素。

單因素實(shí)驗(yàn)得出BTI的最優(yōu)固定化條件為CaCl2濃度5%、載體與BTI體積比2∶1、固定化時(shí)間30 min。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對固定化條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了以抑制率為響應(yīng)值的回歸模型，模型擬合程度較高，表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確有效。在該模型下得出最佳固定化條件為CaCl2濃度5.6%、載體與抑制劑體積比1.6∶1、固定化時(shí)間30.56 min。方差分析表明，CaCl2濃度、載體與抑制劑體積比、固定化時(shí)間對固定化BTI抑制率影響是顯著的，而且是非線性的，但它們的交互影響不顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，響應(yīng)面分析法可以有效地優(yōu)化BTI的固定化條件。