李艷青，郭婷婷，曾毅，周玉柏

北京工業(yè)大學 生物科學與生物工程學院，北京 100124

肺癌是全球癌癥發(fā)病和死亡的首要原因，2018年預計新發(fā)病例210萬，致死180萬，占所有癌癥死亡人數(shù)的五分之一[1]。肺癌可分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），約 85%的肺癌患者為NSCLC[2]。非小細胞肺癌又可分為腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌等，其中以肺腺癌和肺鱗癌最為常見。近年來，隨著酪氨酸激酶抑制劑的使用和免疫治療技術的發(fā)展，NSCLC患者的治療模式發(fā)生了革命性的變化[3-4]。然而，上述新型治療方法也存在患者適用范圍窄、副作用明顯及易發(fā)耐藥等缺點，NSCLC患者的5年綜合生存率仍然偏低。因此，深入研究NSCLC發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找藥物作用的新靶點，對于改善肺癌患者預后，提高生活質量有重要的臨床意義。

微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類包括20～25個核苷酸的非編碼RNA，通過與mRNA的3'非翻譯區(qū)（UTR）結合，降解mRNA或抑制其翻譯過程，進而調控靶基因的表達水平[5-6]。大量數(shù)據(jù)表明，miRNA在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調控作用，根據(jù)作用的不同可分為促進腫瘤生長的促癌miRNA和具有抑癌作用的抑癌miRNA[7]。近來研究表明，miR-490-3p的表達異常與腫瘤發(fā)生有著密切關系，在乳腺癌、結腸癌、肝癌、胃癌等惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用[8-11]，但其在肺癌中的作用還不明確[12-13]。我們以非小細胞肺癌A549細胞為模型，探討miR-490-3p在NSCLC中的作用及分子機制，為尋找新的藥物靶點，開發(fā)新的治療措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

A549細胞由本實驗室保存；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、PBS、Opti-MEM購自Gbico公司；LipofectAMINE 3000購自Invitrogen公司；質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、RT-PCR試劑盒、SYBR熒光定量試劑盒均購自TaKaRa公司；TGFBR1抗體購自Abcam公司；GAPDH抗體購自CST公司；抗兔IgG抗體購自KPL公司；Transwell小室購自Corning公司；pmirGLO質粒、雙螢光素酶檢測試劑盒購自Promega公司；Cy3標記的miR-490-3p mimics、miR-NC由廣州銳博生物公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)

A549細胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基（添加100 μg/mL青霉素和鏈霉素），于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞轉染

將A549細胞以3×105/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后設置miR-490-3p mimics組、陰性對照組（miR-NC）和空白組，用LipofectAMINE 3000進行相應miRNA轉染，每組設置3個復孔，轉染48 h后進行檢測。

1.4 CCK8檢測細胞增殖

將轉染后24 h的各組細胞以5×103/孔接種于96孔板，每組設置5個復孔，分別于24、48、72 h棄舊培養(yǎng)基，每孔加入100 μL CCK8試劑和培養(yǎng)基DMEM混合液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標儀測定D450nm值。

1.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力

將轉染后24 h的各組細胞接種于六孔板，待細胞匯合度達80%～90%時，用10 μL的無菌槍頭垂直方向劃直線，PBS清洗3次去除脫落細胞后加入2 mL無血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基，分別在0和24 h于顯微鏡下拍照記錄，用ImageJ軟件測量遷移距離，計算各組細胞的遷移率。

1.6 Transwell檢測細胞的遷移與侵襲能力

將轉染后24 h的各組細胞分別用無血清培養(yǎng)基制成單細胞懸液，遷移實驗Transwell上室細胞接種數(shù)為5×104，侵襲實驗（含基質膠Matrigel）Transwell上室細胞接種數(shù)為1×105，下室分別加入600 μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出小室，PBS清洗1次，4%多聚甲醛固定20 min，用0.1%結晶紫染色后顯微鏡下觀察，隨機選取10個視野拍照計數(shù)。

1.7 miR-490-3p靶基因的預測及qRT-PCR篩選

miRwalk在線工具通過集成Targetscan和miRTarBase預測網(wǎng)站的算法進行miRNA靶基因的預測，并可對不同算法獲得的預測基因取交集以得到更可信的結果。我們對預測結果根據(jù)基因功能進行進一步篩選，最終確定進入后續(xù)篩選的候選調控基因。用TRIzol法提取轉染48 h后的A549細胞總RNA，以U6為內參，反轉錄后進行熒光定量反應（反應條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)數(shù)），記錄最終結果，用 2-ΔΔCt法計算不同調控基因mRNA表達的差異。

1.8 Western印跡檢測蛋白表達

A549細胞轉染48 h后，每孔加100 μL RIPA細胞裂解液，置冰上裂解15 min，收集至EP管，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清進行蛋白定量；加入SDS上樣緩沖液沸水浴10 min，每組取25 μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE；電泳結束后，在100 mA恒流下將蛋白轉至NC膜上，室溫下用5%的脫脂奶粉封閉2 h；加入一抗，4℃孵育過夜；加入二抗，室溫孵育1 h；條帶信號用Odyssey遠紅外影像分析儀檢測；用ImageJ對檢測結果進行灰度掃描，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示蛋白的相對表達量。

1.9 雙螢光素酶報告基因實驗

將相應基因的3'-UTR序列插入pmirGLO載體的多克隆位點，將構建的載體與miR-490-3p mimics、miR-NC用 LipofectAMINE 3000共轉染A549細胞，轉染48 h后用雙螢光素酶活性檢測試劑盒檢測螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶活性。相對螢光素酶活性以螢火蟲螢光素酶活性值/海腎螢光素酶活性值表示。

1.10 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad Prism7.00統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素的方差分析。P＜0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-490-3p對A549細胞增殖的影響

用LipofectAMINE 3000轉染Cy3標記的miR-490-3p mimics，在明場和熒光下觀察，轉染效率可達90%以上（圖1）。CCK8實驗結果顯示，轉染了miR-490-3p mimics的A549細胞在培養(yǎng)48和72 h后，細胞數(shù)明顯少于陰性對照組（圖2，P＜0.01），提示miR-490-3p過表達可顯著降低A549細胞的增殖能力。

圖1 miR-490-3p mimics的轉染效率

圖2 miR-490-3p過表達抑制A549細胞增殖

2.2 miRNA-490-3p對A549細胞遷移的影響

采用劃痕實驗測定過表達miR-490-3p后A549細胞遷移能力的變化，結果顯示，與陰性對照組相比，轉染了miR-490-3p mimics的A549細胞的遷移率明顯降低（圖3，P＜0.01），提示miR-490-3p過表達可抑制A549細胞的遷移能力。

2.3 miRNA-490-3p對A549細胞遷移侵襲的影響

采用Transwell遷移實驗進一步驗證miR-490-3p對A549細胞遷移能力的影響，結果顯示，與陰性對照組相比，轉染miR-490-3p mimics的A549組細胞穿膜數(shù)目顯著減少（圖4，P＜0.001）。Transwell侵襲實驗結果顯示，與陰性對照組相比，miR-490-3p過表達的A549組細胞穿膜數(shù)目明顯減少（圖5，P＜0.001）。提示miR-490-3p過表達可顯著抑制A459細胞的遷移與侵襲能力。

圖3 劃痕實驗檢測miR-490-3p對A459細胞遷移的影響

圖4 Transwell實驗檢測miR-490-3p對A549細胞遷移能力的影響

圖5 Transwell實驗檢測miR-490-3p對A549細胞侵襲能力的影響

2.4 qRT-PCR篩選miRNA-490-3p的靶基因

根據(jù)在線預測的miRNA-490-3p靶基因并結合基因功能分析，選擇與細胞增殖、遷移及侵襲表型相關的RASAL2、TGFBR1、PAPPA、HMGA2、TGFA基因進行后續(xù)qRT-PCR篩選。結果表明，僅TGFBR1基因的mRNA表達水平顯著下調（圖6，P＜0.01），其他基因的mRNA與對照組相比無顯著差異。因此，選擇TGFBR1基因為miRNA-490-3p的候選靶基因進行后續(xù)研究。

圖6 qRT-PCR檢測過表達miR-490-3p對靶基因mRNA表達水平的影響

2.5 Western印跡檢測miRNA-490-3p對TGFBR1蛋白水平的影響

Western印跡顯示，與陰性對照組相比，轉染miR-490-3p mimics后，A549細胞中的TGFBR1蛋白表達顯著下調（圖7，P＜0.05），說明miR-490-3p與A549細胞中TGFBR1蛋白的表達水平存在負相關性。

圖7 miR-490-3p對A549細胞中TGFBR1蛋白表達水平的影響

2.6 雙螢光素酶報告基因實驗驗證miR-490-3p靶向TGFBR1基因

TGFBR1基因的3'-UTR和miR-490-3p的結合序列如圖8A所示。用LipofectAMINE 3000將miR-490-3p mimics/miR-NC和雙螢光素酶報告基因載體pmirGLO-TGFBR1共轉染A549細胞，轉染48 h后用雙螢光素酶試劑盒檢測各組螢光素酶的活性。結果顯示，與對照組相比，轉染miR-490-3p mimics組相對熒光值顯著下降（圖8B，P＜0.05），提示miR-490-3p可通過結合TGFBR1的3'-UTR抑制TGFBR1基因的表達。TGFBR1基因是miR-490-3p的靶基因。

圖8 miR-490-3p與靶基因TGFBR1結合位點的預測和驗證

3 討論

數(shù)十年來，隨著新型靶向藥物及免疫治療的發(fā)展，肺癌的治療手段越來越多樣化，治療效果有明顯的提高，但肺癌患者的總體預后仍然不容樂觀，5年生存率僅為15%[14]。因此，探討NSCLC的發(fā)生機制，尋找新的分子標志物及藥物靶點，對于進一步提高肺癌患者的治療效果十分必要。

現(xiàn)已明確，miRNA參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。綜合已有的數(shù)據(jù)，可以認為，對于腫瘤這種表型多樣復雜的疾病，必然存在不同層面的涉及多種代謝及信號通路的異常，而在此過程中，不同的miRNA及其靶基因之間形成的復雜調控網(wǎng)絡可能發(fā)揮重要作用。目前僅有不多的幾種miRNA被證實與肺癌的發(fā)生密切相關[15-18]。比如miR-4326可通過靶向APC2促進肺癌細胞的增殖；miR-214通過靶向CPD抑制肺癌細胞的生長。因此，發(fā)現(xiàn)新的具有調控作用的miRNA分子，對于加深對肺癌調控網(wǎng)絡的認識，開發(fā)新型靶向藥物具有重要意義。miR-490-3p被認為在多種腫瘤中發(fā)揮作用，在乳腺癌中可通過下調RhoA基因抑制乳腺癌細胞的增長[19]，在結直腸癌細胞中miR-490-3p的下調可以激活Wnt/βcatenin通路[20]。然而，miR-490-3p在肺癌中的作用及分子機制并不清楚。本研究將miR-490-3p mimics導入非小細胞肺癌A549細胞，通過CCK8、細胞劃痕及Transwell實驗，表明miR-490-3p過表達可顯著抑制A549細胞的增殖、遷移和侵襲能力。隨后，通過qRT-PCR和Western印跡對其可能的靶基因進行篩選。qRT-PCR結果顯示，僅有TGFBR1基因的mRNA水平顯著下調，隨后的Western印跡也進一步確證TGFBR1蛋白表達水平與其mRNA具有同樣的變化趨勢，提示TGFBR1基因可能是miR-490-3p調控的靶基因。最后，運用雙螢光素酶報告實驗證明，miR-490-3p可通過直接結合TGFBR1基因的3'-UTR最終下調該基因的蛋白表達水平。TGFBR1基因編碼TGF-β信號通路中的重要受體TGF-β受體1，接受胞外刺激信號的TGF-β受體1發(fā)生磷酸化進而激活Smad信號通路，調節(jié)相關基因的轉錄，廣泛參與細胞生長、增殖等過程[21]。研究發(fā)現(xiàn)，TGFBR與腫瘤的增殖、侵襲表型密切關系[22-24]，在NSCLC患者人群中存在較高的TGFBR1等位基因特異性表達，且與TGFBR1基因的一個兩位點單倍型相關，這提示TGFBR1基因與NSCLC的病因學有重要聯(lián)系[25]。本研究證明在非小細胞肺癌A549細胞中miR-490-3p通過靶向TGFBR1調控其表達，從而發(fā)揮抑癌作用，進一步豐富了對miR-490-3p在肺癌中的調控機制的認識。

綜上，miR-490-3p可通過直接靶向TGFBR1抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和遷移侵襲。此研究為miR-490-3p在肺癌靶向治療中的潛在應用提供了實驗基礎。