常振宇，張亞楠，劉婕，丁麗華，劉榮

1.解放軍總醫(yī)院 肝膽外二科，北京 100853；2.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 生物工程研究所，北京100850

胰腺癌是具有高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，早期診斷困難，預后極差，總體五年生存率尚不足10%[1]。目前針對胰腺癌的治療手段相對有限，手術(shù)是惟一能達到根治性治療的手段，但僅有10%～15%的病人有機會進行手術(shù)治療，化療仍然是胰腺癌治療的主要手段[2]。以吉西他濱為基礎(chǔ)的方案是臨床上輔助、新輔助、局部晚期以及轉(zhuǎn)移性病變的一線化療方案，吉西他濱可以明顯改善胰腺癌患者的預后，但由于原發(fā)性和繼發(fā)性耐藥的發(fā)生，只有少部分病人能從化療中得到真正的臨床獲益[3]。

microRNA（miRNA）是一類短鏈非編碼RNA，長度為17～25個核苷酸，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的調(diào)控作用[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)多種miRNA在腫瘤化療耐藥中也發(fā)揮重要功能，如miR-21在多種腫瘤中調(diào)控細胞對順鉑、紫杉醇、多柔比星等不同化療藥物的敏感性[5-7]；miR-34a表達水平下調(diào)會導致結(jié)腸癌細胞對5-氟尿嘧啶的耐藥[8]，在前列腺癌細胞中，miR-34a上調(diào)會增加耐藥細胞對紫杉醇的敏感性[9]。相關(guān)研究表明胰腺癌吉西他濱耐藥也同樣受miRNA所調(diào)控，miR-101-3p可以通過抑制核糖核苷還原酶調(diào)節(jié)因子1（RRM1）的表達，增加胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性[10]；而miR-320c則可以通過SMARCC1誘導胰腺癌對吉西他濱耐藥[11]。目前多項研究顯示了miRNA與胰腺癌吉西他濱耐藥的相關(guān)性，但吉西他濱耐藥機制復雜，許多miRNA在其中的作用尚不明確，因此探索在耐藥調(diào)控中發(fā)揮功能的新的miRNA，有助于我們了解吉西他濱耐藥的原因，有可能為克服吉西他濱耐藥提供新的思路。

在本研究中，我們通過miRNA測序，篩選發(fā)現(xiàn)在胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株中miR-451a表達水平明顯下調(diào)，推測miR-451a可能在耐藥過程中發(fā)揮作用。因此，我們進一步通過體外細胞實驗和體內(nèi)動物實驗驗證了miR-451a在胰腺癌吉西他濱耐藥中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

6周齡雌性BALB/c裸鼠購自北京維通利華公司；人胰腺癌細胞系CFPAC-1、PANC-1購自中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所細胞中心；DMEM、IMDM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；吉西他濱購自上海陶素生化公司；轉(zhuǎn)染試劑RNAimax購自Themo Fisher公司；RNA抽提試劑TRI Reagent購自Sigma公司；反轉(zhuǎn)錄酶MMLV、實時熒光定量PCR試劑TB Green Premix購自TaKaRa公司；CCK8試劑盒購自日本東仁化學公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物公司；miR-451a類似物（細胞實驗用mimics和動物實驗用agomir）合成于蘇州吉瑪基因公司；反轉(zhuǎn)錄及qPCR引物由北京博邁德基因技術(shù)公司合成。

1.2 耐藥細胞株的獲取

采用低濃度梯度遞增法。在CFPAC-1細胞的完全培養(yǎng)基中加入吉西他濱，起始藥物濃度為1 μmol/L，處理48 h后更換為不含藥物的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后重新加入藥物處理，1周后增加藥物濃度。藥物處理5個月后，在含低濃度（1 μmol/L）吉西他濱的培養(yǎng)基中培養(yǎng)并穩(wěn)定傳代10代以上，獲取耐藥細胞株（CFPAC-1 GemR），并利用細胞存活實驗鑒定耐藥效果。

1.3 RNA提取及測序

收取目的細胞，用1×PBS清洗1次，加入TRI Reagent 1 mL吹打裂解，室溫靜置5 min，加入200 μL氯仿充分混勻，靜置 5 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，可見分層，吸取上層液體至新的EP管中，加入400 μL異丙醇混勻，室溫靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，可見RNA沉淀，去上清，依次用75%乙醇、無水乙醇清洗，室溫充分干燥后加入40 μL DEPC處理水溶解，Nanodrop測定RNA濃度及純度，電泳鑒定降解情況，質(zhì)量合格后用于下游反轉(zhuǎn)錄或測序。野生型CFPAC-1及耐藥細胞株的miRNA測序及數(shù)據(jù)分析由北京諾禾致源公司完成。

1.4 反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR

miRNA的反轉(zhuǎn)錄采用莖環(huán)法，通用莖環(huán)序列為GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTGGATACGAC。取RNA 2 μg、miRNA特異性反轉(zhuǎn)錄引物 0.5 μg，加水稀釋至16 μL，70℃結(jié)合 5 min后置于冰上，加入MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和對應緩沖液、dNTP及RNase抑制劑，42℃反應1 h，95℃5 min滅活，得到cDNA第一鏈，稀釋至100μL，用于下游qPCR反應。miRNA特異性反轉(zhuǎn)錄引物見表1。

采用 20 μL qPCR 體系（TB Green Premix 10 μL，上、下游引物各 0.4 μL，cDNA 模板 9.2 μL），每組設3個重復孔，在Bio-Rad CFX96PCR儀上進行反應，下游引物為通用反向引物，U6作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算miRNA的相對表達量。

表1 miRNA特異性反轉(zhuǎn)錄引物

表2 qPCR引物

1.5 miRNA類似物轉(zhuǎn)染

將CFPAC-1和PANC-1細胞接種于6孔板，轉(zhuǎn)染密度達50%～70%為宜。取7.5 μL RNAimax試劑，用無血清無雙抗的DMEM稀釋至150 μL；miRNA mimics（20 μmol/L）3 μL，無血清無雙抗的DMEM稀釋至150 μL；將稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑和miRNA mimics充分混勻后室溫孵育5 min，逐滴加入細胞培養(yǎng)液中，48～72 h后收取細胞進行后續(xù)實驗。

1.6 細胞存活實驗

將各組別細胞分別接種于96孔板，10 000/孔，細胞貼壁伸展后，將培養(yǎng)基更換為含不同濃度吉西他濱的完全培養(yǎng)基，各組各濃度分別設置3個重復孔，藥物處理48 h后將培養(yǎng)基更換為含10%CCK8的完全培養(yǎng)基，37℃溫箱孵育1～2 h，酶標儀測定D450nm值，以未加藥孔作為對照，計算細胞存活率。

1.7 克隆形成

將對照及miR-451a轉(zhuǎn)染組細胞接種于6孔板，加入吉西他濱（CFPAC-1 1 μmol/L；PANC-1 5 μmol/L）處理24 h后消化，重懸計數(shù)后接種于新的6孔板中，1500/孔，10～14 d后鏡下觀察克隆形成情況，多數(shù)克隆含有50個細胞以上時終止培養(yǎng)，PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min，自來水沖洗后自然風干，掃描圖像后用Image J統(tǒng)計克隆個數(shù)。

1.8 流式凋亡檢測

將對照及miR-451a轉(zhuǎn)染組細胞接種于6孔板，加入吉西他濱后處理48 h，用不含EDTA的胰酶消化、收集細胞，用AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒進行染色，上機檢測凋亡情況。

1.9 裸鼠成瘤實驗

將1×107PANC-1細胞接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，10 d后形成肉眼可見的腫瘤后開始給藥，對照組僅給予吉西他濱，miR-451a治療組同時給予miR-451a agomir和吉西他濱。吉西他濱50mg/kg腹腔注射，每周2次；miR-451a agomir 10 nmol瘤內(nèi)注射，每周2次。3周后處死小鼠，解剖腫瘤，量取腫瘤體積。本實驗經(jīng)生物工程研究所實驗動物管理和使用委員會批準。

1.10 統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析；連續(xù)變量用x±s表示，組間比較使用t檢驗；細胞存活曲線采用重復測量方差分析比較；生存資料采用Kaplan-Miere法繪制生存曲線，用Log-Rank檢驗分析差異。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌耐藥細胞株中miR-451a水平明顯下調(diào)

親本細胞株CFPAC-1和耐藥細胞株CFPAC-1 GemR在不同濃度吉西他濱作用下的細胞存活率如圖1A所示，CFPAC-1 GemR存活率高于其親本細胞株，說明耐藥細胞株對吉西他濱的敏感性明顯降低。將CFPAC-1和CFPAC-1 GemR進行miRNA測序，選取其中變化較明顯的miRNA用RT-PCR驗證，結(jié)果見圖1B，miR-451a在耐藥細胞株中的表達水平明顯下調(diào)。

圖1 耐藥細胞株鑒定及差異miRNA表達驗證

2.2 miR-451a過表達增加胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性

對照組和miR-451a過表達組用梯度濃度的吉西他濱處理，48 h后利用CCK8測定細胞存活情況，并繪制存活曲線。結(jié)果表明，在CFPAC-1（圖 2A）和 PANC-1（圖 2B）細胞中，轉(zhuǎn)染 miR-451a mimics后細胞存活率下降，說明miR-451a負向調(diào)控胰腺癌細胞吉西他濱耐藥。

圖2 miR-451a過表達影響胰腺癌細胞吉西他濱耐藥

2.3 miR-451a增強吉西他濱抑制胰腺癌細胞增殖的作用

對照組細胞和miR-451a過表達組細胞用同樣濃度的吉西他濱處理24 h后，接種于6孔板行克隆形成實驗，結(jié)果顯示，在CFPAC-1（圖3A）和PANC-1（圖3B）細胞中，轉(zhuǎn)染miR-451a mimics后克隆形成明顯少于對照組，表明miR-451a過表達使吉西他濱抑制細胞增殖的作用增強。

2.4 miR-451a增強吉西他濱誘導細胞凋亡的作用

吉西他濱處理48 h后流式細胞檢測對照組和miR-451a過表達組的細胞凋亡情況，結(jié)果如圖4，miR-451a過表達組細胞凋亡比例高于對照，差異具有統(tǒng)計學意義。該結(jié)果提示，miR-451a對吉西他濱誘導的細胞凋亡有促進作用。

圖3 miR-451a過表達使吉西他濱抑制細胞增殖作用增強

圖4 miR-451a增強吉西他濱誘導細胞凋亡的作用

2.5 miR-451a誘導裸鼠體內(nèi)腫瘤對吉西他濱敏感

基于體外實驗結(jié)果，我們進一步在裸鼠體內(nèi)驗證了miR-451a對胰腺癌耐藥的調(diào)控作用。將PANC-1細胞注射裸鼠皮下成瘤后，給予吉西他濱治療，結(jié)果如圖5，miR-451a agomir給藥組的腫瘤體積明顯小于對照組，說明miR-451a增加了裸鼠體內(nèi)腫瘤對吉西他濱的敏感性。

圖5 miR-451a誘導裸鼠體內(nèi)腫瘤對吉西他濱敏感

2.6 miR-451a表達水平與胰腺癌患者預后相關(guān)

從以上結(jié)果可以看出，miR-451a在胰腺癌細胞和裸鼠腫瘤中與胰腺癌吉西他濱耐藥相關(guān)，我們進一步探究了miR-451a與胰腺癌病人預后的關(guān)系。利用在線工具Oncolnc調(diào)取腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中胰腺癌病人的生存資料和miR-451a表達水平，并進行Kaplan-Miere生存分析，結(jié)果表明，miR-451a表達水平較低的胰腺癌患者預后更差（圖6）。

圖6 miR-451a表達水平與胰腺癌患者預后的關(guān)系

3 討論

胰腺癌惡性程度高、診斷治療困難、預后極差。2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，胰腺癌新發(fā)與死亡病例分別為458 918例和432 242例，是為數(shù)不多的死亡例數(shù)接近新發(fā)例數(shù)的癌癥之一[12]。目前治療手段的匱乏是預后差的主要原因。吉西他濱是少數(shù)對胰腺癌治療效果較好的化療藥物之一，但仍然存在顯著的耐藥問題，尋找新的治療靶標克服耐藥至關(guān)重要[2]。

miRNA作為具有多樣性和高度保守性的調(diào)節(jié)因子，在腫瘤耐藥中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以通過不同的通路調(diào)控胰腺癌對吉西他濱耐藥，如miR-34、miR-1246等可以通過腫瘤干細胞通路調(diào)節(jié)胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性[13-14]，miR-125b、miR-365 等則是通過凋亡通路調(diào)控胰腺癌吉西他濱耐藥[15-16]。本研究中我們構(gòu)建了胰腺癌耐藥細胞系作為吉西他濱耐藥的模型，對其進行了miRNA測序，并對測序結(jié)果中部分miRNA進行了表達水平驗證，發(fā)現(xiàn)miR-451a、miR-122-5p、miR-129-5p等多個 miRNA在耐藥細胞系中表達下調(diào)，miR-1-3p、miR-206等多個miRNA在耐藥細胞系中表達上調(diào)。其中，miR-129-5p、miR-206有相關(guān)文獻報道與吉西他濱耐藥相關(guān)，且變化趨勢與本研究一致[17-18]。

miR-451a位于染色體17q11.2，在多種腫瘤中表達異常[19]。多項研究表明miR-451a與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤及白血病中均有報道，與多種腫瘤的復發(fā)、轉(zhuǎn)移和預后也有關(guān)系[20-22]。miR-451a與耐藥的相關(guān)性也有相關(guān)研究，在FLT3-ITD陽性的急性髓細胞白血病中，miR-451a可以逆轉(zhuǎn)細胞對化療藥物的耐藥[23]；Liu等報道m(xù)iR-451a過表達可以增加乳腺癌細胞對他莫昔芬的敏感性[24]。在胰腺癌吉西他濱耐藥中miR-451a的功能尚無相關(guān)研究。我們發(fā)現(xiàn)在吉西他濱耐藥細胞株中miR-451a水平下調(diào)明顯，接下來探究了miR-451a在胰腺癌吉西他濱耐藥中的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)在體外和裸鼠體內(nèi)，miR-451a可以促進胰腺癌細胞對吉西他濱的敏感性。

miRNA主要通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（UTR）序列發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，通常一條miRNA可以調(diào)控多個基因。已證實的miR-451a靶基因有 ABCB1、AKT1、c-MYC、BCl-2等[25-27]，其中許多基因都與多藥耐藥相關(guān)。因此，我們推測miR-451a可能通過這些基因調(diào)控胰腺癌細胞對吉西他濱耐藥，但須進行后續(xù)的篩選和驗證。

同時，我們對TCGA數(shù)據(jù)庫中胰腺癌患者生存資料進行了分析，發(fā)現(xiàn)miR-451a低表達與胰腺癌患者不良預后相關(guān)。由于數(shù)據(jù)庫臨床資料并沒有收集患者復發(fā)情況及化療史，所以并不能對miR-451a和吉西他濱耐藥的關(guān)系做具體分析，但從這個結(jié)果中可以推斷，miR-451a可能與胰腺癌的進展相關(guān)。

綜上，我們篩選了與吉西他濱耐藥相關(guān)的miRNA，并通過體外和動物實驗驗證了miR-451a在胰腺癌吉西他濱耐藥中的調(diào)控作用，有助于進一步解析胰腺癌吉西他濱耐藥產(chǎn)生的機制，為克服胰腺癌耐藥提供新的思路。