肖湘滇 楊應(yīng)合 李桂香

幽門螺桿菌屬于革蘭氏陰性桿菌，呈螺旋形，于1983年被首次從慢性活動性胃炎的胃黏膜活檢組織中成功分離出，幽門螺桿菌感染后可導(dǎo)致消化道潰瘍、胃炎、淋巴增生性胃淋巴瘤等疾病，不良預(yù)后可導(dǎo)致進一步演變?yōu)槲赴虼诵枰行У乃幬镞M行抑制；而加味小柴胡湯出自《醫(yī)宗金鑒》卷四十九，基本方由加味干姜、茯苓、白術(shù)、黃連組成[1]，是臨床上治療胃潰瘍疾病的常用方，獲得了較好的臨床治療效果，既往文獻已證實黃銅物質(zhì)部位、皂苷物質(zhì)部位、揮發(fā)油物質(zhì)部位、酚酸物質(zhì)的提取部位均可有效抑制幽門螺桿菌，但尚未明確發(fā)揮抑制作用的具體成分[1]，因此在本次研究中，旨在研究探討加味小柴胡湯有效成分抑制幽門螺桿菌的臨床效果，具體情況如下。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

試劑：鹽酸小檗堿（批號PS011-0100MG，10 mg）、柴胡皂苷（批號 PS0-0410-0025，10 mg）、6-姜酚（批號 PS0663-0200，10 mg）、黃芩苷試劑（批號PU0032-0025，10 mg），均由成都普思生物科技股份有限公司；克拉霉素膠囊（由江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20050292，10 mg）。

儀器：數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱；-80℃立式超低溫保存箱；光學(xué)顯微鏡；超純水機；游標(biāo)卡尺；立式滅菌器；潔凈工作臺。

材料：哥倫比亞培養(yǎng)基；2.5 L圓底立式厭氧培養(yǎng)袋；無菌脫纖維綿羊血；微需氧產(chǎn)氣袋；HB四連式牛津杯；哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)。

質(zhì)控菌：幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌種，由上海北諾生物科技有限公司提供。

1.2 試驗藥液以及選擇性培養(yǎng)基的配制

哥倫比亞血瓊脂固體培養(yǎng)基：精確稱取39.0 g哥倫比亞血瓊脂固體培養(yǎng)基，并加熱溶于1 000 mL的雙蒸水中，待培養(yǎng)基被完全溶解之后采用121℃高壓滅菌15 min，然后待其自然冷卻到50℃左右，然后快速將濃度為5%的無菌脫纖維綿羊血，將其充分混勻，并趁熱將其置入無菌培養(yǎng)皿中，等待培養(yǎng)基的自然冷凝以備用[2]。

哥倫比亞液體培養(yǎng)基：精確稱取29.0 g哥倫比亞血瓊脂液體培養(yǎng)基，并加熱溶于1 000 mL的雙蒸水中，待培養(yǎng)基被完全溶解之后采用121℃高壓滅菌15 min以備用。

陽性對照液配制：精確稱取0.25 g克拉霉素膠囊內(nèi)容物，并將其加入至含有100μL吐溫-80的雙蒸水中，然后定容到10 mL，并使用超聲對其進行15 min的震蕩，從而配制成濃度為0.025 g/mL的藥液以備用。

有效成分溶液配制：精確稱取10 mg鹽酸小檗堿、柴胡皂苷α、6-姜酚、黃芩苷的油膏或者是粉末，并將其加入至含有100μL吐溫-80的雙蒸水中，然后定容到10 mL，并使用超聲對其進行15 min的震蕩，從而配制成濃度為1.00 mg/mL的藥液以備用[3]。

1.3 復(fù)蘇、培養(yǎng)菌種

從-80℃中取出幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，在室溫下放置，精確取200μL標(biāo)準(zhǔn)菌種指固體培養(yǎng)基上，同時采用L型玻璃棒對菌種進行平鋪，并將其裝入培養(yǎng)袋中，然后將微需氧產(chǎn)氣袋放入培養(yǎng)袋中，并迅速將其密封再將培養(yǎng)袋放入恒溫為37℃的培養(yǎng)箱中，進行72 h的培養(yǎng)；完成培養(yǎng)后，鑒定菌種，確認為幽門螺桿菌后，將培養(yǎng)基上的菌苔刮除，然后將菌苔移至50 mL的液體培養(yǎng)基中，作為原菌液[4]。

1.4 制備菌液以及確定菌液濃度

取原菌液使用無菌水稀釋成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍的菌懸液，并將其充分搖勻，然后取1 mL的菌懸液放入到培養(yǎng)皿中，并將其倒入至已融化且冷卻到45～50℃的細菌培養(yǎng)基中，將平板輕輕旋動，促使培養(yǎng)基與菌液充分混勻，待冷凝之后將其倒置，再將其放入培養(yǎng)袋中[5]，然后將微需氧產(chǎn)氣袋放入袋中；并迅速將其密封再將培養(yǎng)袋放入恒溫為37℃的培養(yǎng)箱中，進行72 h的培養(yǎng)；對每個濃度進行三次的平行試驗；同時使用菌落計數(shù)的方法，對稀釋后的菌液濃度進行確定，然后選擇合適的菌液濃度展開體外抗菌試驗[6]。

1.5 采用液體稀釋法對最低抑菌濃度進行測定

采用梯度稀釋法進行液體稀釋試驗，并計算最小抑菌濃度。取陽性照組藥液、鹽酸小檗堿、柴胡皂苷、6-姜酚、黃芩苷藥液各1 mg/mL濃度，使用液體培養(yǎng)基將其稀釋為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128；并將各組稀釋后的藥液各取1 mL，將其放置于2 mL的試管中，并在將50 μL的菌懸液加入至各管中，每個稀釋級別的操作均進行3次；同時制作一個2 mL的液體培養(yǎng)對照管以及一個2 mL的菌懸液對照管，并進行72 h的培養(yǎng)[7]。

1.6 采用瓊脂擴散法對抑菌環(huán)直徑進行測定

取6個900 mm培養(yǎng)皿，注入哥倫比亞血瓊脂15 mL，冷凝后作為底層；另外選取適量的熱融瓊脂培養(yǎng)基，并加入適量的菌懸液，將其充分搖勻后放入至5 mL的培養(yǎng)皿；待冷凝后，將HB四連式牛津杯放在培養(yǎng)皿上，每個孔加入100μL部位藥液，并進行72 h的培養(yǎng)，對每個有效成分重復(fù)進行三次；陰性對照選擇無菌水[8]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件對本次研究中的數(shù)據(jù)進行分析處理，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 加味小柴胡湯有效成分的抑菌圈直徑分析

采用牛津杯方法進行瓊脂擴散實驗，測定抑菌圈直徑。分別對5組試驗進行測量，每組5例，共計25例試驗。實驗中所有藥物濃度相同。測量結(jié)果顯示與陰性對照組相比，陽性對照組、各給藥組的抑菌圈直徑顯著增大；20例給藥組的抑菌圈直徑明顯大于陽性對照組；而鹽酸小檗堿的抑菌圈直徑明顯大于其余15例藥組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)分析見表1。

表1 加味小柴胡湯有效成分的抑菌圈直徑分析（±s）

表1 加味小柴胡湯有效成分的抑菌圈直徑分析（±s）

注：與陰性對照組相比，▲ P＜0.05；與陽性對照組相比，◆ P＜0.05；與鹽酸小檗堿相比，b P＜0.05。

分組 抑菌圈直徑（mm） 藥物濃度陰性對照組 0 -陽性對照組（n=5） 7.15±1.05▲ 0.025 mg/mL鹽酸小檗堿（n=5） 15.91±0.78▲◆ 1.00 mg/mL柴胡皂苷（n=5） 13.18±0.32▲◆b 1.00 mg/mL 6-姜酚（n=5） 13.24±0.19▲◆b 1.00 mg/mL黃芩苷（n=5） 12.17±0.58▲◆b 1.00 mg/mL

2.2 加味小柴胡湯有效成分的最低抑菌濃度分析

本次研究顯示，鹽酸小檗堿藥液的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）指標(biāo)明顯低于其余三個給藥組，1：4、1：8、1：32、1：64、1：128稀釋比例的鹽酸小檗堿、柴胡皂苷、6-姜酚、黃芩苷藥液均呈渾濁狀態(tài)，而1：2、1：4、1：8稀釋的鹽酸小檗堿呈澄清狀態(tài)，柴胡皂苷、6-姜酚、黃芩苷藥液均僅在1：2、1：4比例稀釋下呈澄清狀態(tài)。差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），具體數(shù)據(jù)分析見表2。

3 討論

目前臨床上治療幽門螺桿菌感染患者主要采用兩種抗菌藥物和質(zhì)子泵抑制藥組合的三聯(lián)療法，獲得了較好的治療效果，但是由于耐藥性的產(chǎn)生，此種治療方式的療效逐漸減低，有著較高的復(fù)發(fā)率；因此近年來，多數(shù)臨床學(xué)者將目光轉(zhuǎn)移至中藥治療幽門螺桿菌感染病患，據(jù)相關(guān)研究證實黃連解毒湯、四君子湯、半夏瀉心湯以及小柴胡湯等中藥湯劑治療幽門螺桿菌感染病患均取得了較好的臨床治療效果；且經(jīng)中醫(yī)臨床實踐表明，由幽門螺桿菌感染所導(dǎo)致的慢性胃炎、胃潰瘍病患，多見濕熱證，其次多見肝胃不和證[9]；而加味小柴胡湯是將柴胡作為君藥，起到了疏肝升陽、和解表里之功效，并配以黃芩、黃連可起到清熱解毒之功效，而茯苓、生姜、半夏、白術(shù)具有補脾補氣、解表散寒、燥濕化痰之功效；而大棗、人參則起到增強補脾益氣功效的作用，加入甘草對方中的諸藥進行調(diào)和；因此采用加味小柴胡湯治療由幽門螺桿菌感染所導(dǎo)致的慢性胃炎、胃潰瘍患者與中醫(yī)辯證的普遍規(guī)律相符合[10]；

表2 加味小柴胡湯有效成分的最低抑菌濃度分析

在本次研究中，主要是對加味小柴胡湯中的有效成分抑制幽門螺桿菌的效果進行了研究，結(jié)果顯示，四個提取部位的有效成分對幽門螺桿菌均起到了顯著的抑制作用，與既往研究報道一致[11]；且本次研究結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿的最低抑菌濃度、抑菌圈直徑明顯優(yōu)于其余三個有效成分；本次實驗結(jié)果為研究加味小柴胡湯抑制幽門螺桿菌提供了科學(xué)的依據(jù)。

此外本次研究中的實驗也存在著一定的局限性，研究人員發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷和6-姜酚在雙蒸水中的溶解性較差，因此針對水溶性較差的物質(zhì)成分，醫(yī)院在實驗人員在進行溶解時加入了1%吐溫-80以起到協(xié)助溶解的效果，并且據(jù)相關(guān)文獻報告，只有濃度在70%以上的吐溫-80才能起到抑菌的效果[12]，因此本次實驗中，濃度為1%的吐溫-80不會產(chǎn)生抑菌影響。醫(yī)院在選擇陽性對照藥液時，主要是考慮到克拉霉素的臨床治療效果較好，且不良反應(yīng)率較低；另外需要注意的是，對最低抑菌濃度的渾濁情況及抑菌圈直徑進行觀察時，可將白光作為觀察背景，有利于更加清晰、準(zhǔn)確地觀察實驗結(jié)果。

綜上所述，加味小柴胡湯中的鹽酸小檗堿、柴胡皂苷、6-姜酚、黃芩苷等有效成分對幽門螺桿菌均有著一定的抑制作用。