羅 藝，趙夢珠，吳 迪，沈 敏

固有免疫是機體抵御病原微生物入侵的第一道防線，主要通過模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)或內(nèi)源性的損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)，激活下游信號通路，促進炎癥因子的分泌及炎癥的產(chǎn)生。核苷酸結合寡聚化結構域(nucleotide-binding oligomerization domain，NOD)樣受體(NOD-like receptor, NLR)家族是位于細胞質中的一類PRRs，可劃分為多個亞家族，包括NLRA、NLRB、NLRC和NLRP等。NLR識別并結合配體后，可裝配形成炎性小體，炎性小體活化后能激活半胱氨酸天冬氨酸特異蛋白酶-1(caspase-1)，促進白介素(interleukine，IL)-1β、IL-18前體的切割、成熟和分泌，參與炎癥反應、損傷修復等過程[1]。目前研究較廣泛的炎性小體主要有NLRP1、NLRP3、NLRC4、NLRP6、NLRP12、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)炎性小體等。本文主要介紹NLRC4炎性小體的構成、活化機制、作用機制及其相關疾病的研究進展。

1 NLRC4炎性小體的構成

炎性小體由受體蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)和caspase-1前體(pro-caspase-1)三個部分構成，其中受體蛋白主要包括NLRs(如NLRP1、NLRP3、NLRC4)和HIN200家族蛋白(如AIM2)[2]。

NLRC4炎性小體中的受體蛋白為NLRC4(圖1)。NLRC4又被稱為IPAF(IL-1β converting enzyme protease activating factor, IL-1β轉換酶蛋白激活因子)，為NLR家族成員。NLRC4由3個結構域構成，其N端為caspase募集結構域(caspase recruitment domain, CARD)，是效應結構域，可募集并活化pro-caspase-1，負責下游信號轉導。中間為NOD結構域，又稱NACHT結構域，是NLR家族成員共有的特征性結構域，包括核苷酸結合域(nucleotide binding domain, NBD)、2個螺旋結構域(helical domain, HD1、HD2)和翼狀螺旋結構域(winged-helical domain, WHD)，自N端至C端依次為NBD-HD1-WHD-HD2，可介導NLR分子的寡聚反應，改變其構型。C端為亮氨酸重復結構域(leucin rich repeat, LRRs)，負責識別和結合PAMP等配體。ASC為銜接蛋白，由熱蛋白結構域(pyrin domain，PYD)和CARD結構域組成，其一端與NLRC4蛋白連接，另一端通過自身的CARD結構域募集pro-caspase-1。Pro-caspase-1為無活性形式，激活后成為caspase-1，是炎性小體的重要組成部分，可介導炎癥反應和誘導細胞焦亡(pyroptosis)。

與NLRP3和AIM2依賴于ASC募集pro-caspase-1不同，由于NLRC4存在CARD結構域，NLRC4可在沒有ASC的情況下直接募集和活化pro-caspase-1[3]。另有研究表明，若缺乏ASC，則caspase-1的活化和IL-1β、IL-18的分泌均減少，而細胞焦亡過程不受影響，說明ASC在促炎細胞因子的分泌過程中有重要作用，但具體機制尚不明確[4-5]。

2 NLRC4炎性小體的活化和作用機制

在無活化信號時，NLRC4通過LRR結構域折疊使其靠近NOD結構域，抑制自身多聚體化而使其處于非活化狀態(tài)，在NOD結構域內(nèi)由HD1、WHD、HD2形成一個特殊的ADP結合囊，穩(wěn)定NLRC4的非活性構象。當有細菌感染等活化信號出現(xiàn)時，LRR結構域識別配體，引起自身構象變化，促進ADP轉化為ATP，解除LRR所介導的對NOD結構域寡聚化的抑制，觸發(fā)寡聚體化繼而暴露出CARD效應結構域，NLRC4炎性小體被激活，引起caspase-1的活化，觸發(fā)炎癥反應[6]。

革蘭陰性致病菌，如鼠傷寒沙門菌、弗氏志賀菌、銅綠假單胞菌、嗜肺軍團菌等，可通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type three secretion system，T3SS)的跨膜膜針狀結構將其鞭毛蛋白或PrgJ樣桿狀蛋白導入宿主細胞內(nèi)，激活NLRC4炎性小體，導致巨噬細胞死亡和促炎細胞因子釋放[7]。與NLRP3和AIM2不同，NLRC4不直接與細菌配體相互作用。NLR家族凋亡抑制蛋白(NLR family apoptosis inhibitory protein，NAIP)家族是具有3個桿狀病毒抑制凋亡蛋白重復域(baculovirus inhibit apoptosis protein repeat domain，BIR)結構域的NLR，其作為配體受體介導NLRC4炎性小體活化。相關的體外實驗和小鼠體內(nèi)實驗均表明，NAIP1可與T3SS的針狀蛋白PrgI結合，NAIP2可特異性地結合T3SS的基座蛋白PrgJ，NAIP5和NAIP6可結合細菌的鞭毛蛋白，并進一步招募NLRC4組裝形成NAIP/NLRC4炎性小體復合物，激活caspase-1介導的炎癥反應[8-9]。

圖 1 LRC4和NLRC4炎性小體結構示意圖

Fig 1 NLRC4 and NLRC4 Inflammasome

IPAF：IL-1β轉換酶蛋白激活因子；CARD：caspase募集結構；NBD：核苷酸結合域；WHD：翼狀螺旋結構域；HD：螺旋結構域；LRR：亮氨酸重復結構域；PYD：熱蛋白結構域

NLRC4炎性小體活化后產(chǎn)生兩種效應(圖2)。一方面，NLRC4炎性小體可通過ASC或NLRC4蛋白的CARD結構域募集pro-caspase-1，在CARD-CARD相互作用下使兩個相鄰的pro-caspase-1發(fā)生自身水解，產(chǎn)生具有活性的caspase-1，進一步剪切pro-IL-1β和pro-IL-18，分泌成熟的IL-1β和IL-18，引起炎癥反應。另一方面，caspase-1可誘導細胞焦亡(pyroptosis)。細胞焦亡是一種細胞程序性死亡，表現(xiàn)為細胞脹大，最終導致胞膜破裂、細胞內(nèi)容物釋放，引起強烈的炎癥反應。在所有炎性caspase中(包括caspase-1)存在共同的底物蛋白消皮素D(Gasdermin D，GSDMD)，它屬于一個名為gasdermin的蛋白家族，該家族還包括GSDMA，GSDMB，GSDMC，DFNA5(GSDME)，DFNB59等。炎性caspase通過切割GSDMD釋放其N端結構域，該結構域可以識別并結合細胞膜上的磷脂類分子，在胞膜上形成孔道，導致細胞滲透壓變化，最終引發(fā)細胞焦亡[10]。細胞焦亡除了能引起宿主的炎癥反應，還能通過胞膜孔道捕獲致病菌，防止細菌感染其他細胞，促進宿主啟動免疫防御清除致病菌[11-12]。

圖 2 NLRC4炎性小體的活化機制Fig 2 Activation mechanism of NLRC4 inflammasomeT3SS：Ⅲ型分泌系統(tǒng)；NAIP：NLR家族凋亡抑制蛋白；hNAIP：人NLR家族凋亡抑制蛋白

3 NLRC4炎性小體相關疾病

3.1 NLRC4炎性小體病——3種表型：AIFEC、NOMID、FCAS4

自身炎癥性疾病是一種系統(tǒng)性或器官特異性炎癥，大多是由固有免疫通路失調(diào)和過度活躍引起的，并且多為單基因疾病[13]。目前研究較多的主要有3種表型，分別為自身炎癥伴嬰兒小腸結腸炎(autoinflammation with infantile enterocolitis，AIFEC)、新生兒多系統(tǒng)炎癥性疾病(neonatal onset multi-system inflammatory disease，NOMID)和家族性寒冷性自身炎癥綜合征4(familial cold autoinflammatory syndrome 4，F(xiàn)CAS4)[14]。AIFEC和NOMID與NLRC4基因HD-1和NBD亞結構域變異相關(S171F，T177A，T337S，T337N和V341A)，而FCAS4與WHD亞結構域變異(H443P和S445P)相關(圖3)。據(jù)報道，WHD結構域的變異可能會不同程度地促進caspase-8介導的細胞死亡，而HD-1的變異則不會[15]。NLRC4突變促進了NLRC4炎性小體的異常激活、IL-1β和IL-18的產(chǎn)生以及巨噬細胞的死亡，其具體機制有待進一步研究。

2014年的兩項研究最先報道了一組NLRC4炎性小體病，闡述了NLRC4功能性獲得性突變是嬰兒小腸結腸炎和反復發(fā)生巨噬細胞活化綜合征(macrophage activation syndrome, MAS)的病因，并與新生兒死亡有關[16-17]。后來人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)將這類疾病命名為AIFEC。AIFEC是一種慢性炎癥性疾病，伴有可危及生命的超急性發(fā)作，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、分泌性腹瀉，以及外周血細胞計數(shù)降低、肝功能障礙、凝血功能障礙、血清鐵蛋白顯著升高和骨髓噬血細胞現(xiàn)象等MAS表現(xiàn)，并有血清IL-18明顯升高(常>104 pg/ml)[14, 17-18]。

NOMID屬于冷炎素相關周期性綜合征(cryopyrin-associated periodic syndromes，CAPS)中的一組疾病，既往認為與NLRP3基因突變有關。NOMID的主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹(尤其是蕁麻疹)、關節(jié)炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥(感覺神經(jīng)性聾、無菌性腦膜炎、腦積水、腦萎縮、智力發(fā)育遲滯等)。2017年，Kawasaki等[19]報道了第一例體細胞NLRC4突變所致與NOMID臨床表現(xiàn)一致的病例。目前尚未有其他病例報道。

FCAS1是另一組屬于CAPS的疾病，同樣與NLRP3基因突變有關，但臨床表現(xiàn)較NOMID更加輕微，主要表現(xiàn)為遇冷發(fā)生的一過性發(fā)熱、蕁麻疹、關節(jié)痛等癥狀。2014年，Kitamura等[20]曾報道過一個存在NLRC4基因突變的家系，突變患者的臨床表現(xiàn)為新生兒發(fā)熱、感冒誘發(fā)的蕁麻疹和關節(jié)炎，患者的細胞在體外寒冷環(huán)境下分泌IL-1β明顯增多，IL-18的水平未檢測。由于該組NLRC4基因突變患者臨床表現(xiàn)與NLRP3相關的FCAS1有相似的臨床表現(xiàn)，因此被稱為FCAS4。2017年，另一項研究報道了以皮膚紅斑結節(jié)、蕁麻疹、關節(jié)痛和晚發(fā)性腸胃炎為主要癥狀的一組病人，在這組病人中發(fā)現(xiàn)了一種新的NLRC4基因突變S445P，并且該組病人的IL-18明顯升高[21]。該研究也首次對NLRC4功能性獲得性突變患者皮膚病變的組織病理學進行了描述，皮膚活檢顯示真皮淋巴細胞-組織細胞浸潤。

在缺乏針對 NLRC4基因突變的特異性治療的情況下，目前主要以下游炎癥介質作為治療靶點。經(jīng)研究已證實有效的藥物有重組IL-1受體拮抗劑阿那白滯素(anakinra)、糖皮質激素、環(huán)孢素A、靜脈輸注丙種球蛋白，現(xiàn)正在進行臨床試驗的藥物有重組IL-18結合蛋白和抗IFN-γ單克隆抗體[19,21-22]。

3.2 細菌感染

NLRC4炎性小體在促進腸道細菌病原體的清除方面起著重要作用。Sellin 等[23]的研究顯示，在小鼠腸上皮細胞中，缺失NAIP1-6導致感染早期沙門氏菌的細菌負荷增加，說明感染的腸上皮細胞排出沙門氏菌依賴于NAIP蛋白在腸道中的表達。對特異性敲除NLRC4的腸上皮細胞的研究證明，NLRC4通過激活caspase-1和caspase-8介導細胞程序性死亡，促進感染性腸上皮細胞的排出[24]。然而，Chen等[25]發(fā)現(xiàn)，與巨噬細胞和腸上皮細胞不同，沙門氏菌感染小鼠中性粒細胞后并不發(fā)生細胞焦亡，而是在感染部位持續(xù)產(chǎn)生IL-1β，使促炎作用和抗菌效應最大化。另外，Hermansson等[26]研究發(fā)現(xiàn)，志賀菌感染上皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、T/B淋巴細胞等不同的細胞后，均可調(diào)控炎性小體活化的“開關”，抑制炎性小體的活化，發(fā)生免疫逃避，導致細菌感染。

嗜肺軍團菌可經(jīng)呼吸道吸入引起軍團菌肺炎。嗜肺軍團菌的鞭毛蛋白為NLRC4炎性小體的激活因子，在NAIP5和NLRC4協(xié)同作用下誘導caspase-1的活化[27]。同時也有研究發(fā)現(xiàn)，在低嗜肺軍團菌載量下，caspase-1的活化依賴于鞭毛蛋白和NLRC4；而在高細菌載量下，上皮細胞中caspase-1的活化不依賴NLRC4，表明NLRC4炎性小體在caspase-1活化中的作用可能與細菌載量有關[28]。最近的研究表明，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)和活性氧(reactive oxygen species, ROS)也在控制嗜肺軍團菌感染的固有免疫過程中發(fā)揮重要作用，而并不依賴于NLRC4和caspase-1[29]。

圖 3 與NLRC4炎性小體病相關的NLRC4基因突變位點示意圖

Fig 3 NLRC4 gene mutation sites associated with NLRC4 inflammasomopathies

#：自身炎癥伴嬰兒小腸結腸炎相關的突變；+：新生兒多系統(tǒng)炎癥性疾病相關的突變；*：家族性寒冷性自身炎癥綜合征4相關的突變

銅綠假單胞菌是一種醫(yī)院內(nèi)常見的條件致病菌。Lindestam等[30]發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌的菌毛蛋白也可能是NLRC4炎性小體的一種激活因子。據(jù)報道，在低細菌載量時，鞭毛蛋白激活NLRC4參與銅綠假單胞菌感染后的caspase-1活化；但在高細菌載量時，缺乏鞭毛蛋白的銅綠假單胞菌突變體仍能夠通過NLRC4活化caspase-1，其機制暫不明確。

3.3 其他疾病

近年來的研究揭示炎性小體激活可以導致神經(jīng)元和膠質細胞死亡，造成缺血性卒中后腦損傷和神經(jīng)功能缺損。Poh等[31]的研究證實了小膠質細胞在體外和體內(nèi)缺血條件下可釋放NLRC4炎性小體成分和促炎細胞因子(如IL-1β、IL-18)，介導炎癥反應、細胞凋亡和細胞焦亡，使用抑制caspase-1的藥物能夠有效抑制細胞死亡，表明NLRC4炎性小體在小膠質細胞和腦組織中表達、組裝或激活的途徑可能是卒中的潛在治療靶點。

炎性小體成分的基因突變可能增加人類對癌癥的易感性。一項研究表明NLRC4通過抑制細胞增殖和促進細胞死亡來防止結直腸癌的發(fā)生[32]，但未在另一項研究中得到證實[33]。NLRC4還可以放大巨噬細胞內(nèi)的炎癥信號通路，并促進CD4+和CD8+T細胞分泌IFN-γ，抑制黑色素瘤小鼠的腫瘤生長[34]。另有研究發(fā)現(xiàn)，NLRC4炎性小體激活引起的IL-1β分泌，可促進脂肪細胞介導的血管內(nèi)皮生長因子A表達，促進血管生成，加速乳腺癌的進展[35]。

NLRC4缺乏可減緩糖尿病腎病進展，表現(xiàn)為血糖降低、尿白蛋白排泄減少。一項研究顯示，野生型糖尿病模型小鼠腎臟改變?yōu)槟I小球肥大、腎小球基底膜增厚、細胞外基質積累，所有這些效應在NLRC4缺陷小鼠中都得到了顯著的緩解，證明NLRC4炎性小體活化水平的降低減少了腎臟的炎癥反應和巨噬細胞的累積，并下調(diào)NF-κB和JNK信號通路的表達，改善了腎臟損傷[36]。

4 總結

NLRC4炎性小體不僅在防御細菌感染的固有免疫應答中發(fā)揮作用，也與自身炎癥性疾病密切相關。但仍有許多問題待進一步研究，如：NLRC4炎性小體病的活化因子是什么，NLRC4基因突變引起的NLRC4炎性小體異?；罨臋C制是什么，是否還有其他的活化因子和活化途徑，NLRC4炎性小體在不同病灶部位的具體作用機制，NLRC4炎性小體激活后是否產(chǎn)生caspase-1介導的炎癥反應和細胞焦亡以外的效應，NLRC4炎性小體與其他炎性小體的相互作用等。對NLRC4炎性小體的作用機制的研究將為相關疾病的發(fā)病機制提供證據(jù)，并為疾病的預防和治療提供新方向。