謝枝雋，尹 佳，周俊雄

哮喘是一種慢性氣道炎癥，由一系列呼吸道癥狀定義，如喘息、呼吸短促、胸悶和咳嗽，以及可逆的呼氣氣流限制，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。近年來，隨著哮喘發(fā)病率的上升，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]?；ǚ壅T導(dǎo)的過敏性哮喘是哮喘常見的表現(xiàn)形式，樺樹花粉(Betula platyphylla)是我國北方地區(qū)春季主要致敏花粉。在歐洲，70%的樺樹花粉過敏患者，伴有食物過敏癥狀，表現(xiàn)為進(jìn)食樺樹花粉相關(guān)的食物(蘋果，芹菜和榛子)時出現(xiàn)不同程度的口唇腫脹[3]。特異性免疫治療是唯一能有效控制樺樹花粉誘導(dǎo)的過敏性哮喘癥狀，減少吸入激素的用量，改變過敏性哮喘自然進(jìn)程的方法。樺樹花粉特異性免疫治療能抑制交叉反應(yīng)所導(dǎo)致的食物過敏，減少食物誘導(dǎo)的嚴(yán)重過敏反應(yīng)發(fā)生[4]。特異性免疫治療主要通過皮下注射過敏原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生耐受，從而緩解癥狀。過敏癥狀的緩解與Th2型免疫抑制有關(guān)，包括降低Th2相關(guān)細(xì)胞因子水平，如IL-4、IL-5、IL-13等[5-6]。此外，過敏癥狀的緩解還與IgG4相關(guān)，IgG4被認(rèn)為是保護(hù)性抗體，與特異性IgE競爭，抑制肥大細(xì)胞脫顆粒。Th17細(xì)胞是機(jī)體免疫重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞，在過敏性哮喘的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用[7-8]。Th17細(xì)胞主要受轉(zhuǎn)錄因子Rorc調(diào)控，通過分泌IL-17A在哮喘中發(fā)揮作用[9-10]。推測特異性免疫治療緩解過敏性癥狀，也會對Th17細(xì)胞有影響。本研究通過建立中國樺樹花粉誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型，觀察特異性免疫治療對Th17細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/c小鼠，體重18～20 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，在北京協(xié)和醫(yī)院動物房飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境符合SPF級實驗動物標(biāo)準(zhǔn)。實驗過程中，給予實驗動物人道關(guān)懷，并通過北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2 樺樹花粉

樺樹花粉提取物由北京協(xié)和醫(yī)院變應(yīng)原制劑室提供，花粉蛋白濃度檢測使用BCA試劑盒(Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass)。

1.3 動物模型構(gòu)建

BALB/c小鼠于第1、8、15天，頸后皮下注射100 μl的0.25 μg/μl樺樹花粉溶液和100 μl氫氧化鋁佐劑(Imject Alum，Thermo，USA)，共計200 μl。第24～26天，采用霧化激發(fā)的方式，霧化吸入0.1%的樺樹花粉溶液，連續(xù)3 d，每天30 min。第27天，行肺功能檢測，24 h后取材(圖1)。

對照組使用phosphate buffered saline(PBS)代替樺樹花粉，其余操作如前(圖1)。

特異性免疫治療組：樺樹花粉致敏激發(fā)小鼠，從第32天開始，頸后皮下注射150 μl樺樹花粉溶液 (2 μg/μl)，隔天一次，總計8次。第53～55天，霧化吸入0.1%的樺樹花粉溶液，連續(xù)3 d，每天30 min。第56天行肺功能檢查，24 h后取材(圖1)。

1.4 氣道高反應(yīng)性測定

使用DSI公司的無創(chuàng)肺功能儀器NAM(Non-Invasive Airway Mechanics)進(jìn)行小鼠肺功能檢測。主要評價指標(biāo)是比氣道阻力(sRaw)值，為氣道阻力與胸腔氣量的乘積。將小鼠放入校正好的密閉肺功能測定腔內(nèi)，讓其適應(yīng)環(huán)境5 min，分別霧化給予PBS，給予1.56、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/ml的乙酰甲膽堿(Sigma，German)。每次給乙酰甲膽堿后，紀(jì)錄sRaw值。

1.5 血清細(xì)胞因子檢測

采用割尾法收集小鼠血于1.5 ml EP管中，4 ℃過夜；第2天，4 000 r/min，4 ℃離心10 min，吸取清亮上清于新的EP管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩Ｊ褂酶咄慷嘁蜃訖z測平臺Luminex 200TM，多因子試劑盒Milliplex Catalog ID.MCYTOMAG-70K-06.

Mouse Cytokine MAGNETIC Kit (Millipore, Billerica, USA)檢測血清細(xì)胞因子IL-4和IL-17A水平。具體操作嚴(yán)格遵照說明書。

1.6 血清樺樹花粉特異性免疫球蛋白測定

血清樺樹花粉特異性免疫球蛋白(sIgE，sIgG1，sIgG2a)采用酶聯(lián)免疫吸附法測定。碳酸鹽緩沖液(pH9.6)作為包被液，稀釋樺樹花粉，包被96孔板(Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA)，100 μl/孔，4 ℃過夜。次日，使用PBST清洗96孔板3次，每孔加入200 μl封閉液(1% BSA-PBST)，室溫封閉2 h。小鼠血清用封閉液稀釋，分別1∶200稀釋用于IgG1檢測，1∶200稀釋用于IgG2a檢測，1∶10稀釋用于IgE檢測。稀釋后血清加入對應(yīng)96孔板中，100 μl/孔，4 ℃過夜。PBST清洗后，二抗用封閉液按照1∶1 000稀釋，100 μl/孔，室溫孵育2 h。加入TMB顯影劑后，用酶標(biāo)儀在450 nm處讀數(shù)，記錄。實驗重復(fù)3次。二抗分別是：Rat Anti-Mouse IgE (HRP) (ab99574, Abcam, Cambridge, UK), Goat Anti-Mouse IgG1 heavy chain (HRP) (ab97240, Abcam, Cambridge, UK)和Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) (ab97245, Abcam, Cambridge, UK)。

圖 1 動物模型構(gòu)建

Fig 1 Animal model

1.7 脾臟Th17細(xì)胞檢測

試劑PerCP/Cy5.5 anti-mouse IL-17A購自Biolegend公司(BioLegend, San Diego, USA)；Anti-Mouse CD4 FITC 50 μg購自eBioscience公司(eBioscience, San Diego, USA)。將小鼠脾臟放入300目細(xì)胞過濾網(wǎng)袋，置于含10%胎牛血清(Hyclone, Logan, Utah)的RPMI 1640培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)皿上，用注射器橡膠頭輕輕研磨組織，使細(xì)胞滲出過濾網(wǎng)，進(jìn)入培養(yǎng)基。收集單細(xì)胞懸液，離心棄上清。加入紅細(xì)胞裂解液后室溫放置10 min，離心棄上清。PBS洗滌后，用含刺激劑(PMA，Ionomycin和Golgistop)的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在37 ℃，5% CO2的細(xì)胞箱內(nèi)培養(yǎng)5 h。離心后加入CD4-FITC，室溫避光孵育30 min。洗滌后加入固定打孔液，室溫避光孵育30 min。使用打孔洗滌液洗滌細(xì)胞后，加入IL-17A抗體，室溫避光孵育30 min。使用流式細(xì)胞儀FACS Canto plus (BD Biosciences, San Jose, USA)檢測，檢測結(jié)果以淋巴細(xì)胞%CD4+IL-17A+表示，F(xiàn)lowJo軟件進(jìn)行后續(xù)分析。

1.8 Transcription-quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR)檢測

采用TRIzol法提取脾總RNA，Trizol試劑購自天根生化科技(北京)有限公司，型號DP405-02。采用 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa，RR047B，日本)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實驗操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (TliRNase H Plus)和ROX plus(Takara Bio, Inc., Otsu, Japan)用于cDNA擴(kuò)增。qPCR儀器為ABI 7500 Real-Time PCR system(Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)。目的基因引物序列在北京Invitrogen公司合成，上下游序列見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)：95 ℃，30 s；40個PCR循環(huán)(95 ℃，5 s；60 ℃，40 s)。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，按(95 ℃，10 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s)，從60 ℃緩慢加熱到99 ℃。結(jié)果用2-△△Ct進(jìn)行分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.9 肺組織病理

肺組織石蠟包埋后，將修整好的蠟塊置于石蠟切片機(jī)上切片，片厚4 μm。行H&E染色和AB-PAS染色。H&E染色：石蠟切片脫蠟，蘇木素染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)；脫水封片，顯微鏡鏡檢。染色結(jié)果：細(xì)胞核藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)紅色，用于評估氣道周圍炎癥細(xì)胞的浸潤。AB-PAS染色：石蠟切片脫蠟，阿利新藍(lán)染色，高碘酸染液染色；切片入雪弗染液30 min，避光；脫水封片，顯微鏡鏡檢。酸性黏液物質(zhì)染色呈藍(lán)色，糖原和中性黏液物質(zhì)染色呈紫紅色。AB-PAS染色用于評估氣道黏液產(chǎn)生的情況。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗結(jié)果用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，使用GraphPad prism software 5.0作圖。各組數(shù)據(jù)首先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗和方差齊性分析，根據(jù)檢驗結(jié)果，采用Mann-WhitneyUtest或Student’st-test檢驗進(jìn)行兩兩比較。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樺樹花粉誘導(dǎo)的哮喘模型和特異性免疫治療

樺樹花粉致敏和激發(fā)的BALB/c小鼠，sRAW較對照組明顯升高，特別是在乙酰膽堿濃度為25和50 mg/ml時(P<0.01);經(jīng)特異性免疫治療后，sRAW在25和50 mg/ml處明顯降低(圖2)。

圖 2 特異性免疫治療前后氣道高反應(yīng)變化Fig 2 Changes of airway hyper-responsiveness before and after SCITsRaw:比氣道阻力； SCIT:特異性免疫治療；與對照組比較，*P<0.01；與哮喘組比較，#P<0.01

哮喘小鼠血清sIgE，sIgG1和sIgG2a水平顯著高于對照組小鼠P<0.01。經(jīng)特異性免疫治療后，sIgE水平降低，sIgG1和保護(hù)性抗體sIgG2a水平無明顯變化(圖3)。

圖 3 特異性免疫治療前后免疫球蛋白水平變化

Fig 3 Changes of specific immunoglobulins before and after SCIT

SCIT:特異性免疫治療；與對照組比較，*P<0.01；與哮喘組比較，#P<0.01

肺組織病理H&E染色發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠支氣管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，形成多層細(xì)胞環(huán)，同時伴有氣道增厚和水腫。特異性免疫治療組小鼠肺部氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤較少，氣道水腫減輕(圖4)。

肺組織AB-PAS染色發(fā)現(xiàn)：相比對照組小鼠，哮喘小鼠氣道壁廣泛被染成藍(lán)紫色，氣道內(nèi)也可以看到彌散的藍(lán)紫色，表明產(chǎn)生大量的黏液。特異性免疫治療組黏液分泌較少(圖4)。

2.2 小鼠不同時期Th17數(shù)量和Rorc mRNA表達(dá)的變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，哮喘組小鼠脾Th17細(xì)胞數(shù)量(0.37±0.16)較對照組小鼠脾Th17細(xì)胞數(shù)量(0.18±0.86)明顯增高P<0.05；特異性免疫治療組，Th17細(xì)胞數(shù)量(0.16±0.16)較哮喘組顯著降低P<0.01(圖5)。哮喘組小鼠脾Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Rorc的表達(dá)量(3.99±1.39)較對照組(1.79±1.19)顯著升高(P<0.01)。經(jīng)特異性免疫治療后，Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Rorc表達(dá)量(0.65±0.23)較哮喘組明顯降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。哮喘小鼠血清細(xì)胞因子IL-4和IL-17A表達(dá)量均較對照組明顯增高。特異性免疫治療后，細(xì)胞因子IL-4和IL-17A水平明顯降低(圖6)。

3 討論

季節(jié)性過敏性哮喘患病率逐年增加，已成為全球健康關(guān)注的問題之一?；ǚ凼且鸺竟?jié)性過敏性哮喘的主要原因，受多種危險因素的影響, 如突發(fā)惡劣天氣和地區(qū)分布等[11]。樺樹花粉是中國北方地區(qū)春季重要致敏花粉，是過敏性哮喘的重要病因之一[12]。

針對樺樹花粉誘導(dǎo)的過敏性哮喘，回避過敏原是最主要的預(yù)防措施。此外，抗組胺藥物，白三烯抑制劑和糖皮質(zhì)激素都可用于緩解過敏性哮喘癥狀。然而，只有特異性免疫治療能長期控制癥狀，減少吸入激素的用量，改變過敏性哮喘的自然進(jìn)程[13]。特異性免疫治療停止后，仍有長期療效存在。針對樺樹花粉特異性免疫治療的研究對診治過敏性哮喘意義重大。由于臨床研究的復(fù)雜性和眾多不可控影響因素，本實驗使用哮喘動物模型進(jìn)行相關(guān)研究。

圖 4 特異性免疫治療前后肺組織病理所見

Fig 4 Pulmonary histopathology before and after SCIT

SCIT:特異性免疫治療

圖 5 流式細(xì)胞儀檢測特異性免疫治療前后CD4+IL-17A+Th17 細(xì)胞

Fig 5 Flow cytometry analysis: CD4+IL-17A+Th17 cell before and after SCIT

SCIT:特異性免疫治療

圖 6 特異性免疫治療細(xì)胞因子水平變化Fig 6 Changes of cytokines in serum before and after SCITSCIT:特異性免疫治療；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與哮喘組比較，#P<0.01

特異性免疫治療主要通過誘導(dǎo)免疫耐受，從而緩解過敏性哮喘癥狀。在本實驗中，特異性免疫治療組能有效緩解小鼠氣道高反應(yīng)，降低Th2型免疫相關(guān)的細(xì)胞因子水平(IL-4作為Th2型免疫反應(yīng)細(xì)胞因子[14-15]，隨著特異性免疫治療的進(jìn)行逐漸降低)。同時，特異性免疫治療能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體sIgG2a，與特異性IgE競爭，從而抑制肥大細(xì)胞的活化，減少生物活性物質(zhì)的合成和釋放，如組胺、類胰蛋白酶、血小板活化因子和前列腺素D2等[16]。但效果不明顯，可能與治療時間過短有關(guān)。本實驗結(jié)論與既往研究結(jié)果[17-18]一致，證明動物模型建立成功。

除了Th2型炎癥，新出現(xiàn)的IL-17A及其產(chǎn)生細(xì)胞Th17也被認(rèn)為參與哮喘發(fā)病[8,19]。Th17細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。Th17細(xì)胞受轉(zhuǎn)錄因子Rorc調(diào)控，分泌細(xì)胞因子IL-17，包括(IL-17A～F) 6種亞型[10]。本研究結(jié)果顯示，哮喘小鼠的脾Th17數(shù)量，轉(zhuǎn)錄因子Rorc水平和血清主要效應(yīng)分子IL-17A水平均明顯高于對照組小鼠。但特異性免疫治療后相應(yīng)數(shù)值均降低，說明特異性免疫治療可以抑制Th17型免疫炎癥反應(yīng)，符合免疫調(diào)節(jié)的一般規(guī)律。該實驗不足之處：其一，還缺少對Th17細(xì)胞的拮抗細(xì)胞Treg的數(shù)量和功能變化的探究。其二，還需要進(jìn)一步對Th17細(xì)胞下游信號通路的研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，相比對照組，細(xì)胞因子IL-17A和IL-4水平在哮喘組明顯升高，經(jīng)特異性免疫治療后下降。這可作為樺樹花粉特異性免疫治療相關(guān)的生物標(biāo)志物，但仍需要進(jìn)行下一步驗證。血清細(xì)胞因子檢測使用xMAP技術(shù)為基礎(chǔ)的高通量多因子檢測平臺Luminex200TM，xMAP技術(shù)是液相芯片實現(xiàn)多重檢測的基礎(chǔ)。Merck Millipore聯(lián)合Luminex?已應(yīng)用于許多研究的多重生物標(biāo)志物檢測[20-21]。

綜上，樺樹花粉是我國北方地區(qū)春季主要致敏花粉，不僅會引起過敏性鼻炎、過敏性哮喘，還會并發(fā)多種食物過敏反應(yīng)。特異性免疫治療能改善患者癥狀，維持長期療效。樺樹花粉相關(guān)特異性免疫治療能部分抑制Th17細(xì)胞的數(shù)量和功能。