朱春艷，王家軍，薛中儀，劉張淮，張熒熒

（寶應(yīng)縣水生動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇 寶應(yīng) 225800）

近年來(lái)，鱖魚(yú)傳染性脾腎壞死病毒?。↖SKN）給鱖魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失。中山大學(xué)何建國(guó)等證實(shí)了鱖魚(yú)的傳染性脾腎壞死病病原為傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV），屬于虹彩病毒。ISKNV感染鱖魚(yú)脾、腎、肝、鰓、心臟和消化道等組織器官，其中，脾和腎是其主要感染器官[1-2]。一般被ISKNV感染的發(fā)病魚(yú)常表現(xiàn)為游泳異常的癥狀，鰓絲失血發(fā)白，肝臟呈黃色或淺白色，有出血點(diǎn)；腎臟腫大充血；脾臟充血，部分伴有出血等現(xiàn)象。由于水生動(dòng)物病毒類疾病目前尚無(wú)特效治療藥物[3]，因此在生產(chǎn)環(huán)節(jié)中對(duì)病原的早期診斷和及早處理帶毒動(dòng)物體等生產(chǎn)資料對(duì)科學(xué)養(yǎng)殖指導(dǎo)工作有著重要的意義。

目前，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布實(shí)施了SC/T 7211-2011《傳染性脾腎壞死病毒檢測(cè)方法》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，在生產(chǎn)中也已經(jīng)廣泛應(yīng)用。但行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中完成DNA提取和PCR檢測(cè)的方法耗時(shí)較長(zhǎng)。該實(shí)驗(yàn)室在集成DNA快速提取技術(shù)、快速PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，建立了一種簡(jiǎn)便快速的PCR檢測(cè)法，能在3 h內(nèi)完成組織DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳、凝膠成像，得出檢測(cè)結(jié)果，更大程度滿足漁業(yè)生產(chǎn)需求，尤其適用于縣級(jí)水產(chǎn)疫病防控實(shí)驗(yàn)室。該方法該試驗(yàn)在鱖魚(yú)傳染性脾腎壞死病毒快速檢測(cè)方面已有初步驗(yàn)證。為進(jìn)一步驗(yàn)證該快速檢測(cè)方法的靈敏性，該實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了快速檢測(cè)方法的靈敏性比較的實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)將試驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 儀器

DK-8D型水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司生產(chǎn)）；MIKRO200R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司生產(chǎn)）；S1000型PCR儀（美國(guó)B10-RAD公司生產(chǎn)）；BG-Power600型電泳儀（北京萬(wàn)向旭通科技有限公司生產(chǎn)）；INFINITY-3026型凝膠成像系統(tǒng)（法國(guó)VILBER公司生產(chǎn)）。

1.2 試劑

Chelex-100%（sigma-aldrich公司生產(chǎn)）；proteaseK、2KDNAMarker、滅菌雙蒸水和 2*EasyTayPCR SuperMix（均為北京全式金生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）、DNA提取試劑盒（Code No.9765，TaKaRa公司生產(chǎn)）。

1.3 檢測(cè)樣品

發(fā)病塘口采集的瀕死發(fā)病鱖魚(yú)（具有典型傳染性脾腎壞死病癥狀且經(jīng)過(guò)電鏡和PCR雙重確認(rèn)感染ISKNV）3尾，取魚(yú)的腎、脾組織2 g加2 mL PBS冰浴研磨。用PBS分別稀釋101~109倍。分別取100 μL不同濃度的稀釋液作為待檢樣品；陽(yáng)性對(duì)照為研磨原液；陰性對(duì)照為從未受ISKNV感染的鱖魚(yú)，且電鏡和PCR雙重檢測(cè)確認(rèn)ISKNV陰性的魚(yú)腎臟組織研磨液。

1.4 樣品DNA提取

1.4.1 Chelex-100法[6]各取100μL待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性陰性對(duì)照分別置于1.5 mL離心管內(nèi)，加入200 μL 5%Chelex-100懸濁液和20μL蛋白酶K，混勻10 s，56℃水浴20 min，混勻10 s，99℃水浴8 min，4℃環(huán)境下12 000 rpm離心4 min，上清液即為DNA溶液，需耗時(shí)約40 min。

1.4.2 試劑盒法 各取100μL待檢樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性陰性對(duì)照置于1.5mL離心管內(nèi)，加入180μLBuffer GL、20μL Proteinase K 和 10 μL RNase A（10 mg/mL），于56℃水浴2 h至組織完全裂解（難裂解的適當(dāng)延長(zhǎng)裂解時(shí)間，裂解之后先12 000 rpm離心2 min，去除雜質(zhì)之后再進(jìn)行后續(xù)操作）。向裂解液中加入200μL Buffer GB 和 200 μL 100%乙醇，充分吸打混勻。將Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12 000 rpm離心2 min，棄濾液。將500 μL的Buffer WA加入至Spin Column中12 000 rpm離心1 min，棄濾液。將700 μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12 000 rpm離心1min，棄濾液。重復(fù)加Buffer WB1次，棄濾液。將Spin Column安置于Collection Tube上，12 000 rpm離心2 min。將Spin Column安置于新的1.5 mL的離心管上，在 Spin Column膜的中央處加入 50～200 μL Elution Buffer（水浴至 65℃），室溫靜置 5 min。12 000 rpm離心2 min洗脫DNA。洗脫液即為DNA溶液。耗時(shí)約3 h。

1.5 PCR反應(yīng)

1.5.1 快速PCR法 參考文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)和合成引物：ISKNV-FOR（5’-GCATGTATGCTGTTTAGACA-3’）和 ISKNV-REV（5’-AGCATCAAGCAGGCGATCTG-3’），擴(kuò)增真鯛虹彩病毒（RSBV）核苷酸還原酶小亞單位（RNRS）基因187 bp片段。

總反應(yīng)體系 25 μL，其中包含：模板 DNA 1 μL，2×EasyTayPCRSuperMix12.5μL，正反引物各1μL，滅菌雙蒸水 9.5 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性 3 s、56 ℃退火 15 s、72 ℃延伸 10 s，35次循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保溫。需耗時(shí)約1 h。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)PCR法[5]參考傳染性脾腎壞死病毒檢測(cè)方法（SC/T7211-2011）合成引物：ISKNV-F2（5’-CGTGAGACCGTGCGTAGT-3’）和 ISKNV-R2（5’-AGGGTGACGGTCGATATG-3’），擴(kuò)增ISKNV主衣殼蛋白（MCP）基因562 bp片段。

總反應(yīng)體系 50 μL，其中包含：模板 DNA 2.5 μL，2×*EasyTay PCR SuperMix 25 μL，正反引物各 1 μL，滅菌雙蒸水 20.5 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s、61℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)；72℃延伸7 min；4℃保溫。需耗時(shí)約1 h 40 min。

1.6 電泳與凝膠成像檢測(cè)

取6 μL反應(yīng)液在1%瓊脂糖凝膠上電泳，110 V，電泳25 min。取電泳后的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)，根據(jù)UV 254 nm下觀察187 bp的DNA條帶和562的DNA條帶的有無(wú)判斷檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

用Chelex-100法提取模板快速PCR法擴(kuò)增結(jié)果顯示當(dāng)病毒組織原液稀釋103倍PCR擴(kuò)增結(jié)果仍為陽(yáng)性，模板稀釋104倍PCR擴(kuò)增結(jié)果則為陰性（圖1）。

圖1 Chelex-100法提DNA，快速PCR法擴(kuò)增結(jié)果

用Chelex-100法提取模板標(biāo)準(zhǔn)PCR法擴(kuò)增結(jié)果顯示當(dāng)病毒組織原液稀釋102倍PCR擴(kuò)增結(jié)果仍為陽(yáng)性，模板稀釋103倍PCR擴(kuò)增結(jié)果則為陰性（圖2）。

用試劑盒法提取模板快速PCR法擴(kuò)增結(jié)果顯示當(dāng)病毒組織原液稀釋107倍PCR擴(kuò)增結(jié)果仍為陽(yáng)性，模板稀釋108倍PCR擴(kuò)增結(jié)果則為陰性（圖3）。

用試劑盒法提取模板標(biāo)準(zhǔn)PCR法擴(kuò)增結(jié)果顯示當(dāng)病毒組織原液稀釋105倍PCR擴(kuò)增結(jié)果仍為陽(yáng)性，模板稀釋106倍PCR擴(kuò)增結(jié)果則為陰性（圖4）。

3 討論

經(jīng)比較，相同試驗(yàn)條件下快速PCR法與標(biāo)準(zhǔn)PCR法相比不僅減少了擴(kuò)增時(shí)間，且擴(kuò)增效果較好。

圖2 Chelex-100法提DNA，標(biāo)準(zhǔn)PCR法擴(kuò)增結(jié)果

圖3 試劑盒法提DNA，快速PCR法擴(kuò)增結(jié)果

圖4 試劑盒法提DNA，標(biāo)準(zhǔn)PCR法擴(kuò)增結(jié)果

文中靈敏性試驗(yàn)結(jié)果顯示Chelex-100法的提取效率沒(méi)有商品試劑盒的提取效率高，可能因?yàn)镃helex-100法制得的DNA粗提液溶解液較多約320 μL；而試劑盒法制得的DNA粗提液溶解液僅為80 μL，即使DNA含量相同，在作為模版擴(kuò)增時(shí)吸取相同體積的DNA提取液，Chelex-100法的DNA含量較少，故檢測(cè)靈敏性相較于試劑盒法較低。如何提高Chelex-100法DNA提取效率，有待進(jìn)一步探索。Chelex-100法雖然目標(biāo)DNA提取效率沒(méi)有商品試劑盒法高，但是該法具有簡(jiǎn)單快速、清潔無(wú)毒、檢材用量少等特點(diǎn)[6-8]，在實(shí)際運(yùn)用中也存在一定的優(yōu)勢(shì)。在發(fā)病塘口（當(dāng)病毒含量達(dá)到一定含量）快速診斷時(shí)Chelex-100法更加快速便捷且檢出效果較好。但在鱖魚(yú)苗種快速檢疫中，建議使用試劑盒法提取DNA結(jié)合快速PCR法檢測(cè)，以防漏檢。