胡昌弟　余旭良

[摘要] 目的 比較萋-尼抗酸染色（簡(jiǎn)稱(chēng)Z-N染色）冷染法與熱染法查找抗酸桿菌的差異，探討萋-尼抗酸染色冷染法的應(yīng)用價(jià)值。 方法 選取2017年1～12月衢州市人民醫(yī)院確診為肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本355份，每份痰標(biāo)本涂6張涂片。室溫下干燥后于5 s內(nèi)穿過(guò)酒精燈火焰上方4次固定。其中冷染法3張涂片滴加含有1% Triton X-100石碳酸復(fù)紅染液，置室溫5 min、15 min、30 min后分別用流水緩慢沖去染色液;再滴加5%鹽酸酒精脫色1～3 min，用水緩慢沖洗;最后用堿性美蘭復(fù)染1 min，用水緩慢沖洗;干燥后，用油鏡觀(guān)察。熱染法3張涂片滴加不含1% Triton X-100石碳酸復(fù)紅染液，然后加熱到微微冒熱氣，分別放置5 min、15 min、30 min后用流水緩慢沖去染色液;其余步驟操作同冷染法。比較兩種方法抗酸桿菌的陽(yáng)性檢出率、褪色速度等方面的差異。 結(jié)果 355份痰標(biāo)本冷染法5 min、15 min、30 min陽(yáng)性率分別為29.57%、32.68%、32.68%，平均陽(yáng)性率為31.64%;355份痰標(biāo)本熱染法5 min、15 min、30 min陽(yáng)性率分別為32.96%、32.68%和32.96%，平均陽(yáng)性率為32.87%;經(jīng)統(tǒng)計(jì)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。兩種方法的陽(yáng)性片褪色速度結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 在萋-尼抗酸染色初染液石碳酸復(fù)紅中加入表面活性劑Triton X-100，能改變分枝桿菌細(xì)胞壁的通透性，促進(jìn)染料進(jìn)入分枝桿菌的菌體?？顾釛U菌陽(yáng)性檢出率和陽(yáng)性片的褪色速度與傳統(tǒng)的熱染法比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與傳統(tǒng)熱染法比較，操作簡(jiǎn)單并避免了有害氣體污染環(huán)境，是一種值得推廣的方法。

[關(guān)鍵詞] 萋-尼抗酸染色;抗酸桿菌;冷染法;熱染法

[中圖分類(lèi)號(hào)] R446? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）15-0110-04

Comparative analysis of the results of cold staining and heat staining of Ziehl-Neelsen acid-fast staining

HU Changdi? ?YU Xuliang

Department of Clinical Laboratory， Quzhou People's Hospital in Zhejiang Province， Quzhou? ?324000， China

[Abstract] Objective To compare the difference between Ziehl-Neelsen acid-fast staining cold staining and heat staining in finding acid-fast bacilli， and to explore the application value of cold staining method and heat staining method of Ziehl-Neelsen acid-fast staining. Methods A total of 355 specimens of sputum in diagnosed tuberculosis patients from January to December 2017 in Quzhou People's Hospital were selected. Six smears were applied to each sputum specimen. After drying at room temperature， it was fixed 4 times over the flame of the alcohol lamp within 5 s. Among them， 3 smears of cold staining method were added with 1% Triton X-100 stone carbonate red dyeing solution， and left at room temperature for 5 min， 15 min and 30 min， then slowly washed away the staining solution with running water. And then the smears were added with 5% hydrochloric acid alcohol to decolorize for 1-3 min and rinsed slowly with water. Finally the smears were counterstained with alkaline melanin for 1 min， and rinsed slowly with water. After drying， they were observed with oil mirror. The three smears of the heat-dyeing method were added with 1% Triton X-100 stone carbonate red dyeing solution， and then heated to slightly hot air， and the dyeing liquid was slowly washed away with running water for 5 min， 15 min and 30 min respectively. The remaining step operation was the same as the cold dyeing method. The difference in the positive detection rate and the fading speed of the acid-fast bacilli was compared between the two methods. Results The positive rates of 355 sputum samples of cold staining for 5 min， 15 min and 30 min were 29.57%， 32.68% and 32.68%， respectively. The average positive rate was 31.64%. The positive rates of 355 sputum specimens of thermal dyeing method for 5 min， 15 min and 30 min were 32.96%， 32.68%， and 32.96%， respectively， and the average positive rate was 32.87%. There was no statistically significant difference （P>0.05）. There was no significant difference in the fading speed of the positive films between the two methods（P>0.05）. Conclusion The addition of the surfactant Triton X-100 to the stone carbonate red initial dyeing solution of Ziehl-Neelsen stain can change the permeability of the mycobacterial cell wall and promote the entry of the dye into the mycobacteria. The positive detection rate of acid-fast bacilli and the fading rate of positive tablets are not significantly different from those of traditional heat-staining methods. And the method is simple to operate and avoids harmful gas pollution to the environment compared with the traditional thermal dyeing method. It is a method worth promoting.

[Key words] Ziehl-Neelsen acid-fast staining; Acid-fast bacilli; Cold staining method; Thermal dyeing method

目前，全球有大約1/3的人口感染結(jié)核分枝桿菌，有2000萬(wàn)活動(dòng)性結(jié)核病患者，每年新發(fā)病例900萬(wàn)人，每年約有300萬(wàn)人死于結(jié)核病。中國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，我國(guó)結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為 130萬(wàn)，占全球發(fā)病人數(shù)的14%，位居全球第2位[1]。一種好的檢測(cè)、診斷方法對(duì)結(jié)核病的防控起到至關(guān)重要的作用。隨著實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的發(fā)展，很多先進(jìn)的技術(shù)被應(yīng)用，Xpert MTB/RIF檢測(cè)具有準(zhǔn)確、快速、安全性高等優(yōu)點(diǎn)[2-4]，但費(fèi)用昂貴，患者較難承受。結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)雖然敏感度高，而且能進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗(yàn)，但是操作相對(duì)比較繁瑣，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，平均報(bào)告陽(yáng)性的時(shí)間需13 d[5]，陰性更是需42 d。因此痰涂片抗酸染色目前仍是各實(shí)驗(yàn)室重要檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法。相對(duì)于其他檢測(cè)方法，高質(zhì)量的痰涂片鏡檢有自身特有的優(yōu)勢(shì)：（1）作為診斷手段，對(duì)傳染性肺結(jié)核的診斷比X線(xiàn)的準(zhǔn)確性高。（2）作為實(shí)驗(yàn)方法，技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，容易標(biāo)準(zhǔn)化和完成操作。（3）設(shè)備投入少，檢查成本低。（4）從收到標(biāo)本到報(bào)告結(jié)果的時(shí)間短，能夠滿(mǎn)足臨床診斷的需要。（5）對(duì)涂陽(yáng)患者的治療效果，能夠做出及時(shí)和準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)[6]。Z-N染色作為經(jīng)典的涂片抗酸染色方法，目前仍被各個(gè)醫(yī)院廣泛使用。但是傳統(tǒng)的熱染法，在滴加石碳酸復(fù)紅后需要加熱，操作較為繁瑣，而且石碳酸復(fù)紅染液在加熱時(shí)會(huì)產(chǎn)生揮發(fā)性苯酚氣體，這種氣體會(huì)污染環(huán)境，影響實(shí)驗(yàn)室工作人員的身體健康[7]。本文通過(guò)比較分析冷染法與熱染法結(jié)果的差異，探討萋-尼抗酸染色冷染法的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集衢州市人民醫(yī)院2017年1～12月確診為結(jié)核患者痰標(biāo)本355份，所有標(biāo)本為患者漱口后咳出的深部痰液，放置于無(wú)菌痰盒內(nèi)。

1.2 染液配置

1.2.1 石碳酸復(fù)紅染液? 稱(chēng)取堿性復(fù)紅1 g 溶于10 mL 95% 乙醇中，然后加入5%石碳酸水溶液，直至100 mL。此染液用于熱染法初染。

1.2.2 1%Triton X-100石碳酸復(fù)紅染液? 取1.2.1項(xiàng)石碳酸復(fù)紅染液100 mL，加入Triton X-100 至終濃度為1%，此染液用于冷染法初染。

1.2.3 5%鹽酸乙醇脫色液? 取濃鹽酸5 mL，緩慢加入95 mL 95%乙醇中。用于冷染法和熱染法的脫色。

1.2.4 堿性美藍(lán)復(fù)染液? 取美藍(lán)0.3 g，溶于50 mL 95% 乙醇中，加蒸餾水至 100 mL。使用時(shí)用蒸餾水進(jìn)行5倍稀釋。用于冷染法和熱染法的復(fù)染。

1.3 主要材料

奧林巴斯 CX211顯微鏡、青島海爾 HR40-ⅡB2 生物安全柜，帆船牌清潔﹑無(wú)油脂一端磨砂面的新玻片。

1.4 染色方法

1.4.1 涂片制備? 取脫脂干燥的新玻片，用2B鉛筆在磨砂一端寫(xiě)上患者姓名和編號(hào)，用折斷的竹簽茬端，挑取痰標(biāo)本中呈膿樣﹑干酪樣可疑部分均勻涂抹成約10 mm×20 mm的卵圓形痰膜，每份痰標(biāo)本涂片6張，盡量使每張?zhí)灯娜√挡课哗p痰膜厚度﹑痰膜大小基本一致;將涂好的痰涂片室溫下干燥后于5 s內(nèi)穿過(guò)酒精燈火焰上方4次將其固定。

1.4.2 染色方法? Z-N染色按《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》規(guī)定方法進(jìn)行初染﹑脫色﹑復(fù)染[6]。其中熱染法3張涂片滴1.2.1項(xiàng)石碳酸復(fù)紅染液，染液要覆蓋痰膜，然后加熱到微微冒熱氣分別放置5 min、15 min、30 min后，用流水緩緩沖掉染液;再滴加5%鹽酸酒精脫色1～3 min，用水緩慢沖洗;最后用堿性美蘭復(fù)染1 min，用水緩慢沖洗;干燥后，用油鏡觀(guān)察。冷染法3張涂片滴加1.2.2項(xiàng)石碳酸復(fù)紅染液后，染液要覆蓋痰膜，放室溫不加熱，分別在5 min、15 min、30 min后，用流水緩緩沖掉染液;再滴加5%鹽酸酒精脫色1～3 min，用水緩慢沖洗;最后用堿性美蘭復(fù)染1 min，用水緩慢沖洗;干燥后，用油鏡觀(guān)察。

1.5 結(jié)果判斷

顯微鏡鏡檢及結(jié)果判斷嚴(yán)格按《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》[6]?？顾釛U菌陰性：連續(xù)觀(guān)察300個(gè)不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌;報(bào)告抗酸桿菌數(shù)：1～8條/300個(gè)視野;抗酸桿菌（+）為3～9條/100個(gè)視野，連續(xù)觀(guān)察300個(gè)視野;抗酸桿菌（++）為1～9條/10個(gè)視野，連續(xù)觀(guān)察100個(gè)視野;抗酸桿菌（+++）為1～9條/每個(gè)視野，連續(xù)觀(guān)察50個(gè)視野?？顾釛U菌（++++）為≥10條/每個(gè)視野，連續(xù)觀(guān)察50個(gè)視野。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 冷染法與熱染法檢測(cè)結(jié)果比較

冷染法5 min、15 min、30 min陽(yáng)性率分別為29.57%、32.68%、32.68%;平均陽(yáng)性率為31.64%;熱染法5 min、15 min、30 min陽(yáng)性率分別為32.96%、32.68%和32.96%，平均陽(yáng)性率為32.87%。其中冷染法5 min的陽(yáng)性率略低于同組別15 min和30 min的陽(yáng)性率。冷染法5 min、15 min 和30 min比較，各陽(yáng)性等級(jí)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。熱染法5 min、15 min、30 min的結(jié)果比較，各組各陽(yáng)性等級(jí)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。熱染法與冷染法比較，各組之間均無(wú)明顯差異（P>0.05）（表1）。

2.2 冷染法與熱染法褪色速度比較

收集染色15 min所有陽(yáng)性片（冷染法116張，熱染法116張）進(jìn)行褪色速度試驗(yàn)，每周重復(fù)閱讀這些陽(yáng)性片，當(dāng)陽(yáng)性變?yōu)殛幮曰虺霈F(xiàn)量化誤差即為褪色，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明冷染法與熱染法陽(yáng)性涂片褪色速度結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

3 討論

隨著實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的發(fā)展，更多地檢測(cè)技術(shù)被運(yùn)用到痰標(biāo)本檢測(cè)中。Xpert MTB/RIF作為近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)技術(shù)，具有準(zhǔn)確、快速、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)對(duì)結(jié)核分枝桿菌以及利福平耐藥進(jìn)行快速檢測(cè)，對(duì)于早期診斷發(fā)現(xiàn)傳染源，控制結(jié)核病流行傳播具有重要意義。但由于目前該檢測(cè)項(xiàng)目尚未納入醫(yī)保，昂貴的檢測(cè)費(fèi)用以及檢測(cè)需要相關(guān)的儀器，從而限制了其在基層醫(yī)院的使用[8-9]。結(jié)核分枝桿菌液體培養(yǎng)是在培養(yǎng)管底部包埋熒光物質(zhì)，可隨著管內(nèi)氧含量的變化而發(fā)生反應(yīng)，若管中有分枝桿菌生長(zhǎng)，則管內(nèi)氧氣被消耗，管底熒光物質(zhì)被激活，在特定光源的激發(fā)下釋放熒光，系統(tǒng)每小時(shí)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)管內(nèi)的熒光強(qiáng)度1次，從而判斷管內(nèi)分枝桿菌生長(zhǎng)情況[10-11]。當(dāng)痰中細(xì)菌達(dá)到100個(gè)/mL即能檢出，但培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，平均報(bào)告陽(yáng)性的時(shí)間需要13 d，陰性更是需42 d。因此，痰涂片鏡檢目前仍是各實(shí)驗(yàn)室重要檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的方法。萋-尼氏抗酸染色鏡檢是目前國(guó)內(nèi)主要的痰涂片鏡檢方式[12]。但是傳統(tǒng)的熱染法，在滴加石碳酸復(fù)紅后需要加熱，操作較為繁瑣，且石碳酸復(fù)紅染液在加熱時(shí)會(huì)產(chǎn)生揮發(fā)性苯酚氣體，這種氣體會(huì)污染環(huán)境，影響實(shí)驗(yàn)室工作人員的身體健康。

結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中含有大量脂質(zhì)而不易著色，由于結(jié)核桿菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞成分的這一特殊性，具有經(jīng)堿性染料染色后能耐受酸性介質(zhì)脫色的特性。萋尼染色的基本原理即根據(jù)結(jié)核桿菌這一特性先用石碳酸復(fù)紅加溫使抗酸桿菌著色，加溫著色后的抗酸桿菌能夠耐受酸性酒精脫色，顯微鏡觀(guān)察時(shí)保持紅色，而其他脫落細(xì)胞以及標(biāo)本中的非抗酸菌被酸性酒精脫色后可被復(fù)染液美藍(lán)染為藍(lán)色[13]。

Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）是一種非離子型表面活性劑，能改變分枝桿菌細(xì)胞壁的通透性，促進(jìn)染料進(jìn)入分枝桿菌的菌體，在初染液中加入Triton X-100起到助染的作用，無(wú)需加熱即能使抗酸桿菌著色[14]。著色后的抗酸桿菌同樣能夠耐受酸性酒精脫色，抗酸桿菌保持紅色，而其他脫落細(xì)胞以及標(biāo)本中的雜菌被酸性酒精脫色后可被復(fù)染液美藍(lán)染為藍(lán)色。此外Triton X-100還是一種很好的分散劑，能分散標(biāo)本中成堆出現(xiàn)的分枝桿菌，更利于找到抗酸桿菌。

本研究表1顯示，冷染法5 min、15 min、30 min陽(yáng)性率分別為29.57%、32.68%、32.68%，平均陽(yáng)性率為31.64%;結(jié)果與相關(guān)報(bào)道一致[15-17]。熱染法5 min、15 min、30 min陽(yáng)性率分別為32.96%、32.68%和32.96%，平均陽(yáng)性率為32.87%，結(jié)果與相關(guān)報(bào)道一致[18-20]。冷染法5 min、15 min和30 min比較，各組各陽(yáng)性等級(jí)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。熱染法與冷染法比較，各組之間均無(wú)明顯差異（P>0.05）。

通過(guò)觀(guān)察，熱染法組隨著染色的時(shí)間的延長(zhǎng)陽(yáng)性率未有明顯的差異，顯微鏡下看到的抗酸桿菌紅色明顯，表明只要按照《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃﹑痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》規(guī)定加熱5 min即能滿(mǎn)足要求。冷染組初染時(shí)間5 min的陽(yáng)性率略低于其他組別，這可能由于少部分細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，染料進(jìn)入菌體較慢，但隨著初染時(shí)間增加到15min，其染色的結(jié)果與所有的熱染法比較，陽(yáng)性率無(wú)明顯差異，表明少部分未染上色的抗酸桿菌，通過(guò)延長(zhǎng)染色時(shí)間還是能著色的。因此，我們建議用冷染法時(shí)，第一步初染的時(shí)間不能低于15 min。

本研究結(jié)果顯示，冷染法與熱染法陽(yáng)性涂片褪色速度比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），兩者的分枝桿菌形態(tài)也無(wú)差異。因此，冷染法與熱染法對(duì)陽(yáng)性片的保存、實(shí)驗(yàn)人員的鏡檢以及盲法復(fù)檢可完全等同操作。

目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)核桿菌的方法很多，但傳統(tǒng)的Z-N染色，仍然以其價(jià)廉、簡(jiǎn)單、快速以及能對(duì)患者的療效評(píng)價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，為廣大醫(yī)院所使用。但是傳統(tǒng)的熱染法，在滴加石碳酸復(fù)紅后需要加熱，操作較為繁瑣，而且石碳酸復(fù)紅染液在加熱時(shí)會(huì)產(chǎn)生揮發(fā)性苯酚氣體，這種氣體會(huì)污染環(huán)境，影響實(shí)驗(yàn)室工作人員的身體健康。冷染法是傳統(tǒng)法的初染液石碳酸復(fù)紅中加入表面活性劑Triton X-100，能改變分枝桿菌細(xì)胞壁的通透性，促進(jìn)染料進(jìn)入分枝桿菌的菌體，只要把第一步初染的時(shí)間延長(zhǎng)到15 min，即能得到可靠的結(jié)果。

綜上所述，冷染法對(duì)比傳統(tǒng)的熱染法，減少了加熱等繁瑣的步驟，減少了苯酚等有害氣體對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境以及人員的影響，是一種值得推廣的方法。

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