潘 陽，王召軍，李雪君，閆筱筱，張洪映，孫計平，崔 紅*

1.河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，鄭州市文化路95號 450002

2.河南省農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，河南省許昌市魏都區(qū)青梅路與永昌大道交叉口 461000

腺毛由植物表皮細胞分化而來，在植物抵御外界不良環(huán)境和次生代謝物質(zhì)積累和利用中起重要作用［1］。煙草腺毛豐富，種類多樣。西柏烷二萜和糖酯化合物是煙草腺毛分泌物的主要成分，這些成分不僅是重要的香氣前體物質(zhì)，而且對蚜蟲也具有明顯的趨避作用［2-4］。因此提高煙草腺毛密度是提高煙草抗性和改良煙葉品質(zhì)的重要途徑之一。煙草腺毛密度受光照［5］、溫度［6］、水分［7］、土壤［8］、肥料［9-11］和生態(tài)環(huán)境［12］等多種條件的影響，但遺傳因素對煙草腺毛密度仍然起決定性作用。不同煙草類型［13］、品種［14-15］、葉位及葉片發(fā)育時期［16-17］的腺毛密度和分泌物含量與組分均有較大差異，在一定程度上影響煙葉的品質(zhì)和風格。培育高腺毛密度、高分泌型的煙草品種是煙草常規(guī)育種的重要目標之一。豫煙11號是以煙草葉面分泌物為育種目標系統(tǒng)選育出的特香型烤煙品種，其葉面分泌物總量高于K326、紅大、翠碧1號、中煙100等烤煙品種，尤其賴柏當類二萜化合物含量顯著增加［13］。該品種的審定和推廣證明了腺毛分泌物含量增加對煙葉品質(zhì)的顯著貢獻，而其“特香型”風格定位也體現(xiàn)了腺毛分泌物組分的改變對烤煙香氣風格所產(chǎn)生的影響。然而煙草遺傳背景狹窄，缺乏腺毛改良相關的遺傳材料，通過常規(guī)育種手段進行腺毛改良進展緩慢。采用基因編輯技術提高煙草腺毛密度，能在不改變分泌物組分的前提下提高分泌物含量，既保證了烤煙原有的香氣風格又提高了香氣量，是進行烤煙葉面化學改良的一條有效途徑。

植物B型細胞周期蛋白（B-type cyclins）參與細胞分裂過程中從G2向M期的轉(zhuǎn)換，在植物生長發(fā)育過程中起重要作用［18］。擬南芥CycB1;2基因在腺毛中的特異表達，可使單細胞腺毛轉(zhuǎn)變?yōu)閰采嗉毎拖倜?9］。番茄SlCycB2基因表達受到抑制后，多細胞非分泌型腺毛（Ⅲ型和V型）明顯增多，而分泌型腺毛（I型）消失［20-21］。NtCycB2在煙草中過表達及在番茄中異源表達均出現(xiàn)腺毛密度明顯減少的現(xiàn)象［22］。這些研究結果證明，NtCycB2基因?qū)煵菹倜陌l(fā)生具有一定負向調(diào)控作用，可能成為利用基因編輯技術提高腺毛密度的理想靶點。但B型細胞周期蛋白在調(diào)控植物腺毛發(fā)生的同時，對植物生長發(fā)育也有多重影響，涉及根系發(fā)育［23］和種子萌發(fā)［24］等過程。在番茄中，SlCycB2基因的過表達可導致花器官異常、不育，抑制SlCycB2基因的表達對植株表型并無明顯影響［22］，但關于NtCycB2基因?qū)熤晟L發(fā)育和物質(zhì)積累的影響目前還未見報道。為此，以煙草品種K326為材料，通過基因編輯技術敲除NtCycB2基因后創(chuàng)制了高腺毛密度的K326純合材料（HK326），并分析了NtCycB2基因敲除對煙株生長發(fā)育、葉面化學成分、烤后煙中性香氣物質(zhì)的影響，旨在探索NtCycB2基因在煙草葉面化學成分定向調(diào)控及煙草品種分子改良中的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為煙草品種K326，無菌苗于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25℃、相對濕度60%，光周期16 h光/8 h暗。大田試驗于2018年進行，地點設置在河南省許昌市河南省農(nóng)科院煙草研究所試驗田，于5月8日移栽，按照優(yōu)質(zhì)烤煙栽培規(guī)程進行田間管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 載體構建

根據(jù)已發(fā)表的煙草NtCycB2蛋白序列［22］，在K326基因組序列數(shù)據(jù)庫（https://solgenomics.net/organism/Nicotiana_tabacum/genome）中 進 行 Blast比對，獲得NtCycB2基因的兩個拷貝（Nitab4.5_0014697g0010.1和 Nitab4.5_0012062g0010.1）。借助CRISPR2在線軟件（http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/），依據(jù)其同源序列設計 gRNA：GTGATCAACCACCCACAAG，合成二聚體后連入CRISPR-Cas9載體，并獲得NtCycB2基因敲除載體。載體中gRNA由擬南芥U6啟動子啟動，篩選標記為潮霉素。

1.2.2 遺傳轉(zhuǎn)化

采用葉盤轉(zhuǎn)化法進行煙草遺傳轉(zhuǎn)化［25］。將上述構建得到的NtCycB2基因敲除載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101菌株，于YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌液OD600值為0.4～0.6，侵染預培養(yǎng)2 d的K326葉圓片8 min，黑暗條件下共培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基［MS培養(yǎng)基 +0.15 mg/Lα-萘乙酸（1-Naphthalene acetic acid，NAA）+1.0 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）+8 mg/L 潮 霉 素 B（Hygromycin B，Hyg）+50 mg/L 頭 孢 噻 肟 鈉（Cefotaxime sodium，CTX）］上分化，待長出不定芽后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+0.15 mg/L NAA+8 mg/L Hyg）繼續(xù)培養(yǎng)，以獲得抗性植株。

1.2.3 分子鑒定

采用CTAB法提取抗性植株的基因組DNA，在gRNA附近設計檢測引物（F1：ATGAGCCGAAG AAATGGAAA，R1：CAACATCAAGCAAACAAGT AC），對T0代幼苗中NtCycB2基因gRNA區(qū)域進行擴增。PCR反應條件：94℃預變性5 min；94℃30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；38個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收，連入pMD19-T載體，送金唯智公司測序，以鑒定其突變情況。得到的陽性植株自交留種，并獲得T1代煙草種子。

煙草T1代種子采用漂浮育苗，待煙苗生長至三葉一心時，剪取T1代單株葉片，采用CTAB法提取基因組DNA。利用潮霉素抗性基因擴增引物（F2：CGAGAGCCTGACCTATTGCAT，R2：CTGCT CCATACAAGCCAACCAC）對T1代單株進行鑒定，并篩選出無轉(zhuǎn)基因篩選標記的單株。

1.2.4 農(nóng)藝性狀調(diào)查

2018年3月將K326及去載體的NtCycB2基因敲除株系按照行業(yè)標準［26］進行育苗，5月8日移栽至河南省農(nóng)科院煙草研究所試驗田，并按照標準方法［27］進行大田種植與管理，保證各株系在相同條件下正常生長。依照煙草行業(yè)標準方法［28］在煙株現(xiàn)蕾期進行農(nóng)藝性狀指標的測量。

1.2.5 腺毛形態(tài)學分析

于旺長期取煙株上、中、下部的葉片進行化學染色、腺毛形態(tài)觀察及密度統(tǒng)計。實驗操作參考婁亞楠等［29］的方法，將葉片置于0.2%（W/V）的羅丹明B水溶液中浸染30 min，染色結束后用蒸餾水漂洗3次，沖洗掉未結合的染料。用濾紙吸干葉片表面水分后，置于超景深顯微鏡（VHR-5000，日本基恩士公司）下進行腺毛觀察，并在葉片上表皮中部隨機選擇3個視野進行腺毛密度的統(tǒng)計。

1.2.6 葉面化學成分分析

煙株打頂4周后取中部葉片（第12葉位），在二氯甲烷溶液中浸提。浸提液加入1 mL內(nèi)標（2.020 mg/mL的蔗糖八乙酸酯和2.542 mg/mL的正十七烷醇的混合溶液）后過濾，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮后，在氮氣保護下將溶劑吹干。加入500 μL 1∶1（V∶V）的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）和N,O-雙三甲硅基三氟乙酰胺（BSTFA），75℃水浴中進行衍生化反應60 min，然后加入N,O-雙乙酰胺和吡啶各125 μL。采取GC/MS分析儀（美國Agilent公司，色譜儀型號HP-5890，質(zhì)譜儀型號vc-70SE）進行樣品化學成分的定性和定量分析，色譜參數(shù)檢測參考王霄龍等［30］的方法。

1.2.7 中性香氣物質(zhì)成分分析

選取烤后中部煙葉，研磨，用孔徑0.25 mm過濾篩過濾。稱取10 g煙樣置于500 mL圓底燒瓶中，并依次加入1 g檸檬酸和350 mL蒸餾水。另取40 mL二氯甲烷置于250 mL圓底燒瓶中并加入500 μL內(nèi)標（硝基苯）。兩個圓底燒瓶聯(lián)通后同時加熱蒸餾萃取，收集250 mL燒瓶中有機相，加入10 g左右無水硫酸鈉搖勻至溶液澄清，水浴濃縮有機相至1 mL左右。所得樣品采用GC/MS聯(lián)用儀（美國Agilent公司 HP5890Ⅱ-5972）進行定性分析，參考邸慧慧等［31］的方法設定色譜參數(shù)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均分別進行3次獨立測定，獲得數(shù)據(jù)采用SPSS 17軟件進行單因素方差分析及最小顯著差法多重比較，用Excel 2013軟件進行圖表繪制。

2 結果與討論

2.1 多腺毛K326的創(chuàng)制和篩選

采用農(nóng)桿菌介導法將攜帶NtCycB2基因敲除載體的GV3101菌株轉(zhuǎn)化煙草K326，獲得了23株耐受潮霉素的陽性植株。表型鑒定發(fā)現(xiàn)，大部分陽性植株在形態(tài)上與對照沒有明顯差異，但其中1個單株腺毛濃密，整株呈毛茸狀（圖1B），被命名為多腺毛K326（Hairy K326，HK326）。

圖1 HK326材料的創(chuàng)制Fig.1 Screening of HK326 line

HK326在T0代產(chǎn)生多腺毛表型，可能是NtCycB2的純合突變所致。為驗證這一推測，利用特異引物對HK326的gRNA區(qū)域進行擴增和PCR產(chǎn)物測序鑒定。結果發(fā)現(xiàn)，HK326中NtCycB2基因在gRNA區(qū)出現(xiàn)套峰（雙峰），說明HK326中NtCycB2基因已經(jīng)發(fā)生了編輯，但并未純合（圖2A）?？紤]到K326中存在兩個NtCycB2基因拷貝，因此HK326中這種雜合狀態(tài)也可能是由于兩個拷貝發(fā)生了不同突變造成的。為此，進一步對HK326中NtCycB2基因進行了單克隆測序，在測序的10個單克隆中總共檢測到兩種類型的突變體，分別缺失了4 bp（同時還發(fā)生了1個C/T堿基突變）和7 bp（圖2B），但并沒有檢測到野生型序列，說明HK326中NtCycB2基因兩個拷貝的突變都已經(jīng)純合。

為獲得無轉(zhuǎn)基因元件的敲除植株，將HK326自交繁種，利用潮霉素抗性基因篩選引物對HK326 T1代幼苗進行單株鑒定，結果如圖2C所示。在所檢測的80個單株中，有23株沒有擴增出潮霉素抗性基因片段，去載體單株的比例為28.8%。χ2檢測表明，含載體與去載體單株數(shù)量符合3∶1的比例，說明敲除載體在HK326基因組中為單拷貝插入。

圖2 HK326材料的分子鑒定Fig.2 Molecular identification of HK326

2.2 K326和HK326農(nóng)藝性狀的比較

為比較NtCycB2基因敲除對煙株生長發(fā)育的影響，將去載體后的HK326敲除植株與K326對照在河南省農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所試驗田進行種植。農(nóng)藝性狀指標調(diào)查結果見表1?？梢钥闯?，與對照K326相比，HK326在株高和節(jié)距上表現(xiàn)出顯著差異，而在莖圍、最大葉長、最大葉寬和葉片數(shù)上HK326略高于對照K326。總體來看，HK326敲除植株生長勢強于對照K326。

2.3 K326和HK326的腺毛密度比較

在煙株現(xiàn)蕾期分別對K326和HK326上部葉（第16葉位）、中部葉（第8葉位）和下部葉（第4葉位）進行葉面腺毛形態(tài)觀察和密度統(tǒng)計，結果見表2和圖3?？梢钥闯?，HK326與對照K326的葉面腺毛均由長柄分泌型、短柄分泌型和非分泌型3種類型組成，且均以長柄分泌型為主；隨著葉片的生長發(fā)育，腺毛密度表現(xiàn)出逐漸減少的趨勢，但腺毛類型保持不變。HK326與對照相比，腺毛密度增加，尤其是在上部葉中表現(xiàn)更為明顯。除了非分泌型腺毛外，長柄分泌型和短柄分泌型均增加顯著，同時長柄分泌型腺毛出現(xiàn)分枝現(xiàn)象，腺毛總數(shù)為對照的3倍。羅丹明B可與糖酯結合使其染色，根據(jù)染色深淺可以判斷腺毛分泌能力的強弱，從圖3中可以看出，長柄分泌型腺毛著色程度大于短柄和非分泌型腺毛，表明其碳水化合物含量豐富；HK326腺毛不僅著色比對照深，而且腺頭飽滿，發(fā)育完善，具有旺盛的物質(zhì)合成和分泌能力。

表1 K326和HK326農(nóng)藝性狀調(diào)查結果①Tab.1 Agronomic traits of K326 and HK326

表2 K326和HK326各類腺毛的密度①Tab.2 Density of trichomes of K326 and HK326 （根/mm2）

A.長柄分泌型腺毛；B.短柄分泌型腺毛；C.非分泌型腺毛；D.長柄分枝腺毛（200×）

2.4 K326和HK326的二萜化合物分析

圖4 K326和HK326葉面二萜化合物的含量Fig.4 Diterpenes contents in K326 and HK326

二萜化合物作為腺毛分泌物的主要成分，不僅是重要的香氣前體物質(zhì)，也對煙株抗性有重要影響［2,32］。為明確NtCycB2基因敲除對煙草二萜化合物組分和含量的影響，利用二氯甲烷萃取葉面化學成分并進行GC/MS檢測，結果見圖4?？梢钥闯?，HK326及對照的二萜化合物組成基本一致，均由西柏三烯一醇、西柏三烯二醇、西柏三烯二醇同分異構體組成，但含量變化較大。其中，HK326的西柏三烯一醇含量比對照提高72.09%；西柏三烯二醇比對照提高214.01%；西柏三烯二醇同分異構體比對照提高213.10%；從總量上看，HK326為151.01 μg/cm2，對照 K326 為 48.3 μg/cm2，提高 212.65%，可見HK326的二萜化合物含量遠高于K326。

2.5 K326和HK326烤后煙葉中性香氣成分分析

為比較NtCycB2基因敲除對烤后煙葉中性香氣成分和含量的影響，對K326、HK326烤后煙葉的中性香氣成分進行提取分析，結果見表3。

從表3可以看出，敲除株系HK326中性香氣物質(zhì)含量均高于對照K326，其中苯丙氨酸類物質(zhì)含量比K326提高36.5%；棕色化產(chǎn)物類含量提高11%；類西柏烷類物質(zhì)含量提高39.3%；類胡蘿卜素類物質(zhì)含量略高于對照K326；新植二烯含量提高59%?？梢?，NtCycB2基因敲除植株中性香氣成分總量明顯高于對照。

表3 K326和HK326中性香氣成分含量Tab.3 Contents of neutral aroma components in K326 and HK326

3 結論

通過基因編輯技術獲得了NtCycB2基因敲除且不存在任何轉(zhuǎn)基因元件的K326定向改良材料HK326，該材料腺毛濃密，尤其是長柄分泌型腺毛密度顯著提高。田間試驗顯示，HK326植株發(fā)育良好且生長旺盛。成熟期煙葉葉面化學成分分析表明，HK326腺毛分泌物含量顯著提高，主要化合物西柏三烯二醇含量為對照的近3倍。在烤后煙葉中西柏烷類香氣成分茄酮含量明顯增加，其他中性香氣成分也有不同程度增加，其中，新植二烯含量增加幅度較大?？梢?，在煙草中敲除NtCycB2基因可以增加分泌型腺毛密度，有利于腺毛分泌物積累和中性香氣成分含量的提高，在煙草葉面化學改良中具有較大應用潛力。