王相杰 文今福 韓然然 金松南,

1.藥學(xué)院，山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271016； 2.心血管內(nèi)分泌研究所，山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，山東 泰安 271000

血漿中一定水平的甲狀腺激素(thyroid hormone, TH)對(duì)維持心血管正常功能至關(guān)重要，而甲亢(hyperthyroidism)時(shí)過量分泌的TH作用于心血管系統(tǒng)則可引起高血壓、心肌肥厚、心力衰竭、心律失常和血管病變等一系列病理特征表現(xiàn)。過量的L-四碘甲狀腺原氨酸(T4) 可損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞而能改變血管的形態(tài)和功能[1-2]。

牛磺酸(taurine，tau)是中藥牛黃的生物活性成分之一。近年來發(fā)現(xiàn)[3]牛磺酸在機(jī)體心血管系統(tǒng)中也存在，被認(rèn)為是一種內(nèi)源性物質(zhì)，參與心血管功能的調(diào)控。然而，?；撬釋?duì)TH致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用目前尚不清楚。本研究擬探討?；撬釋?duì)甲亢致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，以期為甲亢致血管損傷的防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑 L-四碘甲狀腺原氨酸(T4)，wortmannin，二甲基亞砜(Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清， 胰蛋白酶，青霉素，MTT,鏈霉素(Solarbio公司)； 一氧化氮試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.2藥物 ?；撬豳徺I于西安嘉天生物科技有限公司，純度為98%以上。

1.1.3人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)購買于上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.1.4儀器 倒置顯微鏡(中國COIC公司，XPS-1B型)，流式細(xì)胞儀(美國B-D公司，F(xiàn)ACSCalibur型)，CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司，MCO-15 AC型)，多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司，Infinite F 200型)。

1.2 方法

1.2.1HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)方法 培養(yǎng)HUVECs時(shí)，選用DMEM培養(yǎng)液，其中含10%的胎牛血清、青霉素100 mg/L和鏈霉素100 mg/L。HUVECs在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，挑選生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 細(xì)胞密度調(diào)整為3×104/mL，細(xì)胞懸液吹打均勻，用移液槍接種到96孔板，每孔加入100 μL(即3000個(gè)細(xì)胞)。種完細(xì)胞24 h后，等其完全貼壁，用移液槍，將上清液培養(yǎng)基吸掉。用完全培養(yǎng)基將藥物按梯度配制好，每孔加入含藥培養(yǎng)基150 μL，?；撬崽崆案深A(yù)2 h，T4孵育48 h，將上清液吸出，每孔加入0.5 mg/mL 的MTT溶液100 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h 后，吸出MTT溶液，然后每孔加入150 μL 的二甲基亞砜(DMSO)溶液，震蕩混勻，使其結(jié)晶完全溶解。用多功能酶標(biāo)儀選取490 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平檢測(cè) 細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個(gè)細(xì)胞/mL，用移液槍接種到6孔板，每孔加入1 mL的細(xì)胞懸液，再加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)基。?；撬崽崆案深A(yù)2 h，T4孵育48 h，將6孔板中的培養(yǎng)基吸凈，每孔再加入1 mL的PBS，輕輕搖晃，棄掉PBS緩沖液。每孔加入1 mL含血清培養(yǎng)基，反復(fù)輕柔地吹打細(xì)胞，使細(xì)胞全部懸浮，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入至流式管中。在室溫條件下，1000 r/min離心3 min，倒掉上清液，收集細(xì)胞，加入DCFH-DA(DCF)熒光探針，將流式管放到37℃細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20 min。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光強(qiáng)度的檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)液中一氧化氮(NO)水平檢測(cè) 采用硝酸還原酶法測(cè)定NO2-、NO3-水平，按NO試劑盒的說明書進(jìn)行操作，在550 nm處測(cè)定各管的吸光度值，根據(jù)測(cè)得的吸光度計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO水平。

2 結(jié) 果

2.1 ?；撬釋?duì)T4調(diào)節(jié)HUVECs細(xì)胞凋亡的影響

T4組為用T4(5 μM)處理HUVECs 48 h；?；撬?T4組為分別用不同濃度?；撬?2.5，5，10 mM)預(yù)處理HUVECs 2 h后，再用T4(5 μM)處理HUVECs 48 h，然后檢測(cè)HUVECs存活率。結(jié)果顯示，T4(5 μM)處理后出現(xiàn)HUVECs存活率的降低效應(yīng)(表1，P<0.01)，而?；撬?5，10 mM)處理后T4(5 μM)降低HUVECs存活率的效應(yīng)得以恢復(fù)，其細(xì)胞存活率趨向于正常水平(表1，P<0.05或P<0.01)。結(jié)果表明，牛磺酸能改善T4誘導(dǎo)的HUVECs存活率降低效應(yīng)。

2.2 牛磺酸對(duì)T4調(diào)節(jié)HUVECs活性氧水平的影響

T4組為用T4(5 μM)處理HUVECs 48 h；?；撬?T4組為分別用不同濃度?；撬?2.5，5，10 mM)預(yù)處理HUVECs 2 h后，再用T4(5 μM)處理HUVECs 48 h，然后檢測(cè)HUVECs ROS水平。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，T4(5 μM)明顯升高HUVECs ROS生成(表2，P<0.01)，而?；撬?5，10 mM)處理后T4(5 μM)升高HUVECs ROS水平的效應(yīng)得以恢復(fù)，其ROS水平趨向于正常水平(表2，P<0.01)。結(jié)果表明，T4能促進(jìn)HUVECs內(nèi)的ROS生成，而?；撬釀t抑制此效應(yīng)。

2.3 ?；撬釋?duì)T4調(diào)節(jié)HUVECs NO分泌的影響

T4組為用T4(5 μM)處理HUVECs 48 h；?；撬?T4組為分別用不同濃度?；撬?2.5，5，10 mM)預(yù)處理HUVECs 2 h后，再用T4(5 μM)處理HUVECs 48 h，然后檢測(cè)HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)中的NO水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，T4(5 μM)明顯降低HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)中的NO水平(表3，P<0.01)，而?；撬?5，10 mM)處理后T4(5 μM)降低HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)中NO水平的效應(yīng)得以恢復(fù)，其NO水平趨向于正常水平(表3，P<0.01)。用PI3K/Akt阻斷劑wortmanin處理HUVECs后，?；撬?5，10 mM)改善T4誘導(dǎo)的NO水平降低效應(yīng)則消失(表3，P<0.01)。結(jié)果表明，T4明顯減弱HUVECs的NO分泌，而?；撬嵬ㄟ^PI3K/Akt途徑則能改善此效應(yīng)。

表1 ?；撬釋?duì)T4調(diào)節(jié)HUVECs存活率的影響

注：與對(duì)照組相比，*P<0.01;與T4組相比，#P<0.05，##P<0.01。

表2 ?；撬釋?duì)T4調(diào)節(jié)HUVECs ROS生成的影響

注：與對(duì)照組相比，**P<0.01;與T4組相比，##P<0.01。

表3 牛磺酸對(duì)T4調(diào)節(jié)HUVECs NO分泌的影響

注：與對(duì)照組相比，**P<0.01;與T4組相比，##P<0.01;與?；撬?T4組比較，++P<0.01。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，?；撬崦黠@抑制TH致HUVECs存活率的下降和ROS水平升高，其機(jī)制與血管內(nèi)皮細(xì)胞PI3K/Akt-eNOS-NO信號(hào)通路有關(guān)。

甲亢與心血管疾病密切相關(guān)。甲亢伴隨著自主神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂導(dǎo)致心血管系統(tǒng)處于高動(dòng)力狀態(tài)，表現(xiàn)為心排出量和收縮壓明顯升高，同時(shí)引起顯著的血管形態(tài)和功能變化[1-2]。目前關(guān)于甲亢時(shí)心臟病變的研究報(bào)道較多，而有關(guān)甲亢時(shí)血管病變的防治研究報(bào)道較少。

?；撬崾且环N含硫的氨基酸，最早由牛黃中分離出來。?；撬徇^去被認(rèn)為是機(jī)體內(nèi)含硫氨基酸無功能的終末代謝產(chǎn)物，但近年來研究證明?；撬峋哂袕V泛的生物學(xué)功能，機(jī)體內(nèi)幾乎所有正常生理功能的維持和調(diào)節(jié)都需要?；撬岬膮⑴c，尤其在心血管系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[3-4]。?；撬嵩谘h(huán)系統(tǒng)中可抑制血小板凝集，降低血脂，防止動(dòng)脈硬化[4-6]；對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，可抗心律失常和抗心力衰竭[7-8]。

TH過量時(shí)可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[1-2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T4 處理HUVECs后細(xì)胞存活率明顯下降，與上述報(bào)道一致。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察到?；撬峥擅黠@減少T4致 HUVECs存活率下降的效果，提示?；撬釋?duì)T4致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)氧自由基增多和(或)清除能力降低導(dǎo)致活性氧簇在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷過程。在生理狀態(tài)下，ROS的作用主要表現(xiàn)在調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、增殖和激活方面，在病理狀態(tài)下ROS主要涉及到炎癥、內(nèi)皮功能障礙、細(xì)胞增殖和凋亡等方面。已證實(shí)多種心血管疾病與ROS有著密切關(guān)系[9-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T4明顯促進(jìn)HUVECs內(nèi)ROS生成，而牛磺酸則抑制此效應(yīng)。提示牛磺酸通過抑制ROS生成而發(fā)揮其對(duì)T4致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

在血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的活性物質(zhì)中，NO對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用[11-12]。生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化下產(chǎn)生適量的NO，通過細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)途徑調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的張力、舒張血管、調(diào)節(jié)血壓和血流分布。越來越多的基礎(chǔ)和臨床研究結(jié)果表明[13-15]，NO代謝紊亂與多種心血管疾病如高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T4顯著降低HUVECs細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO分泌，而?；撬釀t明顯改善其降低效應(yīng)；在PI3K/Akt阻斷劑wortmanin存在下，?；撬岣纳芓4致NO水平降低效應(yīng)則消失。提示?；撬釋?duì)T4致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用是通過PI3K/Akt-eNOS-NO信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。

總之，?；撬釋?duì)TH致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與PI3K/Akt-NO-cGMP信號(hào)通路有關(guān)。本研究將為?；撬釕?yīng)用于甲亢致血管病變的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。