鄭捷，方慶全，涂金花

（廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廈門 361003）

EBV encoded RNA（EBER）是Epstein-Barr virus（EBV，EB病毒）編碼的小RNA，該病毒不僅廣泛潛伏于健康人群，而且是一些非腫瘤疾病如傳染性單核細(xì)胞增多癥等的病因。更重要的是，EB病毒與越來越多的腫瘤性疾病密切相關(guān)[1，2]。EBER原位雜交法因其準(zhǔn)確的定位、極高的特異性和靈敏性已成為公認(rèn)的EB 病毒標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，并作為病理輔助診斷的重要依據(jù)之一在日常工作中應(yīng)用越來越廣泛。由于原位雜交檢測步驟多，容易受各種因素（如組織標(biāo)本的預(yù)處理、標(biāo)本類型、酶的消化程度、雜交后洗滌等）的影響。在臨床實際工作中對骨髓活檢組織行EBER原位雜交檢測時，常因組織脫片或者染色結(jié)果不穩(wěn)定需要進行重復(fù)實驗。為此，本研究通過實驗，從脫鈣方法、蛋白酶K消化時間、抗體孵育溫度三個影響因素進行優(yōu)化，摸索較佳的檢測條件。

材料與方法

1 標(biāo)本來源

收集廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科2014年5月—2018年5月間確診為EB病毒相關(guān)疾病且標(biāo)本類型為骨髓活檢組織的病例35例。其中NKT細(xì)胞淋巴瘤18例，EBV相關(guān)淋巴組織增殖性疾病17例。所有標(biāo)本均經(jīng)l0%中性福爾馬林固定不少于6h。

2 設(shè)備與試劑

設(shè)備：原位雜交儀為Thermo BriteTM公司S500-24 型；

試劑：原位雜交檢測試劑盒購自福建泰普公司。脫鈣液的配置：①10%硝酸脫鈣液：硝酸10ml加入90 ml蒸餾水；②強酸混合脫鈣液配制方法：10%中性福爾馬林500ml與95%乙醇500ml混合后，加入甲酸200ml，最后緩慢加入濃鹽酸150ml；③ 改良EDTA脫鈣液配制方法：250g乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）溶于1350ml磷酸鹽緩沖液（PBS），待完全溶解后加入40%甲醛150ml，最后加入適量氫氧化鈉（NaOH），將pH值調(diào)到7.0左右[3]。

3 方法

3.1 脫鈣方法及脫鈣終點的判定

將選取的35例標(biāo)本每例分為三段，分別放入三種不同的脫鈣液室溫下進行脫鈣：A組用10%硝酸脫鈣液脫鈣1～1.5h后取出流水沖洗30min；B組用強酸混合脫鈣液脫鈣2-3h后流水沖洗30min；C組用改良EDTA脫鈣液脫鈣20～24h后流水沖洗30min～1h。骨髓組織浮起，以尖鑷探測骨髓活檢組織變軟或大頭針能輕松刺入組織視為脫鈣完成[4]。

3.2 不同脫鈣液脫鈣后的骨髓活檢組織行EBER原位雜交檢測

①組織脫水與制片：將脫鈣完成后的A、B、C三組骨髓活檢標(biāo)本放入自動脫水機中脫水、透明、浸蠟，包埋。制片時將組織粘附于APES處理的防脫載玻片，厚度為3μm，60～70℃烤片1h，脫蠟。②蛋白酶K消化：甩干切片，將組織周圍液體用濾紙擦干，滴加蛋白酶K與PBS按1×25比例配制的酶工作液，室溫孵育5min，蒸餾水洗1×1min。③雜交:滴加20μl探針/切片，加蓋玻片，原位雜交儀55℃變性 60～90min，37℃雜交 4～16h。48℃ PBS 緩沖液浸泡，移去蓋玻片后PBS繼續(xù)浸泡洗滌3×5min。④信號放大和顯色: 每張切片分別滴加地高辛染色液試劑A, 37℃孵30min，37℃ PBS浸泡3×2min；試劑B室溫孵育30min，PBS浸泡3×2min；試劑C室溫30min，PBS浸泡3×2min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片。比較A、B、C三組的脫片率、切片質(zhì)量、雜交陽性信號的定位與強度、背景清晰度。

3.3 不同蛋白酶K消化時間的骨髓活檢組織行EBER原位雜交檢測

將C組用改良EDTA脫鈣液脫鈣的組織蠟塊進行連續(xù)切片3片，厚度3μm，隨機抽取組成D、E、F四組，分別進行5min、9min、13min間隔4min的梯度消化，其余操作步驟同C組，比較D、E、F三組的脫片率、雜交陽性信號的定位與強度、背景清晰度。

3.4 不同抗體孵育溫度下的骨髓活檢組織行EBER原位雜交檢測

將C組改良EDTA脫鈣液脫鈣的組織蠟塊進行連續(xù)切片2片，厚度3μm，蛋白酶K消化9min后，分兩組進行對比實驗。G組：滴加試劑A置于37℃水浴箱孵育30min，滴加試劑B室溫孵育20min，滴加試劑C室溫孵育 30min；F組：試劑A孵育30min、試劑B孵育20min、試劑C 孵育30min均在37℃水浴箱中進行，比較G、F兩組雜交陽性性號的定位與強度、背景清晰度。

4 EBER原位雜交的判讀與染色質(zhì)量評估標(biāo)準(zhǔn)

細(xì)胞核棕黃色為陽性著色，胞漿和胞膜著色不能視為陽性，只有見核分裂時可以出現(xiàn)胞漿陽性著色[5]。設(shè)定組織脫片率、切片質(zhì)量、雜交陽性信號的位置與強度、背景是否清晰有無黃染四項為評價指標(biāo)，評分標(biāo)準(zhǔn)為：①切片質(zhì)量（100分）：切片時組織相對較軟，基本能完整切片，不影響診斷，減1～10分；切片時感覺較硬，部分有沙粒感，切片不夠平整，不影響診斷，減11～30分；切片時刀片磨損嚴(yán)重，肉眼可見明顯刀痕，組織皺縮，無法制成完整切片，影響診斷，減31～100分。②雜交陽性信號的定位與強度（100分）：陽性信號定位準(zhǔn)確，著色較淡，低倍鏡下可分辨，不影響診斷，減1～10分；陽性信號定位較準(zhǔn)確，著色低倍鏡下不易觀察，需轉(zhuǎn)換至高倍鏡下仔細(xì)辨認(rèn)，不影響診斷，減11～30分；陽性信號定位不準(zhǔn)確，著色太弱，無法準(zhǔn)確判讀，減31～100分。③背景清晰度（100分）：陽性與陰性細(xì)胞對比鮮明，雜交背景輕微黃染，不影響診斷，減1～10分；陽性與陰性細(xì)胞對比度不佳，雜交背景出現(xiàn)不同程度黃染，但仍可作出診斷，減11～31分，雜交背景黃染嚴(yán)重，影響診斷，減31～100分。由2名經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)生閱片進行雙盲評分，每項指標(biāo)數(shù)據(jù)為評分的均值。

5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進行分析，計數(shù)資料采用率的比較，采用χ2檢驗，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，用配對t檢驗進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同脫鈣方式對骨髓活檢組織行原位雜交檢測的影響

A、B、C三組切片原位雜交染色質(zhì)量結(jié)果比較見表1。比較三組脫片率顯示，A組（42.9%）的脫片率明顯高于B（14.3%）、C（11.4%）兩組的脫片率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）。用三種脫鈣液脫鈣的骨髓活檢組織基本均能完整切片，A組切片時部分會有沙粒感，肉眼可見明顯刀痕，B、C兩組切片時組織相對較軟，更易切片。雜交陽性信號定位與強度得分C組均顯著高于A、B兩組，A組原位雜交染色陽性細(xì)胞定位較模糊，信號弱甚至不顯示，B組陽性細(xì)胞定位準(zhǔn)確，可是陽性信號的強度不如C組。三組背景染色均較清晰，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。比較A、B、C三組原位雜交染色質(zhì)量（圖1）可見用改良EDTA脫鈣液脫鈣的骨髓活檢標(biāo)本行原位雜交染色效果最好。

2 不同蛋白酶K消化時間對骨髓活檢組織行原位雜交檢測的影響

比較D、E、F三組脫片率，F(xiàn)組（42.9%）明顯高于D組（8.6%）和E組（14.3%）（P＜0.01）。D、E、F三組雜交陽性信號的定位與強度得分分別為67.5±2.5、82.5±1.2、81.5±1.0，D 組與 E、F 組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。D、E、F三組背景清晰度指標(biāo)得分為 84.7±1.2、85.3±1.0、62.1±2.4，F(xiàn)組蛋白酶K消化時間長，背景出現(xiàn)不同程度黃染，與D、E組相比差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。比較E、F三組原位雜交染色質(zhì)量（圖2）可見消化時間為9min組的切片，雜交效果最好，陽性細(xì)胞著色深，定位準(zhǔn)確，背景干凈，結(jié)果清晰易辨。

圖1 不同脫鈣方式對骨髓活檢組織行原位雜交檢測的影響。A，A組組織脫片嚴(yán)重，陽性細(xì)胞信號不顯示；B，B組組織輕微脫片，陽性信號定位準(zhǔn)確，信號較弱；C，C組組織無脫片情況，陽性信號定位準(zhǔn)確，陽性信號強；比例尺，50μm。Fig.1 Effect of different decalci fication methods on the in situ hybridization staining in bone marrow biopsy tissues. A, group A had severe tissue detachment from the slide and no positive cell signal was displayed; B, tissue in group B was slightly detached and the positive signal was accurately located but relatively weak; C, there was no detachment in the tissue sections of group C, and the positive signal was accurately located and strong; scale bar, 50μm

3 不同抗體孵育溫度對骨髓活檢組織行原位雜交檢測的影響

G、F組雜交陽性信號定位與強度得分分別為79.3±0.8、89.2±0.5，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），背景清晰度得分分別為89.2±0.5、82.2±0.5，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，試劑A孵育30min、試劑B孵育20min、試劑C 孵育30min均在37℃水浴箱中進行原位雜交檢查效果更佳。

表1 不同脫鈣方式下的骨髓活檢組織原位雜交染色質(zhì)量評分Tab.1 Quality score of in situ hybridization staining in bone marrow biopsy tissues under different decalci fication methods

圖2 不同蛋白酶K消化時間對骨髓活檢組織行原位雜交檢測的影響。A，E組陽性細(xì)胞著色深，背景清晰；B，F(xiàn)組背景出現(xiàn)不同程度黃染；比例尺，5μmFig. 2 Effect of different protease K digestion time on the in situ hybridization staining in bone marrow biopsy tissues. A, the positive cells in group E were deeply stained and accurately positioned with a clear background; B, the background of group F showed different degrees of yellow staining; scale bar, 25μm

討 論

EBER原位雜交檢測是在分子水平上用EBER特有序列設(shè)計的單鏈DNA探針與靶序列按堿基配對原則進行特異性結(jié)合,從而檢測出EB病毒。骨髓活檢組織結(jié)構(gòu)特殊，富含有大量的無機鈣鹽，骨組織在制片前必須脫鈣去除骨中的鈣質(zhì)，脫鈣的同時還要盡量減少骨組織結(jié)構(gòu)的損害及核酸分子的丟失，所以脫鈣方式至關(guān)重要，脫鈣液選擇不當(dāng)會對原位雜交的結(jié)果產(chǎn)生極大影響。10%硝酸脫鈣液是目前作為病理工作中常用的脫鈣液，脫鈣速度快能力強，但對細(xì)胞核和組織結(jié)構(gòu)影響較大，對組織細(xì)胞mRNA破壞較大。強酸混合脫鈣液的脫鈣能力不及硝酸，對于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞性以及組織細(xì)胞mRNA成分的影響小于硝酸脫鈣液，但酸類脫鈣液均有脫鈣程度不易控制的弱點，脫鈣不足難以制片，脫鈣過度易導(dǎo)致細(xì)胞溶解和組織破壞。EDTA是一種優(yōu)良的鈣螯合劑，性質(zhì)溫和，能有效的保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)。吳鴻雁等[6]通過對比硝酸、EDTA和新型進口脫鈣劑Rapidcal三種不同脫鈣液在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本的熒光原位雜交（FISH）檢測中的表現(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，硝酸脫鈣液處理后的標(biāo)本染色效果較差，EDTA脫鈣液處理的乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本表現(xiàn)出優(yōu)秀的標(biāo)本質(zhì)量。但EDTA脫鈣時間長（4～6周）極大限制了EDTA脫鈣劑的臨床應(yīng)用。因此本研究對EDTA脫鈣液進行改良，運用了EDTA-2Na并加入40%甲醛固定液，固定脫鈣同時進行，原位雜交染色質(zhì)量得到了明顯提高。

除了脫鈣方式，酶消化也是原位雜交檢測成功與否的關(guān)鍵。蛋白酶K消化組織的目的是去除靶核酸周圍的蛋白質(zhì)，增加組織的通透性，暴露靶基因，利于探針滲透，增強雜交信號強度[7,8]。蛋白酶K消化的關(guān)鍵則是對消化時間的把控。本研究通過對比實驗發(fā)現(xiàn)，延長蛋白酶K消化時間至9min的骨髓切片原位雜交染色效果最好。

溫度是影響抗原抗體結(jié)合的重要因素，原則上孵育時間應(yīng)根據(jù)溫度的高低進行調(diào)整，溫度低延長孵育時間，溫度高相應(yīng)縮短孵育時間，但在實際工作中，室溫難以調(diào)整無法標(biāo)準(zhǔn)化，因此本研究將孵育過程更改成在37℃水浴箱中進行，一定程度上提高了染色效果。

除了骨髓活檢標(biāo)本脫鈣方式、酶消化時間、滴加地高辛染液的溫度外，技術(shù)員還應(yīng)重視實驗操作過程中的細(xì)節(jié)，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。例如：①滴加蛋白酶K時應(yīng)甩干切片，否則蛋白酶被組織上殘留的水份稀釋，會影響消化的效果；②滴加雜交液后用封片劑進行封邊，不但可以防止雜交液揮發(fā)也可以節(jié)約雜交液的用量；③用免疫組化油筆圈出抗體滴加范圍，防止抗體溢到組織邊緣，造成“邊緣效應(yīng)”。

綜上所述，通過優(yōu)化骨髓活檢組織的脫鈣方式，蛋白酶K消化時間，抗體孵育溫度可顯著降低組織的脫片率，提高EBER原位雜交染色質(zhì)量，使結(jié)果穩(wěn)定性更好，有助于病理醫(yī)生更準(zhǔn)確地進行EBV相關(guān)疾病診斷和鑒別診斷。