王喆 ，周芹，李慧敏

（1.黑龍江大學化學化工與材料學院，哈爾濱150080；2.黑龍江大學農(nóng)作物研究院，哈爾濱150080；3.農(nóng)業(yè)部糖料產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，哈爾濱150080；4.農(nóng)業(yè)部甜菜品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心，哈爾濱150080）

0 引言

紅甜菜亦稱紅菾菜、食用甜菜等，與葉用甜菜屬同一變種，其根和葉可食用，根中含有豐富的天然紅黃色素、酚類和抗壞血酸等活性物質(zhì)，以及多種維生素、甜菜堿等多種藥理成分，具有抗菌、消炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等功效，被世界衛(wèi)生組織和美國防癌協(xié)會選為對人們?nèi)粘ｏ嬍匙罴训?3種蔬菜之一和30種有防癌作用的果蔬之一[1-3]。

但是近年來，隨著化學除草劑、殺菌劑、殺蟲劑等農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)上的廣泛應(yīng)用，新農(nóng)藥的研發(fā)使用以及一些禁用農(nóng)藥的改頭換面，植株中的農(nóng)藥殘留對甜菜造成極大危害。目前甜菜上登記注冊的農(nóng)藥23種，未注冊的在用及禁用農(nóng)藥十幾種。在甜菜上雖已進行了除草劑殘留的檢測研究[4-5]，但對這些農(nóng)藥的監(jiān)控以及在植株中的殘留檢測國內(nèi)尚未正式開展，尤其是食用甜菜[6-7]。日本、美國及歐盟都已制定出食用甜菜中農(nóng)藥殘留的最大檢出限量（MRL），在我國，雖然目前已經(jīng)制定出甜菜中49種農(nóng)藥殘留的MRL值，但是對這些農(nóng)藥的測定方法基本上是參考蔬菜及食品的標準，而部分農(nóng)藥還沒有成熟的檢測方法，因此，建立食用甜菜中快速、準確、靈敏的多殘留檢測方法迫在眉睫。

農(nóng)藥多殘留檢測最常用的方法主要有氣相色譜法（GC）[8]、液相色譜法（LC）[9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法（GC-MS）[10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法（LC-MS）[11-13]。由于色譜法是依據(jù)保留時間（Retention time）定性，對于保留時間相同或者相近的物質(zhì)無法定性。而且大部分色譜法只能對某一類農(nóng)藥殘留進行檢測，例如：GC-FPD（火焰光度檢測器）只能用于有機磷農(nóng)藥檢測，而GC-ECD（電子捕獲檢測器）只能用于有機氯農(nóng)藥檢測等。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用采用選擇離子監(jiān)測（SIM）或者多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式可以解決樣品成分的共流出問題。紅甜菜樣品基質(zhì)復雜，含有大量的色素、生物堿及其他的有機無機成分，而待測的目標化合物含量往往較低，因此，樣品的前處理是保證精確分析的前提，同時也保護儀器免受污染和損害[11]。目前，QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）法是普遍采用的前處理方法[11-15]，采用N-丙基乙二胺鍵合固相吸附劑（PSA）對樣品提取液進行分散固相萃取凈化，該方法具有快速、簡便、成本低廉的特點，迅速成為農(nóng)藥殘留前處理使用較為廣泛及歐洲標準委員會認可的實驗方法。近年來，研究者們又發(fā)展了此方法，尋找出很多前處理的吸附劑，諸如C18、石墨化炭黑（GCB）以及MgSO4等，這些吸附劑還可以組合使用，用于農(nóng)藥殘留檢測前處理的凈化過程。碳納米管（Carbon nanotubes，CNTs）是在1991年被發(fā)現(xiàn)的一種新型碳材料，其獨特的納米中空結(jié)構(gòu)，大的比表面積使其在生物化學、物理學、環(huán)境化學及其他領(lǐng)域具有較為廣泛的應(yīng)用[11-12]。與單壁碳納米管（Single walled carbon nanotubes，SWCNTs）相比，多壁碳納米管（Multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）吸附性能力更強，比GCB、PSA、C18具有更大的比表面積、更大的吸附容量。目前已應(yīng)用于水樣、農(nóng)藥殘留[12，16-18]、獸藥殘留的檢測，但是在甜菜農(nóng)藥殘留檢測尚未見報道。本文建立了基于吸附性能好、凈化效率高的多壁碳納米管作為吸附劑的方法，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測了紅甜菜中10種農(nóng)藥殘留，方法操作簡單、快速、準確、成本低[16]，能滿足紅甜菜中農(nóng)藥殘留分析的要求。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

正己烷、丙酮、乙腈、甲苯均為色譜純，購自迪馬公司；無水硫酸鎂和氯化鈉均為分析純，使用前于650℃下灼燒4 h，備用），購于天津市光復科技發(fā)展有限公司；MWCNTs（直徑大于50 nm；長度為9.089μm，純度為98%，比表面積為244 m2/g），由山東大島納米材料有限公司提供。農(nóng)藥標準品濃度均為1 000 mg/L，購于農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科學監(jiān)測所（天津）。GCB、PSA、C18購于安捷倫公司；Agilent公司氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890A-5975C）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE300；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器；HY-6調(diào)速多用振蕩器；德國Sigma公司離心機；勻漿機（LB20ES美國Waring公司）。

1.2 材料與方法

1.2.1 混合標準溶液的制備

首先將10種農(nóng)藥標準品用甲苯配制成，分別吸取10種農(nóng)藥標準品0.1 mL，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，用甲苯定容至刻度，即得到濃度為1 mg/L的混合標準儲備液。準確移取一定體積的標準儲備液，用甲苯定容，配制成混合農(nóng)藥的標準溶液，置于4℃冰箱中保存。

1.2.2 儀器條件

質(zhì)譜條件：HP-5 MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；電子轟擊離子源，電離電壓為70 eV，掃描方式：選擇離子監(jiān)測（SIM）模式，離子源溫度為230℃；四極桿溫度為150℃；傳輸線溫度：280℃。

色譜條件：進樣口溫度：250℃；柱箱溫度：60℃保持1 min，20℃/min升到160℃，2℃/min升到210℃，總運行時間31 min，溶劑延遲時間5 min；載氣為氦氣，流速1 mL/min。

1.2.3 樣品的提取

樣品來源于黑龍江省呼蘭果園村大田試驗地秋天成熟紅甜菜塊根。準確稱取切碎的紅甜菜樣品25 g，加入50 mL乙腈勻漿3 min，然后過濾到事先裝有5 g氯化鈉的具塞量筒中，劇烈震搖2 min，靜止30 min以上，吸取上清液10 mL，60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，2 mL正己烷-丙酮（2:1）定容，待凈化。

1.2.4 樣品的凈化

在15 mL離心管中加入10 mg MWCNTs、25 mg PSA、75 mg MgSO4作為吸附劑。吸取上述提取液1 mL，渦旋振蕩1 min，以6 000 r/min離心1 min，取上清液過0.22μm有機濾膜后供氣相色譜-質(zhì)譜測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

每種待測物分別選擇一個定量離子，2～3個定性離子，SIM模式掃描，10種農(nóng)藥在色譜圖中的保留時間、定量離子和定性離子如表1所示。按照出峰順序分時段分別檢測得到總離子流圖（圖1）。其中，毒死蜱、倍硫磷、對硫磷、三唑酮保留時間相差較小，而在本文中每種物質(zhì)選用不同的提取離子進行定量，保留時間對結(jié)果無影響，圖2為4種農(nóng)藥的提取離子流圖，利用峰面積法對結(jié)果進行定量。

表1 10種農(nóng)藥的保留時間、定量離子、定性離子Table1 Retention time,quantitative ions,qualitative ions of the10 pesticideresidues

圖1 10種農(nóng)藥混合標準溶液的氣相色譜-質(zhì)譜圖Fig.1 GC-MSchromatogram of the mixtureof the 10 pesticideresidues

圖2 毒死蜱（chlorpyrifos）、倍硫磷（fenthion）、對硫磷（parathion）、三唑酮（triazolone）提取離子流圖Fig.2 Extract ions chromatogram of chlorpyrifos，fenthion，parathion，triazolone

2.2 前處理條件的選擇

2.2.1 提取溶劑的選擇

在農(nóng)藥殘留分析中，常用的提取溶劑有丙酮、乙腈、甲醇、乙酸乙酯等，因為丙酮與水互溶，很難實現(xiàn)有機相和水相分離，作為單一溶劑提取時適合含色素較少的樣品，乙酸乙酯雖只是部分與水互溶，但一些極性農(nóng)藥卻不能從水相中分離。而乙腈提取的樣品基質(zhì)相較于丙酮和乙酸乙酯含有的干擾物質(zhì)較少，10種農(nóng)藥回收率在68%～120%之間，滿足農(nóng)藥殘留分析要求，并且通過鹽析和離心很容易從水相中分離，因此選擇乙腈做為提取溶劑。

2.2.2 凈化方法的確定

乙腈提取之后的溶液，會有色素、酚類、醌類等物質(zhì)混入提取液中，必須通過凈化除去，否則會干擾測定結(jié)果，影響儀器的靈敏度。選擇合適的凈化方法是至關(guān)重要的。本實驗選用分散固相萃取的方法，考察了吸附劑對農(nóng)藥殘留回收率的影響。

農(nóng)藥殘留常用的吸附劑有PSA、MgSO4、GCB、C18等，PSA含有兩個氨基，是弱陰離子交換吸附劑，對于樣品中有機酸、色素、維生素、糖類以及其他能形成氫鍵的成分等能有效去除，但其吸附色素的能力有限，因此需要與其他吸附劑組合使用；無水MgSO4用作除去提取液中可能存在的水分，也不能單獨使用；C18是反相吸附劑，可以去除脂類、花青素、蠟類等非極性的干擾物質(zhì)；GCB能吸附極性化合物或做陰離子交換劑，因此，它既可以吸附非極性和弱極性的化合物又可以吸附極性化合物，用來去除色素，對化合物表現(xiàn)出很廣的吸附譜；MWCNTs對多種有機化合物具有良好的吸附性，只需使用少量的吸附劑即可在較短的平衡時間內(nèi)實現(xiàn)萃取分離。所以實驗中固定PSA和MgSO4的用量，考察MWCNTs、GCB、C18三種不同吸附劑的凈化效果。

PSA和MgSO4的用量分別為25 mg和75 mg，在凈化管中分別加入3種吸附劑40 mg，MWCNTs組合凈化后的提取液顏色最淺，凈化效果最好，其次為GCB組合，C18的凈化效果最差，顏色最深。從加標回收率來看，MWCNTs、GCB相差較小，優(yōu)于C18的回收率（圖3）綜合凈化效果和加標回收率，最終選擇MWCNTs/PSA/MgSO4作為分散固相萃取吸附劑。

圖3 不同吸附劑對加標空白樣品提取回收率的影響Fig.3 Effect of the different sorbents on theextraction recoveries of pesticides spiked in red beet

2.2.3 MWCNTs用量的確定

比較不同用量的MWCNTs對紅甜菜提取液的凈化效果及回收率，實驗中固定PSA和MgSO4的用量，分別加入10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg MWCNTs于凈化管中，隨著MWCNTs用量的增加，溶液MWCNTs顏色逐漸變淺，回收率隨著升高，但加到40 mg以上到50 mg時，回收率開始下降，說明MWCNTs用量達到一定值，會對目標物質(zhì)產(chǎn)生吸附，所以綜合考慮，選擇MWCNTs的用量為40 mg（圖4）。

2.3 方法學考察

2.3.1 方法的靈敏度

分別配置濃度為0.01～0.5 mg/L的混合農(nóng)藥標準溶液，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線（表2），得線性方程及相關(guān)系數(shù)，10種農(nóng)藥在10μg/L～0.5 mg/L（甲拌磷為30μg/L～0.5 mg/L）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。

圖3 不同吸附劑對加標空白樣品的提取回收率的影響Fig.3 Effect of thedifferent sorbents on the extraction recoveriesof pesticidesspiked in the red beet

方法的靈敏度一般用檢出限表示，一般情況下，信噪比為10（S/N=10）時對應(yīng)的濃度定義為定量限（Limit of quantitation，LOQ），以3倍信噪比（S/N=3）定義為檢出限（Limit of detection，LOD），結(jié)果（表2）表明：LOD為1～9μg/kg，LOQ值為10～20μg/kg，表明此方法靈敏度較高。

表2 10種農(nóng)藥的回歸方程Table2 Theregression equation of the10 pesticideresidues

2.3.2 準確度與精密度實驗

農(nóng)藥殘留檢測中，一般用添加回收率來驗證方法的準確度，用相對標準偏差（RSD）來表示測試結(jié)果的精密度。本文在確定的實驗條件下，依據(jù)不同農(nóng)藥的檢出限，分別向紅甜菜樣品中加入農(nóng)藥標準品的混合溶液，按照1.2.3和1.2.4的方法，進行高、中、低（分別為10～30μg/kg，0.1 mg/kg，0.5 mg/kg）3個水平的加標回收率實驗，其中每個濃度做6次重復。實驗結(jié)果表明：在3個加標水平下，10種農(nóng)藥的平均回收率為73.8%～99.2%，RSD值為2.3%～8.2%，方法準確度與精密度滿足農(nóng)藥殘留分析要求（表3）。

表3 10種農(nóng)藥在紅甜菜中的加標回收率和相對標準偏差Fig.3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)for the10 pesticides spiked in red beet(n=6)

3 結(jié)論與討論

建立了以PSA、MgSO4、MWCNTs組合作為吸附劑分散固相萃取、GC-MS測定紅甜菜中多種農(nóng)藥殘留的測定方法。此前處理方法步驟簡單、快速、回收率及精密度均滿足要求，可降低檢測成本、縮短檢測周期。為紅甜菜中農(nóng)藥殘留檢測提供了有效的前處理方法及檢測手段。

目前，針對不同的基質(zhì)，農(nóng)藥殘留的前處理方法很多，具體包括索氏提取法，液液萃取法，固相萃取法、固相微萃取法等，其中最常用的是固相萃取法，國家標準GB 23200.8-2016及行業(yè)標準NY/T 761-2008中對于多殘留的前處理均采用了此方法，需要幾種固相萃取小柱組合使用，操作起來較為繁瑣，而且對操作者要求更高。本方法采用MWCNTs分散固相萃取的方法，利用MWCNTs的吸附特性，具有成本低、操作簡單的優(yōu)點。

10種農(nóng)藥中，包括有機磷農(nóng)藥8種，三唑類農(nóng)藥（三唑酮），氨基丙酸甲酯類（甲霜靈）農(nóng)藥。有機磷農(nóng)藥一般使用氣相色譜-火焰光度檢測器進行測定，但是需要保留時間定性，對于保留時間比較接近的農(nóng)藥定性困難，極容易出現(xiàn)假陽性，例如本文中的毒死蜱、倍硫磷等4種農(nóng)藥，而采用氣質(zhì)聯(lián)用完全可以避免這一難題。三唑酮一般用氣相色譜-電子捕獲檢測器進行測定，靈敏度較高，GB 23200.8-2016中包括甲霜靈的測定方法，但是前處理比較復雜。本文進行了不同種類農(nóng)藥的聯(lián)合測定，充分發(fā)揮了氣相色譜的高分離能力與質(zhì)譜優(yōu)秀的定量能力，對分析成分復雜的樣品具有無比的優(yōu)越性。同時，采用選擇離子監(jiān)測模式，有效地排除了基質(zhì)干擾，具有較高的準確度及靈敏度。