胡厚如 董兵 何江 余冰波 張小宇 夏文豪

心血管病死亡占我國居民疾病死亡構(gòu)成40%以上，是我國居民健康的頭號殺手。隨著我國人口老齡化進程加速，心血管病患病率及死亡率呈井噴式增長，防治心腦血管病刻不容緩。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是危害老齡人口健康的致死致殘重大慢病之一[1]。

引起冠狀動脈粥樣硬化的危險因素有高血脂、高血壓、高糖尿、年齡、遺傳因素及社會心理因素等，這些危險因素如何引起動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，目前存在多種有爭議的學說。但各種主要危險因素最終都損傷動脈內(nèi)膜，這一既定事實已得到普遍共識。因此，血管內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化觸發(fā)以及發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[2]，同時也是維護血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)功能的完整性，防范內(nèi)皮修復和內(nèi)皮損傷之間失衡的關(guān)鍵治療環(huán)節(jié)，促進動脈內(nèi)皮損傷修復，從始發(fā)環(huán)節(jié)上抑制疾病發(fā)生發(fā)展對于心血管疾病預防和治療有著重要意義。

作為來源于骨髓的可分化為內(nèi)皮細胞的前體干細胞，內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一種重要的機體自身存在的血管內(nèi)皮損傷修復機制，在血管內(nèi)皮細胞損傷修復中扮演重要角色[3-5]。在內(nèi)皮細胞受損的情況下，循環(huán)EPCs可增殖分化為內(nèi)皮細胞，維持內(nèi)皮系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的完整。然而，眾多研究顯示，冠心病、增齡、高血脂等多種心血管疾病危險因素會導致機體外周血中EPCs數(shù)量下降和活性受損[6-8]。因此，促進冠心病患者循環(huán)EPCs數(shù)量的增加，血管損傷修復功能的恢復，維持內(nèi)皮生理修復和病理損傷之間的平衡，對于心血管疾病的發(fā)生率死亡率的降低和預后的改善具有非凡意義。

隨著對心血管疾病研究的不斷深入，冠心病的治療不僅僅局限于藥物和手術(shù)。以運動為核心的心臟康復已成早期逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮損傷防治心血管疾病防治的一個新方向，有望成為藥物治療和飲食控制之外的第三大干預措施[9-10]。研究表明運動可通過多種機制發(fā)揮重要的干預作用，如通過降低血清TC、LDL水平；促使血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生NO等舒血管物質(zhì)；激活體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)抵消了氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響等方式[11-12]。然而運動是否也可通過促進冠心病患者循環(huán)EPCs數(shù)量的增加，促進維持內(nèi)皮生理修復和病理損傷之間的平衡，提高血管內(nèi)皮化功能改善動脈彈性仍有待進一步研究。因此，本課題擬從臨床角度出發(fā)，針對老年冠心病患者，研究合理的體育運動對患者循環(huán)EPCs促進內(nèi)皮損傷修復能力的影響以及其潛在可能初步機制。

資料與方法

一、臨床資料

選擇2015年11月至2017年8月于廣州中山大學第一附屬醫(yī)院住院且均經(jīng)冠狀動脈造影確診冠心病且處于穩(wěn)定期患者68例，隨機分為對照組：32例，平均年齡（67.5±5.8）歲和實驗組：36例，平均年齡（68.3±7.1）歲。冠心病診斷標準：指冠狀動脈造影至少有一支冠狀動脈血管可觀察到直徑狹窄≥50%。排除標準：近3個月有外科手術(shù)、創(chuàng)傷、急性感染史；血壓偏低（＜ 105/65 mmHg，1 mmHg = 0.133 kPa）或藥物控制不佳高血壓者（＞ 160/90 mmHg）；無規(guī)律運動習慣及其他任何有踏車運動禁忌癥患者；該研究方案經(jīng)中山大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過，研究對象入組前已簽署知情同意書。

二、方法

1.運動試驗：對照組給予常規(guī)治療包括口服阿司匹林100 mg，1 次/d；口服瑞舒伐他汀鈣片10 mg，1次/d，晚間服用；口服美托洛爾緩釋片47.5 mg，1次/d，對照組不作運動干預，用以排除藥物和時間對運動前后EPCs功能改變的影響；實驗組給予相同劑量的常規(guī)藥物，同時接受踏車運動，運動強度依據(jù)美國心臟協(xié)會所定制的訓練和測試標準執(zhí)行（受試者進行踏車運動30 min/d，每周3次，運動代謝當量為4.5，為期3個月）[15]。

2.EPCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：在運動前后分別收集受試者外周靜脈血20 ml，肝素抗凝，離心法分離出單個核細胞后加入EBM2培養(yǎng)基（含20%FBS），置培養(yǎng)箱孵育，4 d后棄未貼壁細胞，給予完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至第7天。培養(yǎng)的EPCs鑒定采用雙熒光染色法（DiI-ac-LDL/FITC-lectin）和流式免疫細胞法（檢測EPCs特有的抗原標記物CD34+/ CD133+/KDR+）[13]。

3.EPCs的體外遷移實驗：取第5代對數(shù)期細胞消化后，用含10 g/L牛血清白蛋白的培養(yǎng)基重懸細胞，將含有VEGF的培養(yǎng)液注入改良的Boyden小室的下室，將含有等量約2×105個懸液注入上室，培養(yǎng)24 h，用消毒棉簽刮去濾膜上面的未移動細胞，固定10 min后熒光顯微鏡下觀察，隨機選擇3 個視野取平均值[14]。

4.EPCs的體外黏附實驗：將培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞消化重懸接種到六孔板中，待在培養(yǎng)箱中形成內(nèi)皮細胞單層后，加入含適宜濃度的CM-DiI染料的EGM-2培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；和EPCs孵育10 min后于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS輕輕洗滌，用4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min，DAPI液染色10 min后顯微鏡下觀察，隨機取5個視野計算黏附細胞數(shù)量[13]。

5.裸鼠頸動脈內(nèi)膜損傷模型的構(gòu)建：（1）手術(shù)：取10周齡的裸鼠，5%Chloral hydrate腹腔注射麻醉，劑量0.7 ml/100 g，同時用肝素鈉皮下注射充分抗凝，游離右側(cè)頸動脈鞘鈍性撕開股動脈鞘，分別結(jié)扎頸外動脈遠心端，血管夾夾住頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈起始端。并且在其間剪開一小口，合適尺寸的導管導線從頸外動脈殘端插入到頸總動脈內(nèi)，旋轉(zhuǎn)來回推送3次后退出并逐層縫合頸部切口。（2）EPCs的移植：將上述分離培養(yǎng)的EPCs消化重懸為5×105/100 μl細胞懸液，頸部內(nèi)皮損傷手術(shù)后約3 h后裸鼠蘇醒，通過裸鼠尾靜脈注入。（3）伊文思藍染色：將細胞移植3 d后裸鼠以上述同樣的方法麻醉，經(jīng)尾靜脈注入100 μl的5%伊文思藍溶液進行血管染色[13-14]。然后暴露頸部正中切口分離右頸總動脈，顯微鏡下觀察伊文斯藍染色情況并拍照。

6.血流介導的血管舒張功能（ flow-mediated dilation，F(xiàn)MD）檢測：研究對象測試前禁食4 h，測試前10 h內(nèi)無吸煙飲酒。然后在一個安靜、溫度舒適（25 ～ 26℃）房間內(nèi)臥姿休息10 min后行FMD功能檢測。采用日本UNEXEF超聲血管內(nèi)皮分析儀分析：袖帶縛下1/3處，連接心電圖，于右側(cè)肘窩橫紋上方2 ～ 10 cm處探測動脈，取其縱切面，調(diào)節(jié)探查深度和增益至清晰顯示前后壁血管內(nèi)中膜。然后反應(yīng)性充血試驗：將袖帶氣壓緩慢增加至超過收縮血壓50 mmHg，5 min后引起反應(yīng)性充血，持續(xù)記錄二維灰度圖像和縱向波型。用提供的專業(yè)方法來估算FMD[13]。以上操作均由我科的專業(yè)技師完成。

7.脈搏波傳導速度（pulse wave velocity，PWV）檢測：使用日本PWV專業(yè)檢測儀VP-1000。測定肱-踝動脈 PWV 作為評估大動脈彈性的指標，取左右兩側(cè) baPWV 的高值進行統(tǒng)計分析。以上操作均由同一位經(jīng)過培訓的醫(yī)師完成。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS 17.0軟件進行分析。年齡體重基線資料等計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，運動前后比較采用配對t檢驗。相關(guān)性分析采用Pearson法。以P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、受試者基線資料比較

共納入68例我院冠狀動脈造影確診冠心病患者，按隨機序列分配，分為對照組和實驗組。兩組運動前后基線資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05，表1）。

二、 FMD檢測

與運動前相比，踏車運動3個月后實驗組冠心病受試者的FMD升高（運動前：5.9%±2.1%；運動后：8.1%±2.6%；P＜ 0.01），提示血管內(nèi)皮功能較運動前有所恢復。對照組無明顯改變。（圖1和表2）

表1 冠心病受試者基線資料（±s）

表1 冠心病受試者基線資料（±s）

注：對照組并無運動干預，此處運動前后只表示時間節(jié)點前后基線資料的測量情況

分組 例數(shù) 運動 年齡（歲）體質(zhì)量（kg）體質(zhì)量指數(shù)（kg/m2）收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）心率（次/min）對照組 32 運動前 67.5±5.8 71.8±7.2 24.7±2.5 126.4±6.8 62.8±6.4 70.7±5.5運動后 67.5±5.8 70.9±6.7 23.8±2.8 125.8±6.1 64.9±6.1 71.5±5.2實驗組 36 運動前 68.3±7.1 69.5±6.9 24.3±2.2 124.4±6.7 62.4±5.8 68.7±6.5運動后 68.3±7.1 70.2±7.3 23.6±2.5 125.3±5.8 63.2±5.3 68.4±6.1

表2 健康受試者和冠心病受試者運動前后內(nèi)皮功能和EPC功能檢測（±s）

表2 健康受試者和冠心病受試者運動前后內(nèi)皮功能和EPC功能檢測（±s）

注：t值和P值均為實驗組運動前后比較結(jié)果，對照組不作運動干預，前后均無明顯差異

分組 例數(shù) 運動 FMD（%）PWV（cm/s）EPCs遷移（細胞/高倍視野）EPCs黏附能力（細胞/高倍視野）EPCs體內(nèi)再內(nèi)皮化（%）對照組 32 運動前 6.1±1.9 1625±156.4 34.8±5.1 32.8±4.2 37.4±5.5運動后 6.0±2.0 1596±119.8 31.2±6.7 28.4±6.3 38.9±5.2實驗組 36 運動前 5.9±2.1 1618±160.2 30.6±5.4 30.5±4.8 55.2±9.1運動后 8.1±2.6 1456±125.0 52.5±8.9 48.2±7.6 36.1±4.9 t 值 3.253 2.781 3.767 4.311 5.315 P值 0.001 0.014 0.013 0.001 0.012

圖1 熒光顯微鏡觀察EPCs體外遷移實驗（DAPI染細胞核，×40）

三、PWV檢測

與運動前相比，踏車運動3個月后實驗組冠心病受試者的PWV明顯減低[運動前：（1618±160.2）cm/s；運動后：（1456±125）cm/s；P＜ 0.01]，對照組無明顯改變（表2）。

四、EPCs體外遷移實驗

與運動前比較，實驗組患者運動后EPCs體外的遷移能力提高，對照組EPCs遷移能力改變差異無統(tǒng)計學意義（圖1，表2）。

圖2 熒光顯微鏡觀察EPCs體外黏附實驗（DAPI染細胞核，×40）

五、EPCs體外黏附實驗

內(nèi)皮細胞黏附實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：實驗組冠心病受試者運動后熒光顯微鏡計數(shù)黏附在內(nèi)皮細胞單層的EPCs數(shù)量較自身運動前明顯增多（P＜ 0.01），對照組改變差異無統(tǒng)計學意義（圖2，表2）。

六、EPCs體內(nèi)再內(nèi)皮化實驗

研究結(jié)果顯示：與運動前比較，注射實驗組運動3個月后人EPCs的小鼠損傷血管再內(nèi)皮化面積增大（運動后：55.2%±9.1%；運動前：36.1% ±4.9%；P＜ 0.01），對照組無明顯改變（圖3，4，表2）。

七、FMD與EPCs修復損傷內(nèi)皮能力的相關(guān)性

將實驗組運動前后FMD差值（運動后-運動前）與EPCs尾靜脈注射裸鼠頸總動脈再內(nèi)皮化面積差值按SPSS軟件行Pearson相關(guān)分析。研究結(jié)果顯示，運動前后FMD差值與EPCs移植前后再內(nèi)皮化面積差值呈正相關(guān)（P＜ 0.01）。對照組差異無統(tǒng)計學意義（圖5）。

八、PWV與EPCs修復損傷內(nèi)皮能力的相關(guān)性

圖3 對照組與實驗組運動前后EPCs再內(nèi)皮化面積比較

將實驗組3個月的運動前后PWV差值與運動前后冠心病受試者EPCs尾靜脈注射移植裸鼠頸總動脈再內(nèi)皮化面積差值進行Pearson相關(guān)分析。研究結(jié)果顯示，運動前后PWV差值與EPCs移植前后再內(nèi)皮化面積差值呈正相關(guān)（P＜ 0.01）。對照組差異無統(tǒng)計學意義（圖6）。

圖4 裸鼠頸總動脈內(nèi)皮伊文思藍染色結(jié)果

圖5 運動前后FMD差值與EPCs移植注射后再內(nèi)皮化面積差值的相關(guān)性（n = 36）

圖6 運動前后PWV差值與EPCs移植注射后再內(nèi)皮化面積差值的相關(guān)性（n = 36）

討 論

冠心病是目前我國城鄉(xiāng)居民疾病死亡率最高的心血管疾病。運動康復作為獨立于藥物治療和介入治療之外的健康有效的治療方式，在早期預防冠心病和防治病情惡化上扮演著重要角色[9-10]。本團隊前期研究也顯示，急性運動有提高青年健康受試者外周血中EPCs的數(shù)量和體外的遷移能力，平板運動可改善老年人EPCs的內(nèi)皮損傷修復能力[13-14]。然而，體育運動是否能提高冠心病患者外周血中EPCs的功能活性，改善其內(nèi)皮功能和血管彈性尚未見任何報道。

本研究入選我院冠狀動脈造影確診的冠心病受試者進行為期3個月的踏車運動，探討運動對冠心病患者FMD、PWV及外周血中EPCs促進裸鼠頸動脈拉脫模型內(nèi)皮損傷修復能力的影響。結(jié)果顯示：相對于運動前和對照組相比，運動后的患者體內(nèi)EPCs體外遷移及黏附功能有顯著性提高。通過頸動脈內(nèi)膜損傷模型，觀察其歸巢的EPCs體內(nèi)損傷修復能力，結(jié)果顯示：與體外的遷移黏附功能提高一致，運動后冠心病受試者EPCs頸動脈內(nèi)皮損傷修復面積明顯大于運動干預前。并且本研究利用運動前后FMD和PWV改善的差值與EPCs在體再內(nèi)皮化面積的增加進行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示改善的內(nèi)皮功能和動脈彈性分別與提高的EPCs在體再內(nèi)皮化能力之間存在正相關(guān)關(guān)系，提示體育運動改善冠心病患者內(nèi)皮功能和動脈彈性的機制可能是與體內(nèi)增強的EPCs的功能有關(guān)。

總之，本次試驗主要探討了體育運動對于冠心病患者EPCs體外遷移黏附功能以及內(nèi)皮損傷修復能力的影響，同時分析了EPCs在體修復功能與內(nèi)皮功能FMD、動脈彈性PWV之間的關(guān)系。研究分析顯示，踏車運動可提高冠心病患者外周血EPCs內(nèi)皮損傷修復能力，提高血管內(nèi)皮功能和改善動脈硬度，且二者存在一定相關(guān)性。本研究結(jié)果為體育運動作為一種重要的生活方式防治冠心病等動脈粥樣硬化性心血管疾病提供新的理論基礎(chǔ)。然而本研究存在一些局限：冠心病患者樣本量不夠多；未對運動提高冠心病患者外周血EPCs內(nèi)皮損傷修復能力的分子學信號通路機制進行深入研究；針對這些問題，本團隊之后的實驗將繼續(xù)招募患者，提高樣本量；同時，從分子生物學信號傳導角度，深入探討運動提高EPCs功能改善受試者內(nèi)皮修復功能的相關(guān)機制，為臨床研究提供更充分的證據(jù)。