王堯 曹善茂

摘 要：巖扇貝為國(guó)內(nèi)引進(jìn)的新品種，為了彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)在鹽度對(duì)巖扇貝影響這方面研究的空白，利用從加拿大引進(jìn)的巖扇貝Crassadoma gigantea幼貝，經(jīng)過(guò)在不同鹽度梯度（高鹽36，正常30，低鹽24）及不同鹽度變化速率馴化后，取樣，選取幼貝內(nèi)臟團(tuán)，采用試劑盒檢測(cè)方式，檢測(cè)不同鹽度梯度下巖扇貝Na+/ K+-ATP 酶活性的表達(dá)。結(jié)果表明：在鹽度30下，Na+/K+-ATP酶活性維持在較高水平，而在高鹽36脅迫下，酶活力較鹽度30的低，且在鹽度驟變情況下尤為顯著;在低鹽24脅迫下，酶活性同樣較鹽度30下的酶活力低，且相對(duì)高鹽脅迫活性更低

關(guān)鍵詞：巖扇貝;鹽度;Na+/ K+-ATP酶

巖扇貝Crassadoma gigantea隸屬于軟體動(dòng)物門Mollusca、瓣鰓綱Lamellibranchia、珍珠貝目Pterioida、扇貝科Pectinidae。[1]廣泛分布于北美太平洋沿海，自阿拉斯加到加利福尼亞半島和墨西哥灣海岸等沿海地區(qū)，從潮間帶到深至100米的海底均有分布。巖扇貝個(gè)體較大，肉質(zhì)鮮美，養(yǎng)殖周期短，生長(zhǎng)較快，適應(yīng)的溫度范圍廣，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，適合我國(guó)北方引種養(yǎng)殖。[7]

國(guó)外已有對(duì)巖扇貝的風(fēng)味口感[2]、各種脂肪酸含量等營(yíng)養(yǎng)成分[2]、產(chǎn)品冷藏肉質(zhì)穩(wěn)定性[3]的報(bào)道，并為育苗做了關(guān)于巖扇貝繁殖周期與排精產(chǎn)卵機(jī)制[4]、育苗的餌料種類及配比[5]、幼苗的附著生理[6]等方面的研究，但國(guó)內(nèi)對(duì)巖扇貝的研究較少，僅有室內(nèi)人工育苗技術(shù)[7]、海上中間育成[7]、幼貝攝食規(guī)律與環(huán)境適應(yīng)能力[8]、閉殼肌高蛋白低脂肪的營(yíng)養(yǎng)特點(diǎn)[9]等基礎(chǔ)研究。

而鹽度是貝類養(yǎng)殖過(guò)程中的重要水環(huán)境因子，對(duì)貝類機(jī)體呼吸、生長(zhǎng)、抗氧化水平及免疫功能具顯著影響[10]，海水鹽度易受降雨、氣候、河流徑流等影響而發(fā)生變化甚至驟變，導(dǎo)致海水貝類抗氧化酶及免疫相關(guān)酶活性升降變化，貝類常因此而大量死亡，使養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)遭受經(jīng)濟(jì)損失。[11]Na+/ K+-ATP 酶存在于細(xì)胞膜，起著物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換及信息傳遞等重要作用，機(jī)體在遭受環(huán)境脅迫或疾病狀況下，此酶活性發(fā)生改變。[12-14]因此，研究鹽度變化與貝類的Na+/ K+-ATP酶活性變化關(guān)系對(duì)養(yǎng)殖生產(chǎn)具有重要意義。目前已發(fā)現(xiàn)鹽度變化對(duì)日本沼蝦[12]、大菱鲆[13]、紅耳龜[14]、仿刺參[15]等水產(chǎn)動(dòng)物的Na+/ K+-ATP酶活性產(chǎn)生顯著差異。

目前國(guó)內(nèi)外在鹽度對(duì)巖扇貝生理指標(biāo)影響方面已做了研究，而未有鹽度對(duì)巖扇貝生化指標(biāo)影響的報(bào)道。國(guó)內(nèi)一些研究表明巖扇貝鹽度適應(yīng)范圍大約在24～36。[16]實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究鹽度對(duì)巖扇貝Na+/ K+-ATP 酶活性的影響，以完善巖扇貝的生化指標(biāo)理論，為今后的人工育苗、養(yǎng)殖生產(chǎn)等實(shí)踐提供依據(jù)與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

大連海洋大學(xué)海養(yǎng)樓重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

1.1.2 扇貝來(lái)源

試驗(yàn)用的巖扇貝為引自加拿大的巖扇貝幼貝，選取活力良好、發(fā)育正常、規(guī)格相近、殼長(zhǎng)為2-3 cm的幼貝90枚。

1.1.3 水質(zhì)監(jiān)測(cè)

暫養(yǎng)期間幼貝養(yǎng)殖水體鹽度為30;在實(shí)驗(yàn)期間，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的幼貝養(yǎng)殖水體鹽度分別維持在三個(gè)梯度：高鹽36、正常鹽度30、低鹽24。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 幼貝暫養(yǎng)馴化

將12月份從加拿大引進(jìn)的巖扇貝幼貝在大連海洋大學(xué)海養(yǎng)樓重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室控溫循環(huán)水族箱中暫養(yǎng)7d，暫養(yǎng)期間鹽度為30，水溫14±0.3℃，持續(xù)充氣，每天投喂小新月菱形藻（Rhomboid alga）25×104 cells/mL，視水色及幼貝攝食情況增減投餌量，每天全量換水。并觀察幼貝的健康狀況以期各條件狀況趨于穩(wěn)定。

1.2.2 鹽度驟變實(shí)驗(yàn)

將暫養(yǎng)后各方面條件趨于穩(wěn)定的幼貝分別放在高鹽36、正常鹽度30、低鹽24中馴化天，鹽度設(shè)三個(gè)梯度，高鹽36、正常鹽度30、低鹽24分別為每個(gè)梯度三個(gè)平行，每個(gè)平行處理10個(gè)扇貝。低鹽組的海水從正常海水鹽度開(kāi)始每天降3，依次為30、27、24;正常海水對(duì)照組的海水維持正常海水鹽度30，其中上下波動(dòng)應(yīng)不超過(guò)1;高鹽組的海水從正常海水鹽度開(kāi)始每天升3，依次為30、33、36。在達(dá)到既定鹽度值24、30、36后設(shè)時(shí)間點(diǎn)0，4，8，12，24，36，48小時(shí)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別從各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中取樣一次。

1.2.3 鹽度漸變實(shí)驗(yàn)

低鹽組的海水從正常海水鹽度開(kāi)始每天降1，從30降低到24;正常海水對(duì)照組的海水維持正常海水鹽度30，其中上下波動(dòng)應(yīng)不超過(guò)1;高鹽組的海水從正常海水鹽度開(kāi)始每天升1，從30提升到36。在達(dá)到既定鹽度值36、30、24后，每3天分別從不同實(shí)驗(yàn)組取樣一次。

1.2.4 酶活性測(cè)定

從不同實(shí)驗(yàn)組中抽取的樣品，選取內(nèi)臟團(tuán)，根據(jù)計(jì)算要求設(shè)置空白對(duì)照管，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管，測(cè)定管，分別測(cè) Na+/ K+-ATP 酶活性，Na+/ K+-ATP酶活性的測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒。

Na+/ K+-ATP 酶活力測(cè)定原理為ATP酶可分解ATP生成ADP和無(wú)機(jī)磷，測(cè)出無(wú)機(jī)磷的含量后利用公式可判斷出ATP酶活力的高低。其活性單位定義為每小時(shí)1mg組織蛋白中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)ATP活力單位，即微摩爾磷/毫克蛋白/小時(shí)（μmolPi/mgprot/hour）。

最后要測(cè)樣本蛋白濃度用以上一公式的計(jì)算。蛋白定量原理為蛋白質(zhì)分子具有-NH4+ 基團(tuán)，棕紅色的考馬斯亮藍(lán)顯色劑加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品液時(shí)考馬斯亮藍(lán)顯色劑上的陰離子與蛋白的-NH4+結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{(lán)色，通過(guò)測(cè)定吸光度計(jì)算蛋白含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel輸入數(shù)據(jù)、生成圖表后進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度急性實(shí)驗(yàn)

鹽度驟變Na+/ K+-ATP 酶活力：隨著鹽度的驟變和馴化時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，各組樣本內(nèi)臟團(tuán)Na+/ K+-ATP酶活力變化見(jiàn)表1、表3，鹽度30的對(duì)照組樣本內(nèi)臟團(tuán)Na+/ K+-ATP酶活力變化見(jiàn)表2。

將各個(gè)鹽度梯度的8個(gè)樣本的Na+/ K+-ATP 酶活性數(shù)據(jù)作平均值，得到鹽度30-36、30-24驟變和鹽度30隨時(shí)間延長(zhǎng)的變化趨勢(shì)（見(jiàn)圖1）。由圖1可見(jiàn)，鹽度36組在4h-12h內(nèi)Na+/ K+-ATP 酶活力持續(xù)較低，24h-48h活力呈先上升后下降的變化趨勢(shì)。鹽度24組在48h內(nèi)出現(xiàn)兩次先上升后下降的趨勢(shì)，在12h、36h出現(xiàn)兩個(gè)峰值。鹽度30的對(duì)照組酶活力呈上升趨勢(shì)。48h內(nèi)鹽度36組與24組總體均較對(duì)照組活性較低，而24組總體較36組活性低。

2.2 鹽度漸變實(shí)驗(yàn)

鹽度漸變Na+/ K+-ATP酶活力：隨著鹽度的漸變和馴化時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，各組樣本內(nèi)臟團(tuán)Na+/ K+-ATP酶活力變化見(jiàn)表4、表6，鹽度30的對(duì)照組樣本內(nèi)臟團(tuán)Na+/ K+-ATP酶活力變化見(jiàn)表5。

將各個(gè)鹽度梯度的8個(gè)樣本數(shù)據(jù)作平均值，得到鹽度30-36、30-24漸變和鹽度30隨時(shí)間延長(zhǎng)的變化趨勢(shì)（見(jiàn)圖2）。由圖2可見(jiàn)，鹽度36組在第3d-第9d有小幅度的先降后升的趨勢(shì)，第9d后Na+/ K+-ATP 酶活力呈緩慢下降趨勢(shì)。鹽度24組酶活在第12d出現(xiàn)略微上升。鹽度30的對(duì)照組在18d酶活力呈略微波動(dòng)變化。18d內(nèi)鹽度36組與24組比對(duì)照組活性顯著較低，而24組比36組整體活性較低。

3 結(jié)論

Na+/ K+-ATP酶參與Na+、K+跨膜主動(dòng)運(yùn)輸，當(dāng)水體鹽度發(fā)生變化時(shí)，生物體內(nèi)的離子平衡容易受鹽度變化影響，生物體內(nèi)的Na+/K+-ATP酶活性出現(xiàn)相應(yīng)變化來(lái)對(duì)抗這種不平衡，用以維持離子穩(wěn)態(tài)及滲透壓平衡，Na+/ K+-ATP酶除能穩(wěn)定滲透壓平衡外，還為鰓、腎臟離子調(diào)控提供驅(qū)動(dòng)力。而高鹽或低鹽可破壞生物膜結(jié)構(gòu)，膜上Na+/K+-ATP酶活性也隨之降低。有研究報(bào)道，仿刺參在鹽度20-35范圍內(nèi)時(shí)，鹽度越高，Na+/K+-ATP酶活性則越高，當(dāng)鹽度高于35或低于20時(shí)，其Na+/K+-ATP酶活性降低。錢佳慧等研究表明，華貴櫛孔扇貝幼貝受鹽度影響Na+/K+-ATP酶活性變化顯著，且隨鹽度升高而呈先升后降的趨勢(shì)，并發(fā)現(xiàn)在30.67時(shí)活力最高。這種受鹽度脅迫Na+/K+-ATP酶活性隨鹽度變化而逐步升高或下降，達(dá)到最高和最低時(shí)逐漸適應(yīng)的現(xiàn)象在褐牙鲆（Paralichthys olivaceus）幼魚、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、擬穴青蟹（Scylla Paramamosain）、軍曹魚（Rachycentron canadum）水生動(dòng)物中均存在。這表明了Na+/K+-ATP酶在水生生物調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓時(shí)起重要作用，且在最適鹽度下，活力最大。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在鹽度30下，Na+/K+-ATP酶活性維持在較高水平，而36高鹽脅迫下，酶活力較適鹽范圍下的酶活力低，且在鹽度驟變情況下尤為顯著，與研究結(jié)論符合;24低鹽脅迫下巖扇貝幼貝的Na+/K+-ATP酶活性同樣較適鹽范圍下的酶活力低，其活性相對(duì)高鹽脅迫活性更低。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹽度對(duì)巖扇貝適應(yīng)生存環(huán)境具有顯著影響，且與低鹽脅迫相比下，巖扇貝對(duì)高鹽脅迫的適應(yīng)性相對(duì)較強(qiáng)。因此在巖扇貝引種馴化或人工養(yǎng)殖時(shí)應(yīng)充分考慮鹽度變化的影響，可以考慮培育耐高鹽品種。

參考文獻(xiàn)：

[1]王如才，王昭萍.海水貝類養(yǎng)殖學(xué)[M].青島：中國(guó)海洋大學(xué)出版社出版，2008.

[2]Phleger C F，Holtz RB，Grimes P W，et al.Chemical and sensoryanalysis of the purple-hinge rock scallo Hinnites multirugosus Gale[J].Journal of Food Science，1978，43（6）：1793-1796.

[3]Maxwell-Miller G，Josephson R V，Spindler A A，et al.Chilled（5℃）and frozen（-18 ℃）storage stability of the purple-hingerock scallop，Hinnites multirugosus Gale[J].Journal of Food Science，1982，47（5）：1654-1661.

[4]Laurén D J.Oogenesis and protandry in the purple-hinge rock scallop，Hinnites giganteus，in upper Puget Sound，Washington，U.S.A.[J].Canadian Journal of Zoology，1982，60（10）：2333-2336.

[5]Cary S C，Leighton D L，Phleger C F.Food and feeding strategies inculture of larval and early juvenile purplehinge rock scallops，Hinnites multirugosus（GALE）[J].Journal of the World Aquaculture Society，1981，12（1）：156-169.

[6]Culver C S，Richards J B，Page H M.Plasticity of attachment in the purple-hinge rock scallop，Crassadoma gigantea：implications forcommercial culture[J].Aquaculture，2006，254（1-4）：361-369.

[7]曹善茂，汪健，王謙，等.巖扇貝人工育苗的初步研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，32（1）：1-6.

[8]曹善茂，梁偉鋒，汪健，等.巖扇貝幼貝濾食率的基礎(chǔ)研究[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，31（6）：612-617.

[9]曹善茂，王昊，陳煒，等.巖扇貝閉殼肌營(yíng)養(yǎng)成分的分析及與中國(guó) 3 種扇貝的比較[J].大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，31（5）：544-550.

[10]肖克宇，陳昌福，李月紅，等.水產(chǎn)動(dòng)物免疫學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011：91-92.

[11]錢佳慧，栗志民，申玉春，等.溫度和鹽度對(duì)華貴櫛孔扇貝抗氧化酶活性的聯(lián)合效應(yīng)研究.南方水產(chǎn)科學(xué).[J].南方水產(chǎn)科學(xué)，2015.11（6）：49-50.

[12]Wang W，Wang A，Liu Y，et al.Effect of temperature on growth，Adenosinephosphates，ATP ase and cellular defense response of juvenile shrimp Macrobrachium nipponense[J].Aquaculture，2006，256（1）：624-630.

[13]Imsland A K，Gunnarsson S，F(xiàn)oss A，et al.Gill Na+，K+-ATPase activity，plasma chloride and osmolality in juvenile turbot（Scophthalmus maximus）reared at different temperatures and salinities.[J].Aquaculture，2003，218（1）：671-683.

[14]張珂，洪美玲，史海濤，等.鹽度脅迫對(duì)紅耳龜Na+/K+-ATP酶及消化酶活性的影響[J].水產(chǎn)科學(xué)，2014，33（8）：520-524.

[15]王茂林，李岑，楊敏，等.鹽度對(duì)仿刺參存活和Na+/K+-ATP酶活性的影響[J].漁業(yè)現(xiàn)代化，2014，41（1）：6-9.

[16]梁偉鋒.不同因子對(duì)巖扇貝攝食率、耗氧率和排氨率的影響[D].大連海洋大學(xué)，2016.