張榮躍　李文鳳　黃應(yīng)昆　王曉燕　單紅麗　李婕　倉(cāng)曉燕　羅志明　尹炯

摘要：研究旨在明確2018年在云南西盟蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)的甘蔗病害是否為植原體引起的甘蔗白葉病。使用植原體16S rRNA基因序列通用引物Pl/P7和R16F2n/R16R2對(duì)10份采自云南西盟蔗區(qū)的疑似甘蔗白葉病樣品進(jìn)行巢氏PCR檢測(cè)，并將巢氏PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序和序列分析。巢氏PCR結(jié)果表明：所有10份樣品均能擴(kuò)增得到1240 bp左右的片段。測(cè)序結(jié)果表明所有獲得的10條16S rRNA基因序列大小均為1247 bp，序列間的核苷酸一致性為100%。BLASTN分析表明，從病株擴(kuò)增到的所有核苷酸序列與先前云南臨滄甘蔗白葉病植原體分離物L(fēng)C7和LC9的16S rRNA基因序列（Genbank登陸號(hào)：KR020691和KR020692）的核苷酸序列一致性為100%。虛擬RFLP分析表明，西盟分離物的16S rRNA基因序列的酶切圖譜與16SrXI-B亞組植原體相同。本研究結(jié)果表明，云南西盟蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)的甘蔗病害為16SrXI-B亞組植原體引起的甘蔗白葉病。

關(guān)鍵詞：云南;西盟;檢疫性病害;植原體;甘蔗白葉病;16SrXI-B亞組

中圖分類(lèi)號(hào)：S435.661

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

論文編號(hào)：cjas18120017

0引言

甘蔗白葉?。⊿ugarcane White Leaf， SCWL）是由植原體引起的甘蔗毀滅性病害，該病于1954年首次在泰國(guó)發(fā)現(xiàn)[1]，現(xiàn)己廣泛發(fā)生于越南、緬甸、菲律賓、巴基斯坦、印度、斯里蘭卡等植蔗國(guó)家，給當(dāng)?shù)馗收岷椭铺钱a(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-8]。中國(guó)臺(tái)灣于1962年報(bào)道了該病的發(fā)生[9]，2013年Li等[10]首次在云南保山蔗區(qū)采集的甘蔗樣品上檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SCWL植原體。SCWL主要癥狀表現(xiàn)為葉片白化、分蘗增多和矮化[11]。SCWL植原體主要通過(guò)帶病蔗種進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，且傳播性極強(qiáng)，此外，在田間SCWL植原體還可通過(guò)葉蟬自然傳播[4，12-13]。先前的病原多樣性研究表明16SrXI-B亞組和16SrXI-D亞組植原體均可引起SCWL[14-15]。

目前，SCWL只在云南保山蔗區(qū)和臨滄蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)[5-17]。2018年6月，筆者在對(duì)云南西盟蔗區(qū)甘蔗病蟲(chóng)害進(jìn)行調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)疑似SCWL癥狀的植株。為明確病原，筆者采集了10份疑似SCWL病樣，采用植原體16S rRNA基因序列通用引物對(duì)Pl/P7和R16F2n/R16R2對(duì)疑似病株進(jìn)行了檢測(cè)鑒定。以期為科學(xué)有效防控SCWL提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1疑似SCWL樣品

2018年6月從云南西盟蔗區(qū)采集的10份疑似SCWL樣品，品種均為‘粵糖93-159。

1.2植物總DNA的提取

每個(gè)樣品取病葉0.2 g，采用北京全式金生物技術(shù)公司的Easy Pure plant Genomic DNA Kit植物DNA提取試劑盒提取葉片總DNA，具體方法步驟按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3巢式PCR檢測(cè)

使用植原體16S rRNA基因序列通用引物對(duì)Pl/P7[18]和Rl6F2n/Rl6R2[14]進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增。以Pl/P7為引物進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增，25 uL反應(yīng)體系為含有l(wèi)OxPCR Buffer 2.5 uL、引物Pl/P7（20 umol/L）各l uL、MgCl2 （25 mmol/L）2 uL、dNTPs （10 mmol/L） 2.0 uL、Taq酶（5 U/uL） 0.2 uL、ddH20 15.3 uL、DNA模板1.0 uL。PCR反應(yīng)條件為：940C預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s，55CC退火30 s，72℃延伸l min，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。取l uL第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（稀釋30倍）作為模板，R16F2n/R16R2為引物進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系與第一次PCR相同，擴(kuò)增程序?yàn)椋?40C預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸l min，35個(gè)循環(huán);最后72C延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序及序列分析

利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）回收目的片段，并將其與pEASY-T5（北京全式金生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，每個(gè)轉(zhuǎn)化挑選6個(gè)陽(yáng)性克隆送華大基因測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用BLASTN進(jìn)行對(duì)比。使用DNAMAN v6.0進(jìn)行序列一致性分析。

1.5 16S rRNA基因序列的虛擬RFLP分析

使用在線(xiàn)植原體分類(lèi)工具iPhyClassifier（http：//plantpathology. Ba. Ars. usda. gov/cgibin/ resource/iphyclassifier.cgi）對(duì)西盟SCWL植原體的16S rRNA基因序列進(jìn)行虛擬RFLP分析和相似性系數(shù)分析[19]。

2結(jié)果與分析

2.1巢式PCR檢測(cè)及序列分析

使用植原體16S rRNA基因序列通用引物對(duì)Pl/P7和R16F2n/R16R2的巢氏PCR擴(kuò)增結(jié)果表明10份疑似SCWL樣品和陽(yáng)性對(duì)照均檢測(cè)到約1.2 kb左右的條帶，與預(yù)期目標(biāo)片段大小一致（圖1）。將目標(biāo)片段回收、克隆和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，所有樣品擴(kuò)增出的特異性片段大小均為1247 bp，序列間的核苷酸一致性為100%。BLASTN分析結(jié)果表明，所有10條序列（Genbank登陸號(hào)：MK028610-MK028619）與先前云南臨滄SCWL植原體分離物L(fēng)C7和LC9的16S rRNA基因序列（Genbank登陸號(hào)：KR020691和KR020692）的核苷酸序列一致性為100%。

2.2 16S rRNA基因序列的虛擬RFLP分析

利用植原體分類(lèi)鑒定在線(xiàn)工具iPhyClassifier對(duì)本研究獲得的16S rRNA基因序列進(jìn)行虛擬RFLP分析，結(jié)果表明，本研究獲得的16S rRNA基因序列的虛擬RFLP酶切圖譜與16SrXI-B亞組植原體的虛擬RFLP酶切圖譜相同（圖2），圖譜的相似系數(shù)為1.00。

3結(jié)論與討論

本研究對(duì)云南西盟蔗區(qū)采集的10份疑似SCWL甘蔗樣品進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)及測(cè)序分析，BLASTN結(jié)果表明本研究擴(kuò)增獲得的序列為SCWL植原體16SrRNA基因序列，虛擬RFLP分析表明本研究獲得的SCWL植原體分離物為16SrXI-B亞組植原體，因此，本次云南西盟蔗區(qū)發(fā)現(xiàn)的甘蔗病害可以確診為16SrXI-B亞組植原體引起的SCWL。西盟蔗區(qū)也成為繼云南保山蔗區(qū)和臨滄蔗區(qū)外又一個(gè)發(fā)現(xiàn)SCWL的蔗區(qū)。本研究結(jié)果可為云南今后開(kāi)展SCWL的深入研究和科學(xué)有效防控奠定基礎(chǔ)和提供參考依據(jù)。

SCWL是一種及其危險(xiǎn)的甘蔗病害，可對(duì)甘蔗造成毀滅性災(zāi)害。Li等[20]2013年在云南保山蔗區(qū)首次發(fā)現(xiàn)SCWL后，SCWL在云南蔗區(qū)擴(kuò)展蔓延十分迅速，給云南蔗糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來(lái)了嚴(yán)重災(zāi)害威脅。如得不到有效防控，可能還會(huì)給廣西、廣東等蔗區(qū)帶來(lái)潛在的威脅。因此，對(duì)于SCWL必須給予高度的重視，并采取有效防控措施阻止其擴(kuò)展蔓延，確保云南甘蔗安全生產(chǎn)和蔗糖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。由于SCWL主要通過(guò)帶病蔗種進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，建議加強(qiáng)對(duì)甘蔗良繁基地?cái)U(kuò)繁種苗和引進(jìn)及外調(diào)甘蔗品種的SCWL的檢疫和監(jiān)測(cè)，嚴(yán)禁從發(fā)生SCWL的蔗區(qū)和田塊引種和留種，同時(shí)，要加強(qiáng)對(duì)SCWL發(fā)病區(qū)域的檢查，及時(shí)清除銷(xiāo)毀病株，從源頭上控制其擴(kuò)散蔓延。另外，下一步需要深入研究SCWL的傳播媒介及其傳毒機(jī)理，探明甘蔗品種對(duì)SCWL的抗性，為SCWL的有效防控提供理論指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)。

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