德 吉，巴 貴，吳玉江，索朗達(dá)，袁 超，次仁德吉*

（1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏拉薩 850009；

2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050）

微衛(wèi)星（Microsatellite）是廣泛分布于真核生物基因組中的簡單重復(fù)序列（Simple Sequence Repeat，SSR），一般由2～6個(gè)堿基組成核心單元，重復(fù)類型分為單一型、復(fù)合型和間斷型[2]。微衛(wèi)星DNA符合孟德爾遺傳模式，在真核生物基因組中廣泛分布且數(shù)量龐大，具有分布均勻、多態(tài)性豐富、易于檢測等特點(diǎn)[3]，作為優(yōu)良遺傳標(biāo)記而廣泛用于農(nóng)作物和畜禽遺傳育種領(lǐng)域[4-5]。張建軍等對(duì)隴東絨山羊9個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)性進(jìn)行分析表明所選的微衛(wèi)星標(biāo)記顯示為高度多態(tài)，可用于遺傳多樣性評(píng)估[6]。張延虎等利用BM6438、BMS2782、BM1824等7個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在南疆絨山羊群體中進(jìn)行多態(tài)性分析，表明所選的微衛(wèi)星標(biāo)記均為高度多態(tài)，可以成為與經(jīng)濟(jì)相關(guān)的遺傳標(biāo)記[7]。古麗尼沙·吐拉甫等研究了9個(gè)微衛(wèi)星在青格里絨山羊中的多態(tài)性，并與部分生產(chǎn)性能進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)OarHH35、BM3033、BM1824、BMS1788可以作為青格里絨山羊細(xì)度或產(chǎn)絨量的分子標(biāo)記[8]。

西藏絨山羊是我國絨肉兼用型地方品種，是我國的一大寶貴家畜品種資源，主要分布在西藏阿里地區(qū)日土縣、那曲地區(qū)尼瑪縣等羌塘草原地區(qū)[1]，具有耐粗放、抗逆性強(qiáng)、羊絨細(xì)長柔軟、產(chǎn)絨性能良好、品質(zhì)優(yōu)良、絨纖維細(xì)度在14μm左右等特點(diǎn)。目前，國內(nèi)外對(duì)綿、山羊的微衛(wèi)星標(biāo)記研究報(bào)道較多，但對(duì)西藏絨山羊的研究還未見報(bào)道。本研究利用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)西藏絨山羊10個(gè)微衛(wèi)星進(jìn)行多態(tài)性分析，對(duì)其多態(tài)性與其產(chǎn)絨量、細(xì)度、長度等產(chǎn)絨性狀的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行系統(tǒng)分析，為西藏絨山羊標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

頸靜脈采集5 mL/只共計(jì)340份西藏自治區(qū)絨山羊保種場（阿里地區(qū)日土縣、措勤縣和尼瑪縣）成年絨山羊血液，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，-20℃保存。

體重、體長、絨長、產(chǎn)絨量等生產(chǎn)記錄由各保種場提供。

1.2 主要儀器和試劑

PCR儀（ProFlexTMPCR）、離心機(jī)（Eppendorf 5424）、電泳槽（Mini-Protean Tetra Electrophoresis System）等。以上儀器及設(shè)備由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所動(dòng)物育種實(shí)驗(yàn)室提供。

血液基因組DNA提取試劑盒（DP318-03）（購自天根生化科技＜北京＞有限公司）、Taq DNA聚合酶（購自大連寶生物工程有限公司）、其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品（購自蘭州博樂知生物科技有限公司）。

1.3 血液基因組DNA提取

血液樣品基因組DNA的提取參照天根血液基因組DNA提取試劑盒說明書。提取的基因組DNA通過核酸蛋白分析儀測定其濃度，于-20℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)微衛(wèi)星選擇標(biāo)準(zhǔn)，并參考前人研究結(jié)果，在Genbank中查找綿、山羊的微衛(wèi)星標(biāo)記，篩選出10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記引物序列，見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used formicrosatellite amplification

1.5 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為：Premix Taq 12.5μl，上下游引物各 1 μl（10 μmol/L），DNA 1 μl（20 ng/μl），ddH2O 9.5 μl，共計(jì) 25 μl。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；35個(gè)循環(huán)（94℃ 30 S，退火溫度 30 S，72℃ 1 min）；72℃延伸10 min，4 ℃保存。

各PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 PCR-SSCP分析

取5μl的PCR產(chǎn)物在8%的非變性聚丙烯凝膠100 V電壓條件下，4℃電泳4 h，銀染法顯色后拍照。

根據(jù)最終的成像膠圖分析各微衛(wèi)星全部個(gè)體的基因型。

1.7 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用 EXCEL軟件計(jì)算基因型頻率，并采用SPSS 20.0軟件對(duì)西藏絨山羊不同個(gè)體基因型數(shù)據(jù)與部分經(jīng)濟(jì)性狀數(shù)據(jù)（包括體長、體高、絨長、毛長等）相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

采用試劑盒法提取340份西藏絨山羊血液基因組DNA，提取的基因組DNA用1%瓊脂糖膠進(jìn)行完整性檢測（圖1），由圖可見，條帶清晰，均無拖帶，符合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求，用作后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 PCR擴(kuò)增

以西藏絨山羊血液基因組DNA為模板，用10對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1。由圖1可知，PCR產(chǎn)物中均有清晰的DN A擴(kuò)增條帶大小為100～250 bp之間，擴(kuò)增條帶單一。

圖1 部分基因組DNA瓊脂糖電泳Fig.1 Part of genomic DNA agarose electrophoresis results

圖2 微衛(wèi)星BM S1248擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Agarose electrophoresis results of PCR product ofmicrosatellite BMS1248

2.3 PCR-SSCP分析

對(duì)340份西藏絨山羊的10對(duì)微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合銀染法判斷等位基因的大小，部分結(jié)果見圖3～4。10對(duì)微衛(wèi)星引物除BM6438無多態(tài)性，其它都表現(xiàn)明顯的多態(tài)性。通過帶型進(jìn)行基因分型，并統(tǒng)計(jì)基因型頻率，結(jié)果見表2，9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)基因型在5個(gè)以上，其中BMS1788位點(diǎn)有9個(gè)基因型。

2.4 9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性與生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)分析

利用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)每個(gè)基因型與經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，其中基因型頻率10%以下的不做分析，并采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，主要對(duì)體長、體高、胸圍、羊絨長度、羊毛長度5項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行分析。由表3可見，在體長性狀中，位點(diǎn)BM3033的基因型6顯著高于其他基因型個(gè)體（P＜0.05），其他位點(diǎn)基因型間差異不顯著（P＞0.05）；在體高性狀中，位點(diǎn)BMS1248的基因型1和位點(diǎn)BM3033的基因型6顯著高于其他基因型，其他位點(diǎn)基因型間差異不顯著（P＞0.05）；在胸圍性狀中，位點(diǎn)BMS1248的基因型2和位點(diǎn)BM3033的基因型6顯著高于其他基因型個(gè)體（P＜0.05），其他位點(diǎn)基因型間差異不顯著（P＞0.05）；在絨長性狀中，位點(diǎn)BMS1788的基因型3顯著高于其他基因型個(gè)體（P＜0.05），其他位點(diǎn)基因型間差異不顯著（P＞0.05）；在毛長性狀中，位點(diǎn)BM3413的基因型1和基因型2顯著高于其他基因型個(gè)體（P＜0.05），其他位點(diǎn)基因型間差異不顯著（P＞0.05）；位點(diǎn)BMS1724、MCM38、BM6506、LSCV15、BMS2782 各基因型在體長、體高、胸圍、絨長、毛長性狀中差異不顯著（P＞0.05）。

圖3 微衛(wèi)星BMS1248的部分PCR產(chǎn)物8%PAGE電泳檢測Fig.3 Portion of 8%PAGE results of BMS1248

圖4 微衛(wèi)星BM 3033的部分PCR產(chǎn)物8%PAGE電泳檢測Fig.4 Portion of8%PAGE results of BM3033

表2 9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型特性Table 2 Genotypic characteristics of9 microsatellite loci

3 討 論

目前采用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行畜禽選種育種輔助選擇是速度最快、頻率最高和可靠性最好的方法，可以在最短的時(shí)間內(nèi)對(duì)群體中不期望出現(xiàn)的基因變異個(gè)體進(jìn)行淘汰[9]。一般是先檢測微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性并進(jìn)行基因型判定，然后利用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)個(gè)體表型值和基因型的關(guān)聯(lián)程度進(jìn)行分析，最終找到和重要性狀連鎖的DNA標(biāo)記。

古麗尼沙·吐拉甫選取17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在新疆山羊與青格里絨山羊進(jìn)行多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)其中13個(gè)具有多態(tài)性且均為高度多態(tài)，與兩個(gè)絨山羊群體經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)MCM38的FH型、MCM38的FI型、MAF70的BF型和BMS1724的CC型可作為新疆山羊絨細(xì)度、絨長度、產(chǎn)絨量和含絨率的候選標(biāo)記的優(yōu)勢基因型，LSCV15的BD型、BM3413

的CE型、BMS1788的DF型、BMS1248的BE型可望作為青格里絨山羊絨細(xì)度、絨長度、產(chǎn)絨量、含絨率的候選標(biāo)記的優(yōu)勢基因型[10]。本研究選取了10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在西藏絨山羊進(jìn)行多態(tài)性分析，其中BMS6438位點(diǎn)在西藏絨山羊中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性，與古麗尼沙·吐拉甫在新疆山羊與青格里絨山羊的多態(tài)性分析結(jié)果相同，說明BMS6438微衛(wèi)星位點(diǎn)在這3個(gè)品種中不存在多態(tài)性，在其他品種是否存在，有待進(jìn)一步研究。具有多態(tài)性的9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型與西藏絨山羊部分經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，BM3033的基因型 6、BMS1248的基因型 1和BM3033的基因型 6、BMS1248的基因型 2和BM3033的基因型6、BMS1788的基因型3、BM3413的基因型1和基因型2可分別作為西藏絨山羊體長、體高、胸圍、絨長、毛長的候選標(biāo)記優(yōu)勢基因型。這與古麗尼沙·吐拉甫在新疆山羊的研究結(jié)果存在相似性，也有不同之處，導(dǎo)致出現(xiàn)不同結(jié)果的原因可能是采樣本身、生產(chǎn)數(shù)據(jù)的測量、儀器設(shè)備等方面的原因，但從動(dòng)物起源進(jìn)化和分類角度分析，出現(xiàn)不同結(jié)果的主要原因是不同品種之間與生態(tài)環(huán)境因素的差異。

表3 微衛(wèi)星位點(diǎn)的不同基因型與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)分析Table 3 Correlation analysis between different genotypes and economic traits ofmicrosatellite loci

本試驗(yàn)中選取了部分經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行與微衛(wèi)星基因型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，初步得到的西藏絨山羊經(jīng)濟(jì)形狀候選標(biāo)記的優(yōu)勢基因型，為西藏絨山羊分子標(biāo)記輔助選擇提供參考依據(jù)。