張曉暉,關海濱,冬 穎,張愛武,*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥劑部,內(nèi)蒙古呼和浩特 010059;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010110)

高尿酸血癥是由于嘌呤代謝紊亂或尿酸排泄障礙所導致的血中尿酸超標,尿酸鹽晶體在關節(jié)、軟骨等部位析出,嚴重者可導致痛風。目前我國約有高尿酸血癥者1.2億,發(fā)病率逐年升高且呈年輕化趨勢,近年來,高尿酸血癥的患病率呈逐年上升趨勢,全球高尿酸血癥的患病率高達5%～25%[1]。高尿酸血癥由尿酸生成過多或尿酸代謝障礙引起,而尿酸生成過多僅占高尿酸血癥病因的10%,尿酸代謝障礙占患病者病因的90%[2-3]?？梢娔蛩岽x障礙是高尿酸血癥的主要病因,因此開發(fā)能夠降解尿酸的藥物成為治療高尿酸血癥的研究方向。

益生菌在維持腸道菌群的平衡、抵御外來微生物的侵害、調節(jié)腸道免疫系統(tǒng)方面具有重要的作用。目前益生菌已廣泛應用于藥品、保健品、食品等領域,治療腸道菌群失調引起的急慢性腹瀉、便秘等療效顯著[4-6]。而近年來隨著對益生菌認識的深入,人們開始關注益生菌的其它功能,如降低血脂、血糖、提高免疫力、抗腫瘤、預防齲齒等功效,而降低血尿酸也是近年來發(fā)現(xiàn)的又一作用[7-8]。尿酸攝入過多是高尿酸血癥的一大病因,尿酸氧化酶可將尿酸分解代謝,但人體不能產(chǎn)生尿酸氧化酶,因此尿酸主要從尿液和腸道排出[9]。目前用于治療高尿酸血癥的藥物有別嘌醇、苯溴馬隆、丙磺舒等,主要通過減少尿酸的合成及重吸收或促進尿酸排泄來發(fā)揮作用,但需長期使用藥物,且藥物副作用較大[10]。肌酐主要通過腸道內(nèi)細菌產(chǎn)生的肌酐水解酶降解,當人體腸道肌酐濃度較高時可誘導大量細菌產(chǎn)生肌酐水解酶,如大腸桿菌、變形桿菌、腸球菌等均可產(chǎn)生肌酐水解酶,隨著腸道內(nèi)肌酐濃度的增高,這些細菌過度增生,從而導致腸道菌群紊亂,破壞微生態(tài)平衡[11]。近年來隨著生物技術的發(fā)展,不少專家提出使用益生菌制劑分解腸道內(nèi)的肌酐和尿酸,楊殿斌等[12]通過篩選發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌DM9218能夠降低大鼠血尿酸、尿素氮和肌酐的含量。劉芳[13]通過基因工程的手段將尿酸氧化酶和肌酐水解酶基因導入保加利亞乳桿菌中,使該菌獲得了降解肌酐和尿酸的能力,可見通過定向篩選或基因工程的手段獲得降解肌酐和尿酸的益生菌是可行的。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是乳酸桿菌的一員,也是人體重要的益生菌。研究表明,植物乳桿菌對多種病原菌具有抗菌作用,并且其細胞壁中的肽聚糖能夠調節(jié)機體免疫功能、改善機體免疫力,其發(fā)酵乳還能降低小鼠膽固醇[14-16],然而植物乳桿菌的降血清肌酐、尿酸的功能卻未見報道。課題組前期通過實驗篩選得到一株可降解肌酐和尿酸的植物乳桿菌ZXH-1304S,本實驗研究了該菌株體外降解肌酐和尿酸的能力,并考察了該菌對大鼠血肌酐、尿酸的降解作用,為植物乳桿菌用于高尿酸血癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌ZXH-1304S 本實驗室分離保存;MRS培養(yǎng)基、MRS誘導培養(yǎng)基(含1 mmol的肌酐和0.8 mmol尿酸) 北京陸橋技術股份有限公司;肌酐、尿酸、氧嗪酸鉀、腺嘌呤、胃蛋白酶(1200～2400 U/mg)、胰蛋白酶(1000 U/mg) Sigma公司;NaCl、KH2PO3、HCl、NaOH、膽鹽 國藥集團化學試劑有限公司;Wistar雄性大鼠(7周齡,體重(200±10) g) 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院。

SHAZ-200B恒溫搖床 上海精密儀器儀表公司;Forma厭氧培養(yǎng)箱、Sorvall ST40低溫離心機 美國Thermo;BX53顯微鏡 日本OLYMPUS;ADVIA2400全自動生化分析儀 德國SIEMENS。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物乳桿菌ZXH-1304S在MRS和MRS誘導培養(yǎng)基中的生長曲線實驗 取保存的植物乳桿菌ZXH-1304S凍干菌種,接種于MRS液體培養(yǎng)基,38 ℃厭氧培養(yǎng)12 h,5%接種量(v/v)接種活化,連續(xù)活化四代。10%接種量(v/v)分別接種于MRS和MRS誘導培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)12 h,對數(shù)生長期間隔1 h制作生長曲線。發(fā)酵液鏡檢觀察顯微形態(tài)。

1.2.2 植物乳桿菌ZXH-1304S體外降解肌酐、尿酸實驗 培養(yǎng)12 h的發(fā)酵液8000 r/min離心20 min收集菌體,PBS重懸洗滌菌體,重復3次。在含1 mmol/L肌酐和0.8 mmol/L尿酸的人工腸液中加入終濃度為1×108CFU/mL的誘導植物乳桿菌ZXH-1304S,以不加菌體為空白對照,以未誘導的菌體為對比,37 ℃、100 r/min搖床反應2 h,8000 r/min離心20 min,取上清液。全自動生化分析儀檢測肌酐和尿酸的含量。

1.2.3 誘導菌株耐酸和耐膽鹽實驗 人工胃液的配制,NaCl 0.2%、胃蛋白酶0.32%,用0.2 mol/L HCl調節(jié)pH為1.5后,0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌;人工腸液的配制,KH2PO30.68%、胰蛋白酶1%,用0.2 mol/L NaOH調節(jié)pH為6.8后,0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌。取誘導活化的植物乳桿菌ZXH-1304S發(fā)酵液,按10%的接種量分別接種于pH1.5的人工胃液和含0.2%膽鹽的人工腸液中,在0、2、4、6、8 h取樣測定發(fā)酵液活菌數(shù),并計算相對存活率。

相對存活率(%)=某時間點的發(fā)酵液活菌數(shù)×100/0 h時的發(fā)酵液活菌數(shù)

1.2.4 誘導菌株降解肌酐、尿酸動物實驗 因雌性大鼠血尿酸值個體差異較大,因此本實驗選用雄性大鼠為實驗對象。實驗分組:對照組(n=8)、模型組(n=8)、嗜植物桿菌低劑量治療組(n=8)、嗜植物桿菌高劑量治療組(n=8)、別嘌醇治療組(n=8)。Wistar雄性大鼠40只適應性喂養(yǎng)2周,模型組每天給予300 mg/kg的氧嗪酸鉀和100 mg/kg腺嘌呤灌胃,對照組給予同等體積的生理鹽水灌胃,連續(xù)7 d。發(fā)酵液離心收集菌體,生理鹽水重懸菌體得到菌懸液,治療組在造模后每日給予植物乳桿菌菌懸液灌胃1 mL,低劑量組菌液濃度為1×107CFU/mL,高劑量組菌液濃度為1×109CFU/mL,對照組和模型組給予同等體積的生理鹽水灌胃,連續(xù)7 d。別嘌醇治療組給予每只大鼠60 mg/kg的別嘌醇灌胃,連續(xù)7 d。大鼠尾靜脈取血,全自動生化分析儀檢測血中肌酐和尿酸的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗設3個重復,實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0處理,數(shù)據(jù)采用平均值±標準誤差表示,組間比較采用t檢驗,p<0.05表示差異顯著，p<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌ZXH-1304S在MRS和MRS誘導培養(yǎng)基中的生長情況

采用平板混菌計數(shù)法[17]檢測發(fā)酵液活菌數(shù),菌體生長曲線如圖1。

圖1 植物乳桿菌ZXH-1304S的生長曲線和顯微形態(tài)(1000×,標尺:10 μm)

如圖1A所示,植物乳桿菌ZXH-1304S在MRS和誘導MRS中可穩(wěn)定生長,0～2 h是菌體的適應期,2～8 h是菌體的對數(shù)生長期,8～10 h是菌體的穩(wěn)定生長期,10 h之后菌體進入衰退期。在對數(shù)生長期時,菌體在MRS中的生長速率較誘導MRS中略快。在誘導MRS中菌體生長狀況良好,說明該菌適應含肌酐和尿酸的生長環(huán)境。圖1B為處于MRS培養(yǎng)基的處于對數(shù)生長期培養(yǎng)8 h的顯微形態(tài),圖1C為處于誘導MRS培養(yǎng)基的處于對數(shù)生長期培養(yǎng)8 h的顯微形態(tài),兩者無明顯差別,均呈短桿狀,生長狀況良好。

2.2 植物乳桿菌ZXH-1304S體外降解肌酐、尿酸能力

如圖2所示,未誘導的菌株對肌酐和尿酸幾乎沒有降解能力,而經(jīng)過誘導的菌株表現(xiàn)出極顯著降解肌酐和尿酸的能力(p<0.01),肌酐濃度下降46.87%,尿酸濃度下降30.75%,說明該菌體在誘導條件下可降解環(huán)境中的肌酐和尿酸。

圖2 植物乳桿菌ZXH-1304S體外降解肌酐、尿酸實驗

2.3 誘導后的植物乳桿菌ZXH-1304S耐酸和耐膽鹽實驗結果

如圖3所示,菌株在pH1.5的人工胃液有一定量的死亡,但總體對酸的耐受性較好,8 h菌體存活率為78.23%。植物乳桿菌ZXH-1304S在膽鹽環(huán)境下也表現(xiàn)出較好的耐受性,8 h菌體的存活率達84.38%,說明該菌株較好地耐受了酸性環(huán)境和膽鹽環(huán)境,能夠適應人體胃腸道。

圖3 植物乳桿菌ZXH-1304S耐酸和耐膽鹽實驗

2.4 誘導菌株降解肌酐、尿酸動物實驗結果

誘導后的植物乳桿菌ZXH-1304S干預高肌酐和尿酸模型大鼠結果如圖4。

圖4 誘導后的植物乳桿菌ZXH-1304S干預(A)肌酐和(B)尿酸大鼠模型

如圖4所示,模型大鼠的肌酐和尿酸含量明顯高于對照組,差異極顯著(p<0.01),說明造模成功,植物乳桿菌低劑量組肌酐濃度與模型組相比無顯著性差異,而尿酸濃度顯著低于模型組(p<0.05)。植物乳桿菌高劑量組肌酐濃度和尿酸濃度均極顯著低于模型組(p<0.01),別嘌醇對照組肌酐濃度和尿酸濃度均極顯著低于模型組(p<0.01)。以上結果表明,高劑量的植物乳桿菌ZXH-1304S能夠明顯降低模型大鼠血中肌酐和尿酸濃度,其作用效果較別嘌醇略差。

3 結論

采用前期篩選得到一株能夠降解肌酐和尿酸的植物乳桿菌ZXH-1304S,發(fā)現(xiàn)該菌在MRS誘導培養(yǎng)基中生長狀況良好,其微觀形態(tài)沒有發(fā)生改變,說明該菌適合大規(guī)模培養(yǎng),且該菌表現(xiàn)出較強的耐酸和耐膽鹽能力。通過誘導培養(yǎng)后,該菌能夠在體外降解肌酐和尿酸,體內(nèi)實驗也驗證了其降解肌酐和尿酸的能力顯著,僅比別嘌醇略低,其作用機制還有待進一步研究。植物乳桿菌為藥食同源的益生菌,安全性極高,因此該菌有望進一步開發(fā)成為具有藥用價值的益生菌制劑。