王澤建,張 琴,王 萍,莊英萍

(華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室,上海 200237)

凝膠多糖是一類直鏈β-1,3-葡聚糖,1996年12月經(jīng)過美國FDA長期的安全無毒實驗后，被正式批準(zhǔn)為繼黃原膠和結(jié)冷膠之后的第三個食品添加劑[1]。目前凝膠多糖市場主要被日本等國外企業(yè)壟斷。1992年凝膠多糖的研發(fā)生產(chǎn)被納入863計劃,江蘇省率先開展了凝膠多糖的生產(chǎn),隨后國內(nèi)各大高校開始了凝膠多糖的發(fā)酵生產(chǎn)研究,但得到的產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)量低,性能較差,成本高,難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[2-3]，不具有市場競爭力。目前,凝膠多糖的國內(nèi)市場需求量劇增,迫切需要實現(xiàn)凝膠多糖的產(chǎn)業(yè)化[4]。

凝膠多糖主要由糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)或土壤桿菌(Agrobacteriumspecies)通過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)而得。糞產(chǎn)堿桿菌發(fā)酵生產(chǎn)凝膠多糖是好氧發(fā)酵過程,發(fā)酵過程中菌體濃度、碳源種類、氮源種類與濃度控制、磷酸鹽濃度是影響發(fā)酵生產(chǎn)的關(guān)鍵因素;同時針對其高粘度的流體特性,反應(yīng)器結(jié)構(gòu)、攪拌槳系統(tǒng)、通氣方式等是生產(chǎn)過程中影響生產(chǎn)放大的主要因素[5-7]。以葡萄糖為碳源的研究顯示,高濃度的葡萄糖對于凝膠多糖的合成有較強的抑制作用。目前,有關(guān)凝膠多糖分批發(fā)酵工藝優(yōu)化方面的報道甚多,分別在氮源限制性濃度、不同階段的pH調(diào)控、供氧水平控制、微量促進(jìn)因子添加等角度研究了工藝條件改變對分批培養(yǎng)過程中產(chǎn)物合成量的影響,對提升分批培養(yǎng)過程中凝膠多糖的產(chǎn)量有一定作用[8-9]。

然而,分批培養(yǎng)過程發(fā)酵周期長,培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生大量不利于菌體生長和產(chǎn)物合成的代謝副產(chǎn)物[10],造成生產(chǎn)效率低。深入了解A.faecalis的生長和合成代謝特性的響應(yīng)關(guān)系,對于提升凝膠多糖生產(chǎn)效率非常關(guān)鍵[11]。恒化培養(yǎng)通過連續(xù)添加新鮮物料及廢液的排出可以避免營養(yǎng)物質(zhì)缺乏及代謝副產(chǎn)物的抑制;而且達(dá)到穩(wěn)態(tài)后,細(xì)胞的比生長速率μ與反應(yīng)器的稀釋率D相等,從而可以通過控制操作變量實現(xiàn)細(xì)胞生長、比產(chǎn)物合成和底物消耗的控制[12]。因此可以通過恒化培養(yǎng)探索該生產(chǎn)菌最大的產(chǎn)物合成速率及生產(chǎn)能力,為工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)模式的選擇提供理論基礎(chǔ)。

本研究通過恒化培養(yǎng)條件下發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)及動力學(xué)模型分析,不僅深入了解微生物的生理代謝特性,而且研究了不同生長狀態(tài)下細(xì)胞的發(fā)酵特性和最佳生產(chǎn)效率,對凝膠多糖連續(xù)發(fā)酵控制及生產(chǎn)效率的提升具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌種Alcaligenesfaecalis(YF15) 山東福洋生物科技有限公司提供;牛肉膏、胰蛋白胨 英國OXOID公司;(NH4)2HPO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCO399%,分析純,國藥集團;玉米漿、葡萄糖 山東西王生物科技有限公司。

TGL-16G高速臺式離心機 上海恒豐儀器儀表;SBA-40E生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;UV-2012PC型紫外可見分光光度計 美國UNICO公司;5L發(fā)酵罐 上海國強生化工程裝備有限公司;尾氣過程質(zhì)譜儀 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 斜面培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3,胰蛋白胨5,NaCl 3,玉米漿 1.5 mL (V∶V),瓊脂20,調(diào)pH7.0,121 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基(g/L):蔗糖40,(NH4)2HPO43,MgSO4·7H2O 1,KH2PO41.5,CaCO33,玉米漿1 mL(V∶V),微量元素10 mL (V∶V),調(diào)pH7.0,121 ℃滅菌30 min。

分批培養(yǎng)用基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖70,(NH4)2HPO41.5,(NH4)2SO41,NaCl 1,MgSO4·7H2O 0.5,KH2PO41,玉米漿1 mL (V∶V),微量元素10 mL (V∶V),121 ℃滅菌30 min。

恒化培養(yǎng)用發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖40,(NH4)2HPO41.5,(NH4)2SO41,NaCl 1,MgSO4·7H2O 0.5,KH2PO41,微量元素10 mL (V∶V),121 ℃滅菌30 min。

1.2.2 種子培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的新鮮斜面種子用無菌水洗滌,按8%(V/V)接種量接入搖瓶,32 ℃培養(yǎng)18～20 h。

1.2.3 分批發(fā)酵培養(yǎng) 在5 L發(fā)酵罐中利用分批發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行分批培養(yǎng),裝液量為2 L,接種量為5% (V/V),培養(yǎng)溫度32 ℃,轉(zhuǎn)速600 r/min,通氣量2 L/min,罐壓0.05 MPa。整個發(fā)酵過程在線檢測pH、溶氧、利用質(zhì)譜儀檢測尾氣并計算相關(guān)呼吸代謝參數(shù),利用Biostar軟件在線采集。

1.2.4 恒化培養(yǎng) 恒化培養(yǎng)裝置 包括進(jìn)料系統(tǒng)、出料系統(tǒng)、以及發(fā)酵罐部分(圖1)。

圖1 罐恒化培養(yǎng)裝置示意圖

進(jìn)料系統(tǒng)通過蠕動泵以某一恒定速率將補料桶的培養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐,補料桶配有磁力攪拌器保證培養(yǎng)基充分混合。出料系統(tǒng)由蠕動泵控制發(fā)酵液體積為2 L。為避免氮源限制的恒化過程中糖濃度過高引起發(fā)酵液粘稠增加,以及過高糖濃度引起原料的浪費,根據(jù)殘?zhí)菨舛鹊淖兓{(diào)整恒化培養(yǎng)過程中料液糖濃度。培養(yǎng)基、堿液、流出廢液、發(fā)酵液重量等進(jìn)行在線采集。

在分批發(fā)酵培養(yǎng)菌體生長達(dá)到對數(shù)生長期(6.5～8 h)后,啟動恒化培養(yǎng),通過控制恒化培養(yǎng)基連續(xù)流加和排出速率,控制不同稀釋率分別在0.05、0.1、0.16、0.21、0.29和0.32 h-1。過程中,測定流加培養(yǎng)基和堿液的進(jìn)料體積,恒化流出液的體積,維持發(fā)酵罐中培養(yǎng)液體積一致。過程中pH用氫氧化鈉堿液控制在6.5,通過轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)溶氧濃度不低于15%。通過流加培養(yǎng)基中硫酸銨濃度的調(diào)節(jié)控制銨離子濃度處于限制性濃度,即低于60 mg/L。一般認(rèn)為恒化培養(yǎng)經(jīng)過4～5個洗脫體積之后,菌體的關(guān)鍵在線參數(shù)CER,以及離線參數(shù)菌體濃度和產(chǎn)物濃度參數(shù)指標(biāo)變化波動在5%范圍內(nèi)時,即認(rèn)為已經(jīng)達(dá)到恒化培養(yǎng)擬穩(wěn)態(tài)狀態(tài)。恒化培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)后,細(xì)胞比生長速率μ與稀釋速率D相等。

1.2.5 不同稀釋率對糞產(chǎn)堿桿菌生理代謝特性的影響 恒化培養(yǎng)過程進(jìn)入穩(wěn)定期(6.5～8 h)時,稀釋速率與菌體的比生長速率相等,因此通過控制恒化培養(yǎng)過程中的稀釋速率實現(xiàn)菌體比生長速率控制。前期發(fā)酵批次培養(yǎng)結(jié)果顯示[12],A.faecalis利用葡萄糖時最大的比生長速率高達(dá)0.36 h-1,因此本次恒化實驗控制的比生長速率分別為0.05、0.1、0.16、0.21、0.29和0.32 h-1進(jìn)行A.faecalis恒化培養(yǎng),過程中每隔半個洗脫體積對二氧化碳釋放速率(CER)、菌濃、凝膠多糖含量(P)、菌體的比銨離子消耗速率(qNHz)、葡萄糖含量、尾氣組分等參數(shù)進(jìn)行測定。并根據(jù)測定參數(shù)統(tǒng)計培養(yǎng)過程中細(xì)胞的比葡萄糖消耗速率(qGlc)、比丙酮酸合成速率(qPYR)、比產(chǎn)物合成速率(qp)、比二氧化碳釋放速率(coqco2)、比氧消耗速率(qo2)、比葡萄糖消耗速率(qs)等生理代謝參數(shù)。

1.2.6 代謝特性指標(biāo)的測定

1.2.6.1 菌濃測定 稱干重法[13]。

1.2.6.2 銨離子濃度測定 水楊酸鈉-次氯酸鈉比色法[14],統(tǒng)計得到單位菌體單位時間的銨離子消耗速率(qNHz)。

1.2.6.3 葡萄糖濃度測定 利用SBA-40C生物傳感分析儀測葡萄糖的濃度[15],統(tǒng)計得到糖耗速率及單位菌體單位時間的比葡萄糖消耗速率(qs)。

1.2.6.4 凝膠多糖含量測定 采用堿溶解和酸沉淀的稱重法[13]及苯酚硫酸法[16]測凝膠多糖含量。

C(%)=(λ550+0.0297)/0.5813/V取×0.05×D

式(1)

式中：λ550:測得的吸光度;V取:稀釋后樣品測定時的取樣量;D:樣液的稀釋倍數(shù)。

根據(jù)恒化實驗穩(wěn)態(tài)時的多糖的產(chǎn)量和對應(yīng)的菌體濃度計算得到單位菌體單位時間的比產(chǎn)物合成速率(qp)。

1.2.6.5 有機酸測定 Agilent 1100 HPLC系統(tǒng),色譜柱:AquaSep公司C8柱。流動相:0.05 mol/L磷酸二氫鉀(pH2.5)∶甲醇=95∶5;流速:0.6 mL/min。進(jìn)樣量:20 μL。柱溫:30 ℃。檢測波長:210 nm。

1.2.6.6 發(fā)酵過程尾氣分析與呼吸代謝參數(shù)測定 采用尾氣過程分析質(zhì)譜儀對發(fā)酵的進(jìn)氣和尾氣進(jìn)行實時在線采集分析,根據(jù)測定氣體中氮氣、二氧化碳和氧氣等的濃度計算發(fā)酵過程攝氧率(OUR)和二氧化碳生成速率(CER)[12],比氧消耗速率(qo2)和比二氧化碳釋放速率(qco2)分別利用OUR和CER除以菌濃得到。

1.2.7 葡萄糖代謝平衡計算

1.2.7.1 碳平衡計算 發(fā)酵過程中通過統(tǒng)計不同稀釋速率條件下葡萄糖的流加質(zhì)量、廢液中殘留糖的濃度統(tǒng)計葡萄糖的碳消耗摩爾數(shù)。通過發(fā)酵液中凝膠多糖、二氧化碳釋放量、菌濃和副產(chǎn)物等的測定計算生成的總碳摩爾數(shù)。根據(jù)生成的碳摩爾數(shù)與消耗碳摩爾數(shù)的比值得到碳回收率。

1.2.7.2 碳代謝去向分布 利用發(fā)酵液中凝膠多糖生成量、二氧化碳釋放量、菌濃生長量和副產(chǎn)物合成量等的測定值,計算各自碳摩爾數(shù)占消耗碳摩爾數(shù)百分比,得到消耗葡萄糖的碳去向分布。以上四個主要去向碳元素的總摩爾數(shù)除以消耗掉的葡萄糖碳元素的總摩爾數(shù),得到碳元素代謝去向分布。

1.2.8 恒化培養(yǎng)動力學(xué)模型計算 根據(jù)恒化培養(yǎng)過程中的代謝參數(shù)變化,采用Monod、Luedeking-Piret和Herbert-pirt模型研究了不同比生長速率條件下糞產(chǎn)堿桿菌的生理代謝特性變化,分析了糞產(chǎn)堿桿菌的生長、多糖合成和底物葡萄糖消耗的動力學(xué)變化。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗過程每個控制水平做三次重復(fù),每個取樣點數(shù)據(jù)測定三次,取平均值進(jìn)行統(tǒng)計分析。文中動力學(xué)統(tǒng)計模型利用Origin軟件和Matlab軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸統(tǒng)計與方差分析[12],得到菌體生長相關(guān)的產(chǎn)物合成系數(shù)、單位菌體產(chǎn)物合成常數(shù)、菌體對底物糖的最大得率系數(shù)、能量代謝維持系數(shù)、產(chǎn)物對底物糖的最大得率系數(shù)等動力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 以葡萄糖為碳源不同比生長速率條件下糞產(chǎn)堿桿菌生理代謝特性分析

2.1.1 恒化培養(yǎng)過程穩(wěn)態(tài)狀態(tài)的判斷 恒化培養(yǎng)過程中,通過調(diào)整流加培養(yǎng)基的流加速率控制菌體的穩(wěn)態(tài)比生長速率分別為0.05、0.10、0.16、0.21、0.29和0.32 h-1進(jìn)行A.faecalis恒化培養(yǎng),關(guān)鍵過程參數(shù)變化見圖2。從圖中參數(shù)的變化可以看出,在分批培養(yǎng)菌體生長進(jìn)入對數(shù)生長期后,通過調(diào)控相應(yīng)的稀釋速率啟動恒化培養(yǎng),經(jīng)過不少于4個洗脫體積后,CER、菌濃和凝膠多糖含量等均達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài),從CER、流出液的菌體濃度(比生長速率為0.16 h-1除外)和凝膠多糖含量變化中可以看出,菌體代謝進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)。隨著比生長速率從0.05 h-1增加到0.29 h-1,過程二氧化碳的釋放速率逐漸增加,而流出液的菌體濃度(比生長速率為0.16 h-1除外)和多糖含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。當(dāng)比生長速率控制在0.32 h-1的情況下,菌體生長接近臨界稀釋率,菌體濃度明顯降低,多糖合成大幅度下降。

圖2 不同比生長速率下糞產(chǎn)堿桿菌恒化培養(yǎng)過程中CER(A)、菌濃(B)和凝膠多糖含量(C)隨洗脫體積的變化

2.1.2 不同比生長速率下菌體的比速率參數(shù)變化分析 菌體的生長狀態(tài)與產(chǎn)物的合成速率、底物的消耗速率、產(chǎn)物得率等息息相關(guān)[12]。糞產(chǎn)堿桿菌在不同比生長速率條件下的生理代謝參數(shù)見表1。統(tǒng)計結(jié)果顯示,隨著比生長速率的增加,菌體的比銨離子消耗速率(qNHz)、比葡萄糖消耗速率(qGlc)、比二氧化碳釋放速率(qco2)和比氧消耗速率(qo2)不斷升高;有機酸測定結(jié)果顯示,糖消耗進(jìn)入糖酵解途徑生成丙酮酸的比合成速率隨著比生長速率的增加而增加,于0.29 h-1的比生長速率下達(dá)到最高值0.039 g/g/h,是比生長速率0.05 h-1時比合成速率的13倍,之后比產(chǎn)物合成速率趨于穩(wěn)定。而比產(chǎn)物合成速率(qp)則呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,當(dāng)稀釋率達(dá)到0.21 h-1時,qp達(dá)到最高值0.171 g/g/h。隨著比生長速率的繼續(xù)增加,qp呈現(xiàn)快速降低的趨勢,即單位菌體多糖合成速率急劇下降。

表1 不同比生長速率條件下糞產(chǎn)堿桿菌的生理代謝參數(shù)分析

恒化培養(yǎng)過程中,葡萄糖作為碳源和能源被消耗利用后,主要用于菌體生長、凝膠多糖合成、有機酸丙酮酸生成以及二氧化碳釋放。碳回收率統(tǒng)計計算結(jié)果顯示,不同比生長速率情況下碳元素的回收率均在100%±5%合理的范圍內(nèi)[12]。圖3是糞產(chǎn)堿桿菌在不同稀釋率條件下恒化培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)時的碳消耗去向分布情況。隨著比生長速率的增加,葡萄糖流向菌體生長的比例從18%增加到了47%,增加幅度為160%。流向凝膠多糖合成的碳去向分布由45%降低到了12%,降低幅度為73%。這主要是由于在高比生長速率的條件下更多糖用于菌體的生長。副產(chǎn)物丙酮酸的糖消耗占比從低比生長速率的1%上升到比生長速率為0.29 h-1時的5%,這可能是因為在高比生長速率(即高稀釋率)條件下,發(fā)酵培養(yǎng)液中氮源和碳源相對更充足,促進(jìn)了糖酵解途徑的快速代謝,導(dǎo)致菌體自身的快速生長以及副產(chǎn)物的大量合成。而當(dāng)比生長速率繼續(xù)增大到0.32 h-1時,由于菌體合成的碳元素流向分布呈降低趨勢,尤其是用于產(chǎn)物合成的糖去向分布顯著降低,葡萄糖轉(zhuǎn)向二氧化碳生成的比例大幅度增加,達(dá)到了41%。

圖3 不同比生長速率條件下糞產(chǎn)堿桿菌恒化培養(yǎng)過程的碳元素去向分布

2.1.3 不同比生長速率下菌體的代謝參數(shù)變化 恒化培養(yǎng)控制不同比生長速率代謝達(dá)到穩(wěn)態(tài)時的菌體生理代謝參數(shù)變化如圖4所示。隨著比生長速率控制水平從0.05 h-1增加到0.29 h-1,對應(yīng)的恒化培養(yǎng)稀釋速率也隨之增大,但各稀釋速率條件下穩(wěn)態(tài)時的菌濃變化并不明顯,均在5 g/L上下波動(圖4A)。但是,當(dāng)比生長速率控制在0.32 h-1時,穩(wěn)態(tài)時的菌濃快速下降至1.8 g/L,表明該稀釋速率已經(jīng)接近恒化培養(yǎng)的臨界稀釋速率Dc,此時的比生長速率已接近該培養(yǎng)基環(huán)境條件下的最大值0.36 h-1,菌體主要以生長狀態(tài)為主。較高的稀釋體積會造成培養(yǎng)過程中菌體量的大量洗出,使得菌濃明顯下降。

如圖4B所示,隨著比生長速率控制水平從0.05 h-1增加到0.29 h-1時,單位體積二氧化碳釋放速率(CER)呈不斷上升趨勢,增長幅度達(dá)到了74%以上。隨著比生長速率增加到0.32 h-1,單位體積CER迅速降低,但單位菌體的比二氧化碳釋放速率qco2和比氧消耗速率qo2均呈現(xiàn)出快速上升的趨勢(表1),表明菌體的呼吸代謝活力大大增強。由圖2C可知,隨著比生長速率控制水平的提升,恒化穩(wěn)定時多糖產(chǎn)量呈現(xiàn)下降趨勢,從最大值14 g/L下降到0.6 g/L。然而,凝膠多糖的比產(chǎn)率變化顯示(表1),當(dāng)比生長速率為0.21 h-1時,凝膠多糖比合成產(chǎn)率達(dá)到最大值0.171 g/g/h。隨著比生長速率的進(jìn)一步提升,單位菌體凝膠多糖的合成速率呈下降趨勢。

圖4 糞產(chǎn)堿桿菌不同比生長速率下菌體生理代謝參數(shù)變化

2.2 恒化培養(yǎng)條件下凝膠多糖發(fā)酵動力學(xué)分析

采用動力學(xué)模型對參數(shù)進(jìn)行評估分析,量化菌體生長、產(chǎn)物合成、底物消耗、銨離子限制性因素等在恒化培養(yǎng)過程中的相關(guān)性對于了解生產(chǎn)過程代謝動力學(xué)非常關(guān)鍵[17]。因此,本研究對上述6個不同比生長速率條件下糞產(chǎn)堿桿菌恒化培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)的菌體生長、多糖合成、底物消耗過程進(jìn)行了動力學(xué)分析。

2.2.1 菌體生長動力學(xué)模型 單級連續(xù)操作攪拌槽式反應(yīng)器(CSTR)進(jìn)行細(xì)胞恒化培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)后,細(xì)胞比生長速率μ與稀釋速率D相等,可以選用Monod方程擬合,如式(2)。

式(2)

式(3)

圖5反映了銨離子限制條件下恒化培養(yǎng)糞產(chǎn)堿桿菌的銨離子濃度(S)與比生長速率(μ)之間的關(guān)系。由圖7B可知，1/S與1/μ呈現(xiàn)很好的相關(guān)性,決定系數(shù)達(dá)到0.979。由公式2擬合方程計算得到μmax=0.36 h-1,Ks=2.27 mg/L。恒化培養(yǎng)穩(wěn)態(tài)條件下能達(dá)到的最大稀釋率Dc不會超過最大的比生長速率μmax,否則菌體會被洗出,恒化系統(tǒng)將不能達(dá)到穩(wěn)態(tài)。該模型擬合得到的最大比生長速率與前期批培養(yǎng)過程中菌體生長階段計算得到的最大比生長速率一致。飽和常數(shù)Ks是比生長速率μ達(dá)到其最大值一半時的基質(zhì)濃度,Ks值越小,菌體對底物的親和力越強,達(dá)到μmax的所需底物濃度越低,底物就更容易被利用。由此得到糞產(chǎn)堿桿菌在銨離子限制條件下的菌體生長動力學(xué)模型為:

圖5 糞產(chǎn)堿桿菌在銨離子限制濃度S與比生長速率μ的關(guān)系

μ=0.36S/(2.27+S)

式(4)

2.2.2 銨離子限制條件下凝膠多糖比合成動力學(xué)模型 通過探究凝膠多糖批次發(fā)酵過程可知,糞產(chǎn)堿桿菌生產(chǎn)凝膠多糖是部分生長相關(guān)的過程,即菌體生長期間,多糖合成量少;當(dāng)菌體達(dá)到穩(wěn)定期,多糖開始大量合成。本論文將利用Luedeking-Piret方程對部分偶聯(lián)型的凝膠多糖生產(chǎn)過程進(jìn)行擬合(式5):

qp=αμ+β

式(5)

式中:α為與菌體生長相關(guān)的產(chǎn)物合成系數(shù);β為單位菌體產(chǎn)物合成常數(shù)。

利用Origin軟件將6個不同稀釋速率條件下的比生產(chǎn)速率分階段進(jìn)行曲線擬合(圖6),得到凝膠多糖的合成動力學(xué)模型分別為:

圖6 銨離子限制A.faecalis恒化培養(yǎng)比生長速率μ與比合成速率qp之間的關(guān)系

式(6)

由于菌體生長和凝膠多糖的合成均會受到氮源限制,即氮源濃度過低,菌體生長受到限制;而氮源濃度過高時,凝膠多糖合成會受到抑制,所以凝膠多糖合成模型需要考慮到氮源濃度對其的抑制,根據(jù)酶抑制動力學(xué)方程模擬氮源限制的凝膠多糖合成動力學(xué)方程:

qp=αμ+β(1-S/Sr)

式(7)

式中:S為銨離子濃度,Sr為限制性銨離子濃度。

當(dāng)S?Sr,即氮源處在限制狀態(tài),則qp=αμ+β;

當(dāng)Sr

將式(4)與式(7)結(jié)合,得到銨離子限制的凝膠多糖合成動力學(xué)方程為:

qp=0.36αS/(2.27+S)+β×(1-S/Sr)

式(8)

利用Matlab軟件擬合該方程,得到α、β、Sr的值分別為0.17 g/g、0.14 g/g/h、64.93 mg/L。得到銨離子限制的凝膠多糖合成動力學(xué)方程(式9)為:

qp=0.0612S/(2.27+S)+0.14×(1-S/64.94)

式(9)

對式(8)求導(dǎo)并令導(dǎo)函數(shù)為0,得到限制性的銨離子濃度為5.75 mg/L,即當(dāng)銨離子濃度超過該濃度時,凝膠多糖的合成將會受到嚴(yán)重限制。因此在凝膠多糖合成過程中,進(jìn)行合理的銨離子濃度控制,對于提升產(chǎn)率和底物糖轉(zhuǎn)化率非常重要。

2.2.3 銨離子限制下的比底物消耗動力學(xué)模型 糞產(chǎn)堿桿菌凝膠多糖發(fā)酵過程中葡萄糖消耗主要用于菌體的生長、多糖的合成和菌體的呼吸代謝維持,因此比底物消耗Herbert-Pirt方程可以表示為(式10)[18]:

式(10)

qs=1.5μ+qp+0.0625

式(11)

將得到的qp(式6)帶入的比底物消耗速率qs方程(式11)得到Herbert-Pirt方程:

式(12)

從得到的比底物消耗速率模型參數(shù)可以看出,菌體對葡萄糖的得率系數(shù)為0.67 g/g,該得率系數(shù)高于已有的文獻(xiàn)報道,主要是與本實驗中銨離子的限制有關(guān),銨離子限制促進(jìn)了菌體對糖的得率。銨離子限制下菌體的維持系數(shù)為0.063 g/g/h,該參數(shù)高于史其峰等[13]報道的銨限制條件下維持系數(shù)為0.048 g/g/h,而低于Phillips等[19]報道的限制性氮源條件下的維持系數(shù)為0.072 g/g/h,主要與不同的糞產(chǎn)堿桿菌突變株及培養(yǎng)基環(huán)境條件有關(guān)。該參數(shù)高于已報道的分批培養(yǎng)過程中菌體的維持系數(shù)0.031 g/g/h,說明在恒化培養(yǎng)高的比產(chǎn)率條件下(表2),需要產(chǎn)生更多的能量及還原力來維持多糖的合成[20]。

2.3 糞產(chǎn)堿桿菌分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵凝膠多糖合成代謝特性比較

凝膠多糖發(fā)酵生產(chǎn)過程中,比產(chǎn)率反映了單位菌體單位時間產(chǎn)糖的能力,是用于比較分析不同培養(yǎng)模式對菌體產(chǎn)糖能力的重要依據(jù)。本研究前期分批培養(yǎng)[12]與銨離子限制下不同比生長速率控制的恒化培養(yǎng)過程得到的產(chǎn)率和比產(chǎn)率對比見表2,恒化培養(yǎng)過程中的產(chǎn)率和比產(chǎn)率是遠(yuǎn)優(yōu)于分批培養(yǎng)。從產(chǎn)率上,隨著比生長速率從0.05 h-1增加到0.21 h-1,產(chǎn)率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢,而且均高于分批培養(yǎng)條件下的產(chǎn)物合成速率。當(dāng)比生長速率為0.21 h-1時產(chǎn)物合成速率達(dá)到最高，為0.851 g/L/h,與分批培養(yǎng)(0.389 g/L/h)相比提升了118%。隨著比生長速率的進(jìn)一步提升,產(chǎn)率呈快速下降的趨勢。當(dāng)比生長速率控制在0.32 h-1時,產(chǎn)率只有分批培養(yǎng)的一半,且遠(yuǎn)低于0.21 h-1的比生長速率時產(chǎn)率。在比產(chǎn)率上,恒化培養(yǎng)模式均比分批培養(yǎng)要高,最佳稀釋速率為0.21 h-1時其比產(chǎn)率是分批培養(yǎng)的3倍,能夠明顯提升凝膠多糖的生產(chǎn)效率。

表2 分批培養(yǎng)和恒化培養(yǎng)下curdlan的產(chǎn)率和比合成速率的比較

恒化培養(yǎng)過程的比產(chǎn)率隨著比生長速率的升高,呈現(xiàn)鐘型曲線變化,說明適當(dāng)控制凝膠多糖發(fā)酵過程中菌體的比生長速率,能夠改善產(chǎn)物的合成速率及比產(chǎn)物合成速率,這與糞產(chǎn)堿桿菌的凝膠多糖發(fā)酵過程屬于部分偶聯(lián)型有關(guān)。在分批培養(yǎng)過程中,菌體生長和產(chǎn)物合成存在明顯的分階段特性,在合成階段菌體比生長速率較低,菌濃較高,高含量多糖的培養(yǎng)液粘度升高會限制發(fā)酵液中氧的傳遞速率,從而影響了單位菌體的氧消耗速率和比二氧化碳生成速率(表1),造成在合成階段能量和還原力提供的不足[20-21],限制了凝膠多糖的產(chǎn)率和比合成速率。

3 結(jié)論

本研究通過恒化實驗,詳細(xì)考察了銨離子限制條件下不同比生長速率對糞產(chǎn)堿桿菌(A.faecalis)發(fā)酵生產(chǎn)凝膠多糖的生理代謝特性參數(shù)的影響。

在銨離子限制條件下的菌體比生長速率與銨離子濃度之間的動力學(xué)模型 μ=0.36S/(2.27+S),凝膠多糖比產(chǎn)率與銨離子濃度間的動力學(xué)模型qp=0.0612S/(2.27+S)+0.14×(1-S/64.94),以及比底物葡萄糖消耗速率與比產(chǎn)率的動力學(xué)模型:qs=1.5μ+qp+0.0625。

建立了通過其生理代謝參數(shù)的比較,獲得了比生長速率和比產(chǎn)物合成之間的響應(yīng)關(guān)系,在稀釋率0.21 h-1時,A.faecalis的最高產(chǎn)率可達(dá)到0.85 g/L/h,并且最大的比合成速率高達(dá)0.171 g/g/h,該結(jié)果與批次培養(yǎng)過程相比分別可提升了118%和200%。說明在分批培養(yǎng)過程中,通過氮源營養(yǎng)控制合理的菌體比生長速率對于提升發(fā)酵產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化效率非常重要。

凝膠多糖發(fā)酵過程中,增加比氧消耗速率和二氧化碳釋放速率能夠促進(jìn)凝膠多糖的合成速率和比合成速率,當(dāng)比氧消耗速率達(dá)到0.217 mmol/g/h時,能夠為細(xì)胞的合成代謝提供充足的能量和還原力。過高的比氧消耗速率將加重細(xì)胞的氧脅迫[21],促進(jìn)菌體生長和維持能消耗,抑制了細(xì)胞的比產(chǎn)物合成速率。在進(jìn)一步的研究中可以分析物質(zhì)傳遞及發(fā)酵培養(yǎng)液中代謝副產(chǎn)物的變化對多糖合成與釋放產(chǎn)生抑制機制。