李現(xiàn)日,張 杰,張英美,金太文,康明秀,袁其朋

(1.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100029;2.金亨稷師范大學(xué),平壤 999093;3.金日成綜合大學(xué),平壤 999095)

金花葵(Aureahelianthus)又名金芙蓉、菜芙蓉、野芙蓉,為錦葵科,秋葵屬,一年生草本植物,在200多種秋葵植物中最具有食用、藥用、保健等功能,有較高的商業(yè)價(jià)值[1]。研究發(fā)現(xiàn),金花葵的花、莖、葉、種子中都含有豐富的生物活性物質(zhì),具有良好的抗氧化、降血脂、降血糖、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、解熱、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、保肝等功能[2]。目前,針對金花葵中活性物質(zhì)的主要研究為金花葵中多糖提取及其抗氧化活性研究[2-5]、金花葵中黃酮多種提取方法研究(有機(jī)溶劑回流提取、索式提取及輔助提取)[6-10],但關(guān)于不同溶劑對金花葵花中黃酮的萃取及萃取物的活性研究尚未報(bào)道。為了深入研究不同極性溶劑對金花葵花中黃酮萃取及活性的影響,本文對金花葵花黃酮乙醇提取物進(jìn)行溶劑分級(jí)萃取,采用DPPH自由基法、羥基自由基法、還原能力法、超氧陰離子能力法和油脂抗氧化作用法,對不同萃取物進(jìn)行體外抗氧化實(shí)驗(yàn),分析抗氧化活性與各萃取物中黃酮含量的關(guān)系。以期為進(jìn)一步開發(fā)和發(fā)展金花葵花中的黃酮提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金花葵花 購自北京順義;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 美國Sigma公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.0%) 成都普菲德生物技術(shù)有限公司;乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇 均為分析純,北京化學(xué)試劑廠;硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、抗壞血酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、水楊酸、過氧化氫、硫代巴比妥酸、三羥基氨基甲烷、鐵氰化鉀、三氯乙酸等 均為國產(chǎn)分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV2450型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;CA-1115A型冷卻水循環(huán)裝置 上海愛朗儀器有限公司;BT-255電子分析天平 德國Sartorius公司;DZF-6020型真空干燥箱 上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;TDL-40B臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金花葵花不同萃取物的制備 采用宋琳琳等[7]的方法,略有改動(dòng)。金花葵花自然干燥5 d,粉碎,過80目篩,4 ℃?zhèn)溆谩７Q取金花葵花粉末10.00 g,每次用75%乙醇200 mL 70 ℃水浴回流提取2 h,共三次,合并提取液,經(jīng)減壓濃縮得浸膏。

采用云成悅等[11]的方法,萃取流程如圖1。先將乙醇提取浸膏用0.5 L去離子水溶解,后加入0.25 L的石油醚進(jìn)行振蕩,靜置20 min,待完全分層后收集上層的石油醚相,下層水相按上述方法再萃取四次;剩余水相按上述步驟依次用乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取,依次得到石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液及最后的水相溶液,將相同萃取劑的萃取液合并進(jìn)行減壓濃縮,得萃取物浸膏,然后置于干燥器中。將金花葵花各萃取物用去離子水配制不同濃度梯度(0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL)的萃取物溶液,用于后續(xù)抗氧化活性測定實(shí)驗(yàn)。

圖1 金花葵花不同萃取物的制備流程

1.2.2 總黃酮含量測定 采用Viacava等[12]的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法,略有改動(dòng)。稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品8.00 mg,置于50 mL 量瓶中,用70%乙醇溶解并稀釋至刻度搖勻,得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品初始液。精密吸取 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品初始液,分別置于10 mL 容量瓶中,加70%乙醇稀釋至5.0 mL,加入0.4 mL 5% NaNO2搖勻,靜置6 min,加入0.4 mL 10% Al(NO3)3搖勻,靜置6 min,加入0.4 mL 4% NaOH,最后加去離子水定容10 mL,搖勻后靜置15 min,在 λ=510 nm處測定吸光度A。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度(X)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程Y=2.4254X-0.0273(R2=0.9996),把測定樣品吸光值代入方程,得到總黃酮含量。

1.2.3 體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力的測定 采用Priyanka等[13]的方法,略有改動(dòng)。用去離子水配制不同濃度梯度0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的各萃取物溶液,并用抗壞血酸(VC)溶液作為對照。取樣品溶液0.5 mL,加入2 mL 0.1 mg/mL DPPH無水乙醇溶液,混勻室溫避光反應(yīng)30 min,在517 nm處測定樣品吸光度Ai,空白組Aj以等量去離子水代替DPPH溶液,對照組VC以等量去離子水代替樣品溶液,平行測定3次,取平均值。清除率計(jì)算公式如式(1)。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式(1)

式中:Ac對照組吸光值;Ai樣品溶液的吸光值;Aj空白組吸光值。

1.2.3.2 羥基自由基清除能力的測定 采用Chen[14]的方法,略有改動(dòng)。原理基于H2O2和Fe2+混合發(fā)生Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH。在10 mL的試管中依次加入2 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液,2 mL不同濃度梯度0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的萃取物溶液,VC溶液作為對照,加入1 mL 8 mmol/L H2O2溶液混勻啟動(dòng)反應(yīng),室溫靜置10 min,最后加入2 mL 5 mmol/L的水楊酸溶液作為捕獲劑,混勻并靜置30 min后,取適量上清液,510 nm測吸光度Ai,空白組Aj以等量去離子水代替水楊酸溶液,對照組Ac以等量去離子水代替樣品溶液。平行測定3次,取平均值。清除率計(jì)算公式如式(2)。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式(2)

式中:Ac對照組吸光值;Ai樣品溶液的吸光值;Aj空白組吸光值。

1.2.3.3 還原能力的測定 采用Yildirim等[15]的鐵氰化鉀還原法,略有改動(dòng)。不同濃度梯度0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的各萃取物溶液和VC溶液作為對照,分別取不同濃度梯度的溶液2 mL,加入2 mL pH=6.6 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和2 mL 1%鐵氰化鉀溶液,50 ℃水浴20 min。水浴結(jié)束后加入2 mL 10%的三氯乙酸,混勻后3000 r/min離心10 min。取上清液2 mL加入試管中,再依次加入2 mL去離子水以及0.5 mL 0.1%三氯化鐵在試管中,混勻反應(yīng)10 min,在700 nm處測定吸光度。

1.2.3.4 清除超氧陰離子能力的測定 采用Liang等[16]的方法,略有改動(dòng)。取5 mL 0.1 mol/L pH=8.2 Tris-HCl的緩沖液與0.5 mL不同濃度梯度0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL各萃取物溶液及VC溶液,用去離子水補(bǔ)充至9.5 mL,置于10 mL比色管中混勻,25 ℃水浴20 min,取出后立即加入0.5 mL在25 ℃預(yù)熱過的3 mmol/L鄰苯三酚,迅速搖勻后倒入比色皿中,用4 mL 10 mmol/L HCl為空白液,在320 nm波長處,每隔30 s測吸光度一次,共計(jì)4 min,以吸光值A(chǔ)對反應(yīng)時(shí)間t作線性關(guān)系圖,斜率即為Vt,計(jì)算出抗氧化劑對超氧陰離子的清除率。清除率計(jì)算公式如式(3)。

清除率(%)=[1-V1/V0]×100

式(3)

式中:V1樣品吸光值斜率;V0鄰苯三酚吸光值斜率。

1.2.3.5 油脂抗氧化作用的測定 采用劉丹丹等[17]方法,略有改動(dòng)。硫代巴比妥酸(TBA)法是目前測定脂質(zhì)過氧化常用的方法。脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸被氧化為過氧化脂質(zhì),后期生成大量的丙二醛(MDA),其可與TBA 縮合,在pH=3.0時(shí)顯粉紅色,在532 nm 處有特征吸收,可根據(jù)吸光度值A(chǔ)判斷脂質(zhì)過氧化的程度。分別將2 mL 1.00 mg/mL的萃取物、VC和去離子水置于具塞錐形瓶中,依次加2 mL 2.5% 亞油酸溶液,4 mL pH=7.4 0.05 mol/L PBS緩沖溶液,2 mL去離子水,0.5 mL 5 mmol/L H2O2,以無水乙醇作為對照。混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。每隔24 h取1 mL樣品,加入1 mL 10%三氯乙酸,靜置20 min,加入1 mL 0.3%硫代巴比妥酸溶液,混勻后沸水浴加熱20 min,室溫下冷卻后加入2 mL正丁醇,充分搖勻,3000 r/min離心15 min,取上清液于532 nm測定吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。采用Origin 8.0和SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同極性溶劑萃取物的質(zhì)量及黃酮含量

不同極性溶劑萃取物的質(zhì)量測定結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,提取物中極性大的成分較多,故萃取物質(zhì)量:乙醇提取物>水相>乙酸乙酯相>正丁醇相>石油醚相。不同極性溶劑萃取物中黃酮含量如圖3所示。由圖3可知,金花葵花乙醇提取物經(jīng)不同極性溶劑分級(jí)萃取后,各萃取相中黃酮含量差異明顯,黃酮含量順序?yàn)?乙酸乙酯相>正丁醇相>乙醇提取物>石油醚相>水相。黃酮含量范圍為11.5%～48.3%,乙酸乙酯相和正丁醇相中黃酮含量顯著高于其它組(p<0.05)。其中乙醇提取物中黃酮含量為30.4%,乙酸乙酯相中黃酮含量為48.3%,黃酮含量提高倍數(shù)約為1.6倍,接近金花葵花黃酮經(jīng)聚酰胺樹脂純化1.9倍[9]。液-液萃取法是近年來備受關(guān)注的純化技術(shù),不僅在一定程度上提高了純度,還具有高效節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)[18-19]。

圖2 不同萃取物質(zhì)量的比較

圖3 不同萃取物黃酮含量的比較

2.2 不同極性溶劑萃取物體外抗氧化活性測定結(jié)果

2.2.1 DPPH自由基清除能力 由圖4可知,金花葵花不同極性溶劑萃取物對DPPH自由基的清除作用存在劑量依賴效應(yīng),在0.20～1.00 mg/mL的濃度范圍內(nèi),隨著各萃取物濃度的增加,清除率也相應(yīng)地增加。同一濃度下,各萃取物對DPPH自由基的清除順序?yàn)?乙酸乙酯相>正丁醇相>乙醇提取物>石油醚相>水相,與其黃酮含量趨勢一致。比較VC與各萃取物,發(fā)現(xiàn)VC、乙酸乙酯相、正丁醇相對DPPH清除能力顯著高于其它萃取物(p<0.05)。各萃取物濃度為1.00 mg/mL時(shí),其清除率分別為乙酸乙酯相97.5%、正丁醇相96.8%、乙醇提取物87.3%、石油醚相82.2%、水相81.3%。金花葵花各萃取物清除DPPH自由基的機(jī)理是其具有供氫體,可以提供質(zhì)子還原具有氧化性的自由基,終止自由基的連鎖反應(yīng),從而起到抑制或清除自由基的作用[20]。

圖4 金花葵花不同極性溶劑萃取物清除DPPH自由基能力

2.2.2 羥基自由基清除能力 由圖5可知,金花葵花不同極性溶劑萃取物對羥基自由基的清除作用存在劑量依賴效應(yīng),在0.20～1.00 mg/mL的濃度范圍內(nèi),隨著各萃取物濃度的增加,羥基自由基清除率隨之升高。同一濃度下,各萃取物對羥基自由基的清除順序?yàn)?乙酸乙酯相>正丁醇相>乙醇提取物>石油醚相>水相,與其黃酮含量趨勢一致。比較VC與各萃取物,發(fā)現(xiàn)VC、乙酸乙酯相、正丁醇相對羥基自由基清除能力顯著高于其它萃取物(p<0.05),尤其是乙酸乙酯相清除能力僅次于VC。各萃取物質(zhì)量濃度1.00 mg/mL時(shí),其清除率分別為乙酸乙酯相92.5%、正丁醇相90.8%、乙醇提取物81.3%、石油醚相70.5%、水相68.3%。

圖5 金花葵花不同極性溶劑萃取物清除羥基自由基能力

2.2.3 金花葵花各萃取物的還原能力 由圖6可知,金花葵花不同極性溶劑萃取物的還原能力存在劑量依賴效應(yīng),在0.20～1.00 mg/mL的濃度范圍內(nèi),隨著各萃取物質(zhì)量濃度的增加,還原能力也相應(yīng)地增加。各萃取物還原能力順序?yàn)?乙酸乙酯相>正丁醇相>乙醇提取物>石油醚相>水相,與其黃酮含量趨勢一致。乙酸乙酯相和正丁醇相還原能力顯著高于其它相(p<0.05)。在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí),金花葵花各萃取物的還原產(chǎn)物的吸光度分別為乙酸乙酯相2.48 Abs、正丁醇相2.26 Abs、乙醇提取物1.73 Abs、石油醚相1.32 Abs、水相1.28 Abs。

圖6 金花葵花不同極性溶劑萃取物的還原能力

2.2.4 超氧陰離子清除能力 由圖7可知,金花葵花不同極性溶劑萃取物對超氧陰離子的清除作用存在劑量依賴效應(yīng),在0.20～1.00 mg/mL的濃度范圍內(nèi),隨著各萃取物濃度的增加,超氧陰離子清除率隨之升高,與其黃酮含量趨勢一致。金花葵花各萃取物清除超氧陰離子能力不同,在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí),乙酸乙酯和正丁醇相清除超氧陰離子的能力分別為97.2%、96.8%,顯著高于石油醚相和水相的68.5%、63.1%(p<0.05)。

2.2.5 抗油脂氧化能力 丙二醛為油脂過氧化的次級(jí)產(chǎn)物,油脂在氧化初期,丙二醛的產(chǎn)量隨著氧化程度加深而增加。丙二醛顯色測定法與丙二醛產(chǎn)量密切相關(guān),因此在油脂氧化初期,次級(jí)代謝產(chǎn)物較少會(huì)影響丙二醛顯色法的顯色,氧化后期時(shí)丙二醛累積較為充足,顯色變化較為明顯,測定較為準(zhǔn)確[21]。金花葵花各萃取物添加量均為0.1%亞油酸時(shí),各萃取物的抗油脂氧化能力如圖8所示。亞油酸的丙二醛吸光值與時(shí)間呈正相關(guān),即時(shí)間越長,丙二醛吸光值越大。各萃取物抗油脂氧化能力均顯著高于對照亞油酸(p<0.05),即丙二醛吸光值越小,抗氧化能力越強(qiáng)。各萃取物抗油脂氧化能力順序?yàn)?乙酸乙酯相>正丁醇相>乙醇提取物>石油醚相>水相,尤其是乙酸乙酯相、正丁醇相有較強(qiáng)的抗油脂氧化作用,并且和VC抗油脂氧化能力相近。綜合以上結(jié)果,說明金花葵花各萃取物均具有抗油脂氧化能力,能有效延緩食用油脂的脂質(zhì)過氧化,其中乙酸乙酯相和正丁醇相效果顯著,這可能是跟萃取物中黃酮含量有關(guān)[22]。綜合以上結(jié)果,金花葵花各萃取物中黃酮含量越多,其抗油脂氧化能力越強(qiáng)[23]。

2.3 抗氧化活性指標(biāo)間的相關(guān)性分析

利用SPSS軟件對金花葵花各萃取物的質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時(shí),進(jìn)行了五種抗氧化活性指標(biāo)的相關(guān)性分析,結(jié)果見表1。從表1可知,還原能力與DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子的清除能力、抗油脂氧化能力呈極顯著相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)在0.969～0.995之間(p<0.01)。綜合看來,金花葵花各萃取物對五種體系的抗氧化活性測定結(jié)果基本一致,存在的些微不同一方面可能是因?yàn)樘崛〉玫降狞S酮是混合物,抗氧化活性成分較為復(fù)雜;另一方面可能是因?yàn)椴煌寡趸笜?biāo)的檢測機(jī)理不同[24]。

表1 五種抗氧化活性指標(biāo)相關(guān)性分析

2.4 總黃酮含量與抗氧化活性指標(biāo)的相關(guān)性分析

金花葵花各萃取物的質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時(shí),其黃酮含量與抗氧化能力的相關(guān)性見表2。從表2可知,總黃酮含量與還原力、清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子的能力和油脂抗氧化作用顯著相關(guān)性(p<0.05),相關(guān)系數(shù)在0.937～0.980之間,說明金花葵花黃酮具有較高的體外抗氧化能力。黃酮結(jié)構(gòu)中的鄰位酚羥基很容易被氧化成醌類結(jié)構(gòu),使得黃酮具有較強(qiáng)捕捉自由基的能力和抗氧化活性,并且抗氧化活性強(qiáng)弱與其黃酮含量、種類、結(jié)構(gòu)有關(guān)[25]。

表2 萃取物黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性分析

3 結(jié)論

本文對金花葵花黃酮乙醇提取物進(jìn)行分級(jí)萃取,而后對各萃取物的清除DPPH自由基能力、清除羥基自由基能力、還原能力、清除超氧陰離子能力和油脂抗氧化能力進(jìn)行測定,研究金花葵花黃酮不同極性溶劑萃取物的體外抗氧化能力。研究表明,金花葵花黃酮得到較好地分離(11.5%～48.3%),其中乙酸乙酯相和正丁醇相萃取物中黃酮含量顯著高于其它相(p<0.05),且具有較好的抗氧化能力。在0.20～1.00 mg/mL的萃取物質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著質(zhì)量濃度的增加,抗氧化能力相應(yīng)增大。萃取物質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí),乙酸乙酯相和正丁醇相的抗氧化能力接近VC?？寡趸钚詸z測方法之間相關(guān)系數(shù)為0.969～0.995(p<0.01),萃取物中黃酮含量與抗氧化活性之間相關(guān)系數(shù)為0.937～0.980(p<0.05),說明金花葵花黃酮具有較高的體外抗氧化能力。綜上所述,乙酸乙酯和正丁醇的萃取物抗氧化能力較好,可作為分離抗氧化活性物質(zhì)的重點(diǎn),為天然抗氧化劑的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ),同時(shí)為金花葵花的綜合開發(fā)和利用奠定了實(shí)踐基礎(chǔ)。