牛改改,游 剛,*,王 培,宋秋漫,蘇海媚,莫維維,梁櫻蓮

(1.北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院,廣西欽州 535011;2.廣西高校北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點實驗室,北部灣大學(xué),廣西欽州 535011)

方格星蟲(Sipunculusnudus),俗稱“沙蟲”,又叫海人參,在我國沿海區(qū)域分布廣泛,其中以廣西北部灣海域分布量最為豐富[1-2]。方格星蟲味道鮮美,風(fēng)味獨特,且具有較高的食用與藥用價值[3-4],廣受消費者喜愛。目前方格星蟲加工產(chǎn)品主要為凍制品與干制品,而相關(guān)的一些罐頭制品、調(diào)味料等加工品比較少見。美拉德(Maillard)反應(yīng)又稱“非酶棕色化反應(yīng)”,是一種羰氨縮合的非酶褐變反應(yīng),廣泛應(yīng)用于食品的加工過程[5]。Maillard反應(yīng)會產(chǎn)生許多香氣化合物與呈色物質(zhì)[6],從而賦予產(chǎn)品特殊的色澤與風(fēng)味,已廣泛應(yīng)用于蝦副產(chǎn)物[7]、鮑魚蒸煮液[8]、貽貝煮汁[9]、牡蠣酶解液[10]、魚蛋白[11]等水產(chǎn)品水解液風(fēng)味的改善,而關(guān)于方格星蟲酶解液Maillard反應(yīng)工藝優(yōu)化的研究未見報道。

本實驗以方格星蟲酶解液(Sipunculusnudusenzymatic hydrolysate,SEH)為原料進行Maillard反應(yīng),以褐變度和感官評分為評價指標(biāo),在單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過正交試驗優(yōu)化Maillard反應(yīng)工藝條件,得到方格星蟲酶解液美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products ofsipunculusnudusenzymatic hydrolysate,MRPs-SEH);另對SEH與MRPs-SEH的色澤參數(shù)、游離氨基酸與總氨基酸含量、熒光強度進行對比分析,研究SEH Maillard反應(yīng)前后理化特性的變化,為方格星蟲調(diào)味料的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮方格星蟲(體長(10±1.6) cm,體寬(1±0.3) cm,體質(zhì)量(9±1.8) g) 采自欽州市茅尾海海域;胰蛋白酶(4000 U/g) 南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司;D-半乳糖 食品級，浙江一諾生物科技有限公司;無水葡萄糖 食品級，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;麥芽糖 食品級，上海潤捷化學(xué)試劑有限公司;α-乳糖 食品級，西隴化工股份有限公司;蔗糖 食品級，天津市華東試劑廠;鹽酸、三氯乙酸等 均為分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

分光測色計CM-3600d 日本柯尼卡·美能達公司;L-8900 氨基酸分析儀 日本Hitachi公司;RF-5301PC熒光分光光度計 日本島津公司;DS-1高速組織搗碎機 上海標(biāo)本模型廠;DB-4不銹鋼電熱板 常州國華電器有限公司;840-210800紫外-可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司;H1850臺式離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;ST5000 pH計 奧豪斯儀器(常州)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 SEH的制備 參考文獻[10],并稍作修改。將新鮮方格星蟲去除內(nèi)臟,清洗后瀝干,以1∶5 (w/v)的比例加水后,用組織搗碎機在10000 r/min下進行破碎打漿10 min,按底物質(zhì)量加入8%(w/w)的胰蛋白酶,調(diào)整pH7.5,53 ℃酶解2 h后于90 ℃滅酶10 min,酶解產(chǎn)物9000 r/min離心20 min,所得上清液即為SEH。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 糖種類的選澤 取一定體積的SEH,分別添加3%(w/v)的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖和蔗糖,攪拌使其溶解,調(diào)節(jié)體系的pH為8.0,于120 ℃熱反應(yīng)60 min后冷卻,8000 r/min離心10 min,取上清液進行褐變度測定與感官評定,每組實驗重復(fù)三次,結(jié)果取平均值。

1.2.2.2 糖添加量的影響 取一定體積的SEH,分別添加1%、2%、3%、4%和5%(w/v)的半乳糖,攪拌使其溶解,調(diào)節(jié)體系的pH為8.0,于120 ℃熱反應(yīng)60 min后冷卻,8000 r/min離心10 min,取上清液進行褐變度測定與感官評定,每組實驗重復(fù)三次,結(jié)果取平均值。

1.2.2.3 pH的影響 取一定體積的SEH,添加3%(w/v)的半乳糖,攪拌使其溶解,分別調(diào)節(jié)體系的pH為6.0、7.0、8.0、9.0和10.0,于120 ℃熱反應(yīng)60 min后冷卻,8000 r/min離心10 min,取上清液進行褐變度測定與感官評定,每組實驗重復(fù)三次,結(jié)果取平均值。

1.2.2.4 反應(yīng)溫度的影響 取一定體積的SEH,添加3%(w/v)的半乳糖,攪拌使其溶解,調(diào)節(jié)體系的pH為8.0,分別于100、110、120、130和140 ℃下熱反應(yīng)60 min。冷卻后,8000 r/min離心10 min,取上清液進行褐變度測定與感官評定,每組實驗重復(fù)三次,結(jié)果取平均值。

1.2.2.5 反應(yīng)時間的影響 取一定體積的SEH,添加3%(w/v)的半乳糖,攪拌使其溶解,調(diào)節(jié)體系的pH為8.0,于120 ℃溫度下分別反應(yīng)30、45、60、75、90 min。冷卻后,8000 r/min離心10 min,取上清液進行褐變度測定與感官評定,每組實驗重復(fù)三次,結(jié)果取平均值。

1.2.3 正交試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上,以感官評分為評價指標(biāo),以糖添加量、pH、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間四個因素進行四因素三水平L9(34)的正交優(yōu)化試驗,各因素水平設(shè)計如表1所示。

表1 正交試驗的因素水平表

1.2.4 感官評定 通過感官評定對MRPs-SEH進行風(fēng)味評價。請經(jīng)過培訓(xùn)且具有感官評定經(jīng)驗的10名(5男5女)食品專業(yè)本科生組成感官評價小組,進行感官評定。參照文獻[9-10]制定感官評價標(biāo)準(zhǔn),見表2。

表2 感官評價標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 褐變度的測定 將MRPs-SEH稀釋10倍,在420 nm處測定吸光值,以其表示Maillard反應(yīng)的褐變程度[12]。

1.2.6 反應(yīng)前后色澤的測定 參考Huang等[13]的方法。分光測色計開機預(yù)熱30 min后,分別用標(biāo)準(zhǔn)黑板和標(biāo)準(zhǔn)白板進行校準(zhǔn),取5 mL樣品溶液于玻璃皿中,測定SEH與MRPs-SEH(最佳Maillard反應(yīng)條件下制備)顏色參數(shù)L*(亮度)、a*(紅綠值)、b*(黃藍值)、C*(色度)和ΔE*(總色差)的變化,其中C*=(a*2+b*2)1/2,ΔE*=(ΔL*2+Δa*2+Δb*2)1/2;采用去離子水作為參比對照。

1.2.7 反應(yīng)前后總氨基酸和游離氨基酸含量的測定 總氨基酸(Total amino acid,TAA)含量的測定參考Liu等[14-15]的方法,并稍作修改。分別取1 mL SEH與MRPs-SEH(最佳Maillard反應(yīng)條件下制備)于水解管中,加入8 mL HCl(6 mol/L)于110 ℃水解22 h后冷卻至室溫。將消解液定容至50 mL后,取1 mL于50 mL燒杯中,60 ℃水浴趕酸完全后定容至10 mL,過0.22 μm膜后采用自動氨基酸分析儀測定。Maillard反應(yīng)前后TAA含量的變化率X1計算方法如下:X1=(MRPs-SEH中TAA含量-SEH中TAA含量)/(SEH中TAA含量)。

游離氨基酸(Free amino acid,FAA)含量的測定參考Liu等[14-15]的方法,并稍作修改。分別取10 mL SEH與MRPs-SEH(最佳Maillard反應(yīng)條件下制備)于100 mL燒杯中,加入10 mL 10%的三氯乙酸沉淀2 h,8000 r/min離心15 min后取2 mL上清液,過0.22 μm膜,采用自動氨基酸分析儀測定。Maillard反應(yīng)前后FAA含量的變化率X2計算方法如下:X2=(MRPs-SEH中FAA含量-SEH中FAA含量)/(SEH中FAA含量)。

1.2.8 反應(yīng)前后內(nèi)源性熒光發(fā)射光譜掃描 參考Huang等[13]的方法。采用熒光分光光度計掃描SEH與MRPs-SEH(最佳Maillard反應(yīng)條件下制備)內(nèi)源性熒光強度的變化。掃描參數(shù)設(shè)定為:激發(fā)波長298 nm,發(fā)射光譜掃描范圍309～450 nm,狹縫寬度5 nm,掃描溫度25 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 糖種類的選擇

糖的種類是影響Maillard反應(yīng)強度的關(guān)鍵性因素[16]。由圖1可知,蔗糖、麥芽糖和乳糖反應(yīng)體系的褐變程度與感官評分均小于葡萄糖體系和半乳糖體系,說明雙糖與SEH發(fā)生Maillard反應(yīng)的活性較弱,產(chǎn)生的焦糖風(fēng)味成分較少,這與Benjakul等[17]的研究結(jié)果Maillard反應(yīng)速度己醛糖>二糖一致。半乳糖與SEH反應(yīng)體系的褐變度和感官評分均顯著大于葡萄糖反應(yīng)體系(p<0.05),馬振龍等[18]的研究結(jié)果顯示豬骨蛋白水解物-半乳糖反應(yīng)體系的褐變程度大于葡萄糖體系,與本研究結(jié)果一致;牛改改等[19]發(fā)現(xiàn)半乳糖-牡蠣蛋白肽Maillard反應(yīng)產(chǎn)物的功能特性與抗氧化性均顯著大于葡萄糖體系,說明半乳糖較葡萄糖具有更強的Maillard反應(yīng)活性,支持了本研究結(jié)果。故后續(xù)實驗選用半乳糖作為Maillard反應(yīng)的糖基供體。

圖1 糖種類對Maillard反應(yīng)褐變度與感官評分的影響

2.2 糖添加量的影響

Maillard反應(yīng)程度會隨著還原糖添加量的增加而增加[20]。糖添加量對MRPs-SEH褐變度與感官評分的影響如圖2所示。隨著半乳糖添加量的增加,MRPs-SEH的褐變度與感官評分不斷增加,說明Maillard反應(yīng)程度在持續(xù)加深,褐色物質(zhì)不斷生成。當(dāng)糖添加量達到3%后,褐變程度趨于平緩,相對穩(wěn)定,并在4%時達到最大。感官評分在糖添加量4%時達到最大值,隨后呈下降趨勢;這是由于增大半乳糖添加量加快了Maillard反應(yīng)速度,豐富了揮發(fā)性物質(zhì)種類,增強了MRPs-SEH的整體風(fēng)味[21],但糖添加量過大時,會發(fā)生焦糖化反應(yīng),使反應(yīng)體系色澤加深的同時產(chǎn)生焦苦味,感官評分下降[22]。因此,半乳糖的適宜添加量為4%。

圖2 糖添加量對Maillard反應(yīng)褐變度與感官評分的影響

2.3 pH的影響

圖3 pH對Maillard反應(yīng)褐變度與感官評分的影響

2.4 反應(yīng)溫度的影響

由圖4可知,隨著反應(yīng)溫度的升高,褐變程度逐漸加深,表明高溫可促進Maillard反應(yīng)。相關(guān)文獻研究結(jié)果[15,25]表明，在一定反應(yīng)時間內(nèi),溫度越高,Maillard反應(yīng)速度越快,每升高10 ℃,反應(yīng)速度增加3～5倍。MRPs-SEH的感官評分隨著溫度的升高先增加后減小,在130 ℃時達到最大值,這是由于反應(yīng)溫度過高時,產(chǎn)物會發(fā)生碳化,產(chǎn)生較強烈的焦糊味,因此,適宜的反應(yīng)溫度為130 ℃。

圖4 反應(yīng)溫度對Maillard反應(yīng)褐變度與感官評分的影響

2.5 反應(yīng)時間的影響

從圖5可以看出,隨著反應(yīng)時間的延長,褐變度先快速上升后趨于平緩,這主要是因為在反應(yīng)初期褐色物質(zhì)生成相對較少,吸光值較低,隨反應(yīng)進行,褐色產(chǎn)物累積,Maillard反應(yīng)逐漸趨向完全[26]。反應(yīng)時間在30～60 min時,MRPs-SEH風(fēng)味隨著反應(yīng)的充分進行而濃郁,當(dāng)反應(yīng)時間超過60 min時,焦糊味和硫味越來越濃,掩蓋了方格星蟲原有的鮮味,感官評分下降,這可能與過量生成的類黑精色素被環(huán)化產(chǎn)生一系列吡嗪、吡啶等含氮雜環(huán)化合物有關(guān)[27]。故反應(yīng)時間選擇60 min。

圖5 反應(yīng)時間對Maillard反應(yīng)褐變度與感官評分的影響

2.6 正交試驗

感官評價可直接反映Maillard反應(yīng)對SEH風(fēng)味的改善情況,而褐變度反映的是Maillard反應(yīng)的程度,褐變度過大時,MRPs-SEH風(fēng)味反而會變差,故正交試驗以感官評價為指標(biāo),優(yōu)化Maillard反應(yīng)條件,結(jié)果見表3。從表3可知影響感官評分結(jié)果的因素主次順序為D(反應(yīng)時間)>C(反應(yīng)溫度)>B(pH)>A(糖添加量),最優(yōu)組合是A2B2C2D2,即4%的半乳糖添加量、pH9.0、130 ℃的反應(yīng)溫度和60 min的反應(yīng)時間。由于正交實驗中沒有A2B2C2D2組合,故在該條件下進行3次驗證實驗,感官評定結(jié)果為(13.77±0.47)分,高于正交實驗的任一組,說明該組合為MRPs-SEH風(fēng)味改善的最佳條件。

表3 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

2.7 反應(yīng)前后色澤參數(shù)的變化

SEH與MRPs-SEH的顏色參數(shù)如表4所示,由表4可知,Maillard反應(yīng)前后顏色差異顯著(p<0.05)。MRPs-SEH較小的L*與較大的ΔE*說明Maillard反應(yīng)使酶解液亮度變暗,顏色加深。a*、b*和C*增大,表明MRPs-SEH顏色更加偏紅與偏黃,色澤更加飽滿;這是因為Maillard反應(yīng)的終產(chǎn)物褐色素類黑精使體系顏色加深。Jonathan等[28]的研究結(jié)果表明,Maillard反應(yīng)產(chǎn)物L(fēng)*減小,a*與b*增大,顏色加深,與本研究結(jié)果一致。

表4 Maillard反應(yīng)前后顏色參數(shù)的變化

2.8 反應(yīng)前后游離氨基酸和總氨基酸含量變化

在Maillard反應(yīng)過程中,一方面,FAA或肽中的氨基與糖分子結(jié)構(gòu)中的羰基共價連接形成糖蛋白,另一方面,大分子肽分解成氨基酸和小分子肽,說明在反應(yīng)進程中FAA含量變化是一個動態(tài)過程[15,29],因此Maillard反應(yīng)的程度需由TAA含量表示。Maillard反應(yīng)前后TAA含量變化如表5所示。由表5可知,Maillard反應(yīng)產(chǎn)物中TAA含量較SEH顯著降低(p<0.05),其中SEH中TAA含量為703.987 mg/g,MRPs-SEH中TAA含量較SEH降低60.27%,這是由于Maillard反應(yīng)消耗的氨基酸大于肽分解生成的氨基酸,且Strecker降解、熱分解、以及糖和氨基酸或肽結(jié)合形成Maillard產(chǎn)物使得TAA含量降低,與Liu等[14]的研究結(jié)果一致。Tyr與Met含量較SEH分別減少73.84%、72.98%,說明這兩種氨基酸參與Maillard反應(yīng)的程度較大,而His(含量降低44.85%)參與Maillard反應(yīng)的活性相對較低。

表5 Maillard反應(yīng)前后總氨基酸含量變化

Maillard反應(yīng)前后FAA含量變化結(jié)果見表6。由表6可知,MRPs-SEH中FAA組成與SEH相同,除色氨酸被酸處理破壞未檢出外,均檢測出17種常見的氨基酸。各氨基酸含量和TFAA含量均有不同程度減少,MRPs-SEH中TFAA含量為124.682 mg/g,較SEH降低51.12%。MRPs-SEH中的苦味氨基酸Val、Leu、Ile、Met、Phe、Ser、Arg、His與鮮味氨基酸Asp、Glu、Gly、Ala含量較SEH均降低,而TUAA/TFAA與TBAA/TFAA則大于SEH,其中TUAA/TFAA較SEH增加了8.26%,大于TBAA/TFAA的增加率(1.90%),表明Maillard反應(yīng)減少了SEH中的苦味,同時使鮮味氨基酸在總游離氨基酸中的比例增加。

表6 Maillard反應(yīng)前后游離氨基酸含量變化

2.9 反應(yīng)前后內(nèi)源性熒光強度變化

Maillard反應(yīng)前后酶解肽結(jié)構(gòu)的變化可由內(nèi)源性熒光強度變化來評價[30]。圖6顯示了SEH和MRPs-SEH的內(nèi)源性熒光光譜圖。當(dāng)激發(fā)波長在298 nm時,SEH的最大熒光強度峰位于368 nm。SEH與半乳糖發(fā)生Maillard反應(yīng)后,產(chǎn)物的熒光強度明顯降低,熒光吸收峰幾乎消失,這與SEH和半乳糖發(fā)生Maillard反應(yīng)形成了屏蔽效應(yīng)有關(guān)[13,31]。Huang等[13]和Corzo-Martínez等[31]分別發(fā)現(xiàn)卵清蛋白和β-乳球蛋白與還原糖發(fā)生Maillard反應(yīng)降低了產(chǎn)物的熒光強度,引起蛋白質(zhì)圍繞色氨酸殘基構(gòu)象的變化;Corzo-Martínez等[31]進一步比較了不同溫度(40、50 ℃)下Maillard反應(yīng)產(chǎn)物最大熒光發(fā)射波長變化,發(fā)現(xiàn)40 ℃條件下還原糖影響β-乳球蛋白側(cè)鏈結(jié)構(gòu),僅引起β-乳球蛋白三級結(jié)構(gòu)變化而沒有破壞原有結(jié)構(gòu),在50 ℃條件下β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)受還原糖影響較大,但未能確定是幾級結(jié)構(gòu)變化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Maillard反應(yīng)降低了產(chǎn)物熒光強度,引起SEH中多肽的結(jié)構(gòu)變化,但尚不能確定是幾級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,后續(xù)實驗將進一步利用圓二色譜和熒光光譜法探討其結(jié)構(gòu)變化。

圖6 Maillard反應(yīng)前后內(nèi)源性熒光光譜變化

3 結(jié)論

方格星蟲酶解液Maillard反應(yīng)的最佳工藝條件為:半乳糖添加量4%、pH9.0、反應(yīng)溫度130 ℃和反應(yīng)時間60 min,在該條件下感官評定達到13.77分。與SEH相比,MRPs-SEH的L*減小,a*、b*、C*和ΔE*均增大,Maillard反應(yīng)使得酶解液亮度變暗,色澤加深且更加飽滿。MRPs-SEH中的17種氨基酸含量較SEH均顯著降低(p<0.05),其中Tyr和Met參與Maillard反應(yīng)的程度較大,分別減少73.84%、72.98%,而His(含量減少44.85%)參與Maillard反應(yīng)活性相對較低;另外,MRPs-SEH中鮮味氨基酸在總游離氨基酸中的比例較SEH增加8.26%。Maillard反應(yīng)引起SEH肽鏈結(jié)構(gòu)變化。后續(xù)實驗將進一步采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用定性定量分析SEH與MRPs-SEH的揮發(fā)性風(fēng)味成分變化,分析并找出主要風(fēng)味貢獻成分,為研發(fā)新型方格星蟲調(diào)味品提供理論參考。

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