劉小慧，賀曼曼，張偉，李靜，牛廣旭，馮運(yùn)章

(邯鄲市中心醫(yī)院,河北邯鄲 056001)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤[1,2]。新輔助化療、轉(zhuǎn)化治療或術(shù)后輔助化療均能改善部分患者總體生存期[3]。奧沙利鉑以DNA為作用靶點(diǎn)，是目前臨床胃癌化療的一線藥物，但其耐藥是影響胃癌患者預(yù)后的重要因素[4]?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)是一類炎性趨化因子，與其受體 CXCR-4廣泛地表達(dá)于多種細(xì)胞和組織中，參與免疫、循環(huán)系及中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等重要生理過程，同時(shí)還參與腫瘤細(xì)胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等病理過程[5，6]。目前有研究[6～8]報(bào)道，SDF-1高表達(dá)與大腸癌細(xì)胞、白血病、肺癌細(xì)胞的化療耐藥密切相關(guān)。但關(guān)于SDF-1對胃癌細(xì)胞耐藥的影響鮮有報(bào)道。胃癌耐藥機(jī)制涉及多方面，而上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[9]及細(xì)胞自噬[4]均是耐藥的重要機(jī)制。2018年2～7月，我們觀察了SDF-1過表達(dá)對人胃癌細(xì)胞株SGC7901增殖、耐藥的影響，并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 人胃癌細(xì)胞株SGC7901由河北省人民醫(yī)院科研中心保存并惠贈(zèng)，常規(guī)使用10%胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于5% CO2、37 ℃恒培箱培養(yǎng),常規(guī)換液傳代。轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine-2000、TRIzol Reagent(美國 Invitrogen 公司)；cDNA 合成試劑盒(美國Fermentas公司)；MTT試劑盒(南京KGA公司)。實(shí)驗(yàn)相關(guān)PCR引物由上海生物工程有限公司合成；真核表達(dá)載體pcDNA3.1-SDF-1由上海吉瑪制藥有限公司合成并測序驗(yàn)證。

1.2 SGC7901 細(xì)胞分組及pcDNA3.1-SDF-1轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期 SGC7901 細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組、空白對照組， 按1×105的密度接種于6孔板培養(yǎng)，融合度達(dá)約80%時(shí)實(shí)驗(yàn)組、陰性對照組分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SDF-1質(zhì)粒、pcDNA3.1質(zhì)粒(空白質(zhì)粒)，將稀釋質(zhì)粒與Lipofectamine 2000混合均勻加入培養(yǎng)孔，室溫孵育20 min，所有操作均嚴(yán)格按說明書操作?？瞻讓φ战M不做任何處理。

1.3 三組細(xì)胞 SDF-1 mRNA及蛋白檢測 ①采用RT-PCR法檢測三組細(xì)胞SDF-1 mRNA。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h時(shí)，按2×107收集對數(shù)生長期三組細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，按試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，配置25 μL 反應(yīng)體系擴(kuò)增目的基因。引物序列為SDF-1(270 bp)上游引物5′-GGGTACC-ATGCAGCTTGTTG-3′；下游引物5′-GAGATCTCTAG-GCGCCCTGG-3′。GAPDH(258 bp)上游引物5′- AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′；下游引物5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。RT-PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min→94 ℃變性30 s→(SDF-1，55 ℃；GAPDH，58 ℃)退火60 s→72 ℃延伸1 min,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，以2-ΔΔCt代表CG5844基因的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。②采用Western bloting法檢測細(xì)胞SDF-1蛋白。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h時(shí)分別收集各組2×107個(gè)細(xì)胞提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，50 μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)PVDF膜。洗膜后用紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描，以GAPDH作為內(nèi)參測算SDF-1蛋白相對表達(dá)強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

1.4 三組細(xì)胞增殖情況觀察 采用MTT法。 取對數(shù)生長期三組細(xì)胞接種于96孔板，按5×103/mL調(diào)整每孔細(xì)胞密度，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h時(shí)，加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL作用4 h棄去培養(yǎng)基，加入150 μL的DMSO搖勻，酶標(biāo)儀測各孔570 nm波長光密度OD值,以O(shè)D值代表各組細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

1.5 三組細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥性觀察 MTT法檢測細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥性。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h時(shí)各取三組對數(shù)生長期細(xì)胞約2×104個(gè)，培養(yǎng)于96孔板，培養(yǎng)24 h后分別按照奧沙利鉑(1、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL)濃度梯度加藥，每種濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h時(shí)每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h，棄上清, 加150 μL 的DMSO搖勻，酶標(biāo)儀測各孔570 nm波長光密度OD值，測算各組細(xì)胞增殖抑制率，SPSS軟件進(jìn)一步測算奧沙利鉑對各組細(xì)胞的IC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

1.6 三組細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞儀。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h時(shí)分別取三組對數(shù)生長期細(xì)胞，加入10 μg/mL奧沙利鉑處理細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞，采用Annexin V-FITC/PI雙染法，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL的 PI混合均勻，所有操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。采用流式細(xì)胞儀測算三組凋亡細(xì)胞百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。

1.7 三組細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)型鈣黏蛋白(N-cadherin)及皮型蛋白(Vimentin)檢測 采用Western blotting法。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h時(shí)取三組細(xì)胞，所有操作同“1.3”。使用Image J軟件對熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量分析,以GAPDH作為內(nèi)參測算E-cadherin、N-cadherin及Vimentin蛋白相對表達(dá)強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。將空白對照組及實(shí)驗(yàn)組SGC7901細(xì)胞收集接種至24孔板，常規(guī)培養(yǎng)，倒置顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.8 三組細(xì)胞微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ(LC3-Ⅱ)、白噬相關(guān)因子(Beclin 1)蛋白檢測 采用Western bloting法。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h時(shí)取三組細(xì)胞，具體步驟同“1.3”。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取平均值。 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬現(xiàn)象：用奧沙利鉑(10 μg/mL)分別處理空白對照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞24 h后，收集1×106個(gè)細(xì)胞，2.5%戊二醛及1%鋨酸順序固定2h，按丙酮梯度脫水，然后包埋、固定、制超薄切片，用5%醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察細(xì)胞自噬現(xiàn)象。

2 結(jié)果

2.1 三組細(xì)胞SDF-1 mRNA及蛋白相對表達(dá)量比較 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組細(xì)胞SDF-1 mRNA相對表達(dá)量分別為2.139±0.170、0.753±0.065、0.764±0.064，與空白對照組、陰性對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞SDF-1 mRNA相對表達(dá)量升高(P均<0.05)；培養(yǎng)48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組細(xì)胞SDF-1 蛋白相對表達(dá)量分別為3.557±0.234、1.255±0.081、1.309±0.094，與空白對照組、陰性對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞SDF-1 mRNA相對表達(dá)量升高(P均<0.05)。

2.2 三組細(xì)胞OD值比較 培養(yǎng)24、48、72 、96 h時(shí)三組細(xì)胞OD值比較見表1。與空白對照組、陰性對照組比較，培養(yǎng)24、48、72、96 h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值均升高(P均<0.05)。

表1 培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)三組細(xì)胞OD值比較

2.3 奧沙利鉑對三組細(xì)胞的IC50值比較 不同濃度奧沙利鉑作用下三組細(xì)胞增殖抑制率比較見表2。 隨著奧沙利鉑濃度的遞增，三組細(xì)胞的增殖抑制率均呈遞增趨勢(P均<0.05)。相同奧沙利鉑濃度下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率均明顯低于空白及陰性對照組(P均<0.05)。奧沙利鉑對實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組細(xì)胞的IC50值分別為28.039±3.011、10.403±1.253、10.612±1.044，與空白對照組、陰性對照組比較，奧沙利鉑對實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的IC50值升高(P均<0.05)。

2.4 三組細(xì)胞凋亡率比較 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組細(xì)胞凋亡率分別為39.10%±2.26%、53.90%±3.19%、51.30%±3.37%，與空白對照組、陰性對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率降低(P均<0.05)。

2.5 三組細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin及Vimentin相對表達(dá)量比較 倒置顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化，空白對照組細(xì)胞聚集生長，細(xì)胞間連接相對緊密，細(xì)胞多呈圓形、橢圓形或扁梭形。而隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞聚集或成團(tuán)生長現(xiàn)象逐漸消失，細(xì)胞呈現(xiàn)分散生長趨勢，形態(tài)逐漸不規(guī)則，細(xì)胞變細(xì)變長，狀如長梭形、長條形、三角形等，部分細(xì)胞可見細(xì)長偽足出現(xiàn)。

表2 不同濃度奧沙利鉑作用下三組細(xì)胞增殖抑制率比較

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組細(xì)胞E-cadhein蛋白相對表達(dá)量分別為0.351±0.022、0.482±0.039、0.473±0.035，與空白對照組、陰性對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞E-cadhein蛋白相對表達(dá)量降低(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組細(xì)胞N-cadhein蛋白相對表達(dá)量分別為0.555±0.032、0.314±0.026、0.327±0.025，與空白對照組、陰性對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞N-cadhein蛋白相對表達(dá)量升高(P均<0.05)；實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組細(xì)胞 Vimentin蛋白表達(dá)量相對表達(dá)量分別為0.842±0.064、0.621±0.054、0.619±0.051，與空白對照組、陰性對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Vimentin蛋白表達(dá)量相對表達(dá)量升高(P均<0.05)。

2.6 三組細(xì)胞LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白相對表達(dá)量比較 奧沙利鉑作用24 h后透射電鏡下觀察，空白對照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均觀察到細(xì)胞自噬、自噬性死亡現(xiàn)象，但與空白對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞自噬現(xiàn)象更更多，自噬溶酶體數(shù)目也明顯增多，同時(shí)也能夠觀察到自噬溶酶體內(nèi)容物降解后遺留的多量空泡、髓樣體。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組、空白對照組、陰性對照組細(xì)胞 LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量相對表達(dá)量分別為0.720±0.052、0.424±0.029、0.615±0.049，Beclin 1蛋白表達(dá)量相對表達(dá)量分別為1.114±0.126、0.433±0.031、0.633±0.055，與空白對照組、陰性對照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白表達(dá)量相對表達(dá)量升高(P均<0.05)。

3 討論

SDF-1基因位于人10號(hào)染色體長臂上，全長約267 bp，編碼89個(gè)氨基酸殘基[10]。SDF-1與其受體CXCR4、CXCR7在多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥均密切相關(guān)[6,10]。目前許多研究已證實(shí)SDF-1在胃癌細(xì)胞[10]、宮頸癌細(xì)胞[11]、惡性顱咽管瘤[12]、甲狀腺乳頭狀癌[13]等諸多腫瘤的增殖侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，而其機(jī)制與PI3K/Akt[10，12]、NF-κB[13]信號(hào)通路激活有關(guān)。本研究成功建立SDF-1過表達(dá)胃癌細(xì)胞，MTT結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖活力明顯高于空白及陰性對照組，表明SDF過表達(dá)能夠明顯促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。

腫瘤多藥耐藥是化療主要障礙,如何克服腫瘤耐藥是全球研究熱點(diǎn)。研究[7]報(bào)道SDF-1能夠通過誘導(dǎo)ERK磷酸化,上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xL表達(dá)進(jìn)而降低ALL細(xì)胞株SUP-B15對阿霉素的敏感性。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞通過分泌SDF-1激活CXCR4,從而提高Bcl-xL的表達(dá)來增強(qiáng)肺癌A549細(xì)胞對順鉑的耐藥性[8]。本研究結(jié)果表明SDF-1過表達(dá)能夠明顯增加胃癌SGC7901細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥性，其耐藥倍數(shù)較空白及陰性對照組分別增加約2.7、2.6倍。

EMT是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的病理過程，這一過程涉及上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)以及間皮標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin表達(dá)上調(diào)[14]。目前研究[9]已表明EMT不僅參與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程，也是許多腫瘤細(xì)胞耐藥的一種新的重要機(jī)制。腫瘤細(xì)胞在產(chǎn)生獲得性耐藥的過程中有間質(zhì)化趨勢，而具有間質(zhì)分化狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞也常表現(xiàn)為原發(fā)性耐藥的特點(diǎn)。研究[6，13,15]表明,SDF-1對腫瘤細(xì)胞EMT具有正向促進(jìn)作用。因此本實(shí)驗(yàn)推測SDF-1介導(dǎo)耐藥可能與EMT有關(guān)。為驗(yàn)證上述推論，本實(shí)驗(yàn)對EMT相關(guān)重要蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果表明與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)而N-cadherin、Vimentin表達(dá)上調(diào)。對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的動(dòng)態(tài)觀察也發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在生長過程中形態(tài)逐漸變得不規(guī)則，細(xì)胞分散生長，變細(xì)變長，細(xì)胞形態(tài)多見長梭形、長條形、三角形，部分細(xì)胞可見細(xì)長偽足形成。文俏程等[16]等認(rèn)為細(xì)胞上述形態(tài)改變即屬于EMT現(xiàn)象。由此本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為SDF-1有可能通過促進(jìn)EMT進(jìn)程介導(dǎo)胃癌細(xì)胞對奧沙利鉑耐藥。

自噬是真核生物廣泛存在的高度保守代謝調(diào)控過程，細(xì)胞通過溶酶體降解自身受損細(xì)胞器和大分子物質(zhì)以維持細(xì)胞代謝平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[17]。但細(xì)胞自噬是一把雙刃劍：一方面機(jī)體出現(xiàn)感染、缺氧等應(yīng)激刺激時(shí)，自噬能保護(hù)細(xì)胞存活；另一方面如果應(yīng)激持續(xù)時(shí)間過久，則會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞自噬性死亡[18]。研究表明SDF-1/CXCR4軸能夠通過上調(diào)miR-125b的表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞自噬從而介導(dǎo)大腸癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶耐藥[6]，抑制SDF-1表達(dá)能夠降低宮頸癌Hela細(xì)胞對放療的抵抗性，誘導(dǎo)其凋亡[19]。由此可見在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中自噬是腫瘤細(xì)胞對周圍惡劣微環(huán)境的一種適應(yīng)性變化，能夠保護(hù)腫瘤細(xì)胞抵抗化療、放療、靶向治療等誘導(dǎo)的凋亡，是腫瘤發(fā)生耐藥的機(jī)制之一[4]。為驗(yàn)證上述推論，本研究結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯低于空白及陰性對照組，透射電鏡下觀察也發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞自噬溶酶體明顯高于空白對照組，這意味著SDF-1過表達(dá)可能通過誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞保護(hù)性自噬進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，從而參與胃癌細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥性產(chǎn)生。目前對自噬現(xiàn)象的觀察主要通過透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)。LC3是自噬標(biāo)志物，存在兩種形式：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，自噬發(fā)生時(shí)LC3-Ⅰ甘氨酸殘基能夠與自噬泡內(nèi)膜磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ，LC3-Ⅱ含量可反映細(xì)胞自噬活性[4,18,20]。Beclin 1蛋白也是自噬必需的分子，與相應(yīng)受體PI3K3C 結(jié)合成Beclin 1/PI3K3C復(fù)合物激活細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)通路，參與細(xì)胞自噬過程[20]。本研究實(shí)驗(yàn)組LC3-Ⅱ、Beclin 1蛋白表達(dá)明顯增加，證實(shí)SDF-1過表達(dá)誘導(dǎo)了胃癌細(xì)胞自噬以抵御化療損傷。因此,SDF-1過表達(dá)可能部分通過增加胃癌細(xì)胞自噬、抑制其凋亡進(jìn)而參與對奧沙利鉑的獲得性耐藥。研究[21]發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬，而SDF-1能夠?qū)I3K/Akt通路進(jìn)行調(diào)控。

綜上所述，SDF-1過表達(dá)能夠促進(jìn)SGC7901細(xì)胞的增殖，可顯著提高SGC7901細(xì)胞對奧沙利鉑的耐藥性，其機(jī)制可能與其促進(jìn)EMT進(jìn)程以及誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞自噬增加進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。