苗夢(mèng)媛 劉守勝 趙真真 徐穎譽(yù) 辛永寧 宣世英

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬青島臨床醫(yī)學(xué)院（山東青島266011）；2青島市市立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室（山東青島266071）；3青島大學(xué)（山東青島266071）；4青島市市立醫(yī)院感染科（山東青島266011）

冠心病是影響全球的主要心血管疾病之一，已被證明是發(fā)達(dá)及發(fā)展中國(guó)家死亡的主要病因［1］。遺傳因素在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用［2］。OZAKI 等［3］首次通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒素-α基因位點(diǎn)與心肌梗死有關(guān)。目前為止，GWAS 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了163 個(gè)冠心病遺傳易感基因［4］。進(jìn)一步研究冠心病遺傳易感因素，對(duì)冠心病的早期診斷和預(yù)后具有重要意義。

PNPLA3 屬 于patatin 樣 磷 脂 酶 域（PNPLA）家族，是由481 個(gè)氨基酸組成的脂肪滋養(yǎng)蛋白。PNPLA3 rs738409 位點(diǎn)變異可降低酶的活性，阻止甘油三脂水解，導(dǎo)致甘油三脂的蓄積，從而影響血脂水平［5］。血脂異常與冠心病密切相關(guān)，故推測(cè)PNPLA3 rs738409 基因多態(tài)性很有可能為冠心病潛在的發(fā)病機(jī)制之一。然而國(guó)外關(guān)于PNPLA3基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性研究較少，國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。本文將針對(duì)PNPLA3 rs738409 位點(diǎn)多態(tài)性與青島地區(qū)漢族人群冠心病的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本試驗(yàn)遵循《赫爾辛基宣言》及其附錄的準(zhǔn)則，獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［6］。所有受試者均簽署書面知情同意書。選取2018年7月至12月青島市市立醫(yī)院收入院的199 例冠心病患者為研究對(duì)象。通過(guò)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈造影確診為冠心病，并且由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的介入心臟病學(xué)家進(jìn)行評(píng)估。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)，冠狀動(dòng)脈至少一支主要分支管腔直徑狹窄在50%以上［7］。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他心臟疾??；（2）既往接受靜脈溶栓、冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)的患者。對(duì)照組為同期本院體檢中心健康體檢的無(wú)冠心病的人群，共納入160 例。所有受試者均被排除在糖尿病、嚴(yán)重感染、嚴(yán)重肝腎功能不全、惡性腫瘤及藥物濫用史，相互之間無(wú)親緣關(guān)系。采用問卷調(diào)查法收集受試者的基礎(chǔ)臨床信息。

1.2 標(biāo)本采集 所有受試者均于空腹12 h 后于次日清晨抽取4 mL 正中靜脈血，分兩管置于EDTA抗凝管中，其中一管抗凝血送檢驗(yàn)科，用于丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GGT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、血糖（Glu）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）檢測(cè)；另一管抗凝管置于-80 ℃冰箱中保存，以備DNA 的提取，用于基因型的檢測(cè)。同時(shí)對(duì)受試者性別、年齡、身高等基本信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)（BMI）= 體質(zhì)量（kg）/身高（m）2［8］。本研究未記錄包括運(yùn)動(dòng)和飲食情況在內(nèi)的環(huán)境因素。

1.3 DNA 提取及基因型檢測(cè) 采用血液基因組DNA 提取試劑盒（百泰克生物技術(shù)有限公司，北京）進(jìn)行全血基因組DNA 提取，提取的基因組DNA存放于-20 ℃冰箱備用。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）方法進(jìn)行PNPLA3目的基因的擴(kuò)增，檢測(cè)基因型。PCR 引物由北京博淼生物科技設(shè)計(jì)合成，具體引物序列為：上游引物：5′-ACGTTGGATGCCCCTCTTATCTCTGTTTCG-3′下游引物：5′-ACGTTGGATGCAGTGTCACTTCATTTAGCC-3′。引物濃度均為10 μmol/L，-20 ℃冰箱保存。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋菏紫?4 ℃預(yù)變性30 s，然后進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)?4 ℃變性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s。循環(huán)結(jié)束后保持72 ℃運(yùn)行3 s，后降至4 ℃保存。對(duì)所得到的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化處理，然后進(jìn)行目的序列的單堿基延伸反應(yīng)，對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分型鑒定，檢測(cè)結(jié)果使用TYPER 4.0 軟件獲取原始數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡法則，以確認(rèn)樣本的群體代表性。采用χ2檢驗(yàn)分析兩組間性別、基因型及等位基因頻率的差異性。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的用中位數(shù)（最小值～最大值）表示，兩組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)?；蚨鄳B(tài)性與冠心病發(fā)生的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度以比值比（OR）及其95%置信區(qū)間（95%CI）表示，應(yīng)用非條件Logistic 回歸模型計(jì)算OR及95%CI。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 冠心病組共納入199 例患者，其中男112 例，女87 例；健康對(duì)照組共納入160 例，其中男74 例，女86 例。兩組研究對(duì)象性別比例的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。冠心病組患者的年齡、體質(zhì)量、BMI、Glu、ALT、γ-GGT、ALP 和TBIL水平顯著高于健康對(duì)照組，HDL 水平顯著低于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

2.2 PNPLA3 rs738409 基因型及等位基因的頻率分布 在冠心病組和對(duì)照組均檢出CC、CG、GG3種基因型，兩組rs738409 基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律（冠心病組χ2=0.210，P=0.647，對(duì)照組χ2=0.001，P=0.971），具有群體代表性。兩組間基因型及等位基因的分布頻率的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表2）。非條件Logistic 回歸模型分析顯示：CG 、GG 基因型攜帶者分別與CC 基因型攜帶者相比較，二者差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。CG + CG 攜帶者與CC 攜帶者相比，發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)未增加（OR=1.037，95%CI：0.683～1.575，P=0.865）；調(diào)整年齡、性別、BMI 后，差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（校正OR=1.127，95%CI：0.640～1.986，P=0.678）。G 等位基因的攜帶者對(duì)比C 等位基因攜帶者，所得結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在調(diào)整年齡、性別及BMI 的影響后，結(jié)果仍無(wú)改變（P＞0.05，表3）。

2.3 不同組內(nèi)突變等位基因非攜帶者與攜帶者之間臨床特征的比較 在冠心病組、健康對(duì)照組的各自組內(nèi)比較中，PNPLA3 rs738409 G 等位基因的攜帶者與非攜帶者之間年齡、性別、BMI、Glu、TG、TC、HDL、LDL、ALT、AST、γ-GGT、ALP 及TBIL 指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表4。

表1 冠心病組和對(duì)照組一般臨床資料比較Tab.1 Clinical characteristics of patients with CAD and controls ±s

表1 冠心病組和對(duì)照組一般臨床資料比較Tab.1 Clinical characteristics of patients with CAD and controls ±s

注：BMI，體質(zhì)量指數(shù)；Glu，血糖；TG，甘油三酯；TC，總膽固醇；HDL，高密度脂蛋白；LDL，低密度脂蛋白；ALT，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；AST，天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；γ-GGT，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；ALP，堿性磷酸酶；TBIL，總膽紅素

t/χ2/Z 值15.220 3.575 1.464 2.716 2.568-6.632-1.955 1.475-7.765 1.687-3.654-1.823-4.357-4.078-2.070 P 值＜0.001 0.059 0.144 0.007 0.011＜0.001 0.051 0.141＜0.001 0.093＜0.001 0.068＜0.001＜0.001 0.038指標(biāo)年齡（歲）男/女（例）身高（cm）體質(zhì)量（kg）BMI（kg/m2）Glu（mmol/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL（mmol/L）LDL（mmol/L）ALT（U/L）AST（U/L）γ-GGT（U/L）ALP（U/L）TBIL（μmol/L）冠心病組（n=199）67.35±11.56 112/87 168.49±6.34 69.84±10.58 24.61±3.29 5.24（2.28～18.33）1.36（0.05～6.09）4.57±1.32 1.00（0.35～1.83）2.78±1.08 21.95（5.70～156.66）21.82（10.13～223.90）27.50（9.47～171.78）81.42（28.72～194.44）13.40（2.50～63.90）對(duì)照組（n=160）48.21±12.19 74/86 167.34±8.13 66.61±11.86 23.70±3.39 4.56（2.92～17.08）1.18（0.41～6.67）4.37±1.12 1.28（0.50～3.60）2.62±0.59 18.23（6.49～236.13）20.46（10.94～150.43）19.61（7.52～374.46）69.65（30.70～182.29）12.05（3.90～29.20）

表2 冠心病組和對(duì)照組PNPLA3 rs738409 基因型和等位基因的分布Tab.2 Distributions of the PNPLA3 rs738409 genotype and allele in CAD and control groups 例（%）

3 討論

冠心病是心血管病中首要危險(xiǎn)因素，其發(fā)病率及病死率逐年上升。PNPLA3 是調(diào)節(jié)TG 代謝的重要因子，大量證據(jù)表明TG 與罹患冠心病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，降低TG 水平可降低冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［9］。本研究采用病例對(duì)照的研究方法，對(duì)PNPLA3基因多態(tài)性與冠心病的相關(guān)性進(jìn)行探討。本研究結(jié)果顯示PNPLA3 rs738409 位點(diǎn)多態(tài)性與冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)顯著相關(guān)性，調(diào)整混雜因素后，差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果與此前墨西哥一項(xiàng)針對(duì)PNPLA3 基因多態(tài)性與冠心病相關(guān)性的研究結(jié)果相一致［10］。PETTA 等［11］發(fā)現(xiàn)在攜帶PNPLA3 rs738409 GG 基因型的NAFLD 患者發(fā)生頸動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)增高。另有一項(xiàng)歐洲大數(shù)據(jù)人群研究表明PNPLA3 rs738409 G 等位基因?qū)谛牟∮幸欢ǖ谋Ｗo(hù)作用［12］。該結(jié)論在德國(guó)人群中進(jìn)一步得到證實(shí)，rs738409 G 等位基因與TC、LDL 水平呈負(fù)相關(guān)，與罹患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)亦呈負(fù)相關(guān)［13］。

表3 PNPLA3 rs738409 基因型及等位基因的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)Tab.3 Correlation of PNPLA3 rs738409 genotype and allele with the risk of CAD

既往有研究表明PNPLA3 與ALT 水平顯著相關(guān)，ALT 水平升高，心血管疾病患者病死率更高［14］。然而本研究PNPLA3 rs738409 G 等位基因非攜帶者與攜帶者在冠心病組、健康對(duì)照組的各自組內(nèi)比較中，血脂、肝功能各項(xiàng)指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析其原因可能為，本次研究對(duì)象僅限于青島地區(qū)人群，考慮到不同種族地區(qū)人群的遺傳背景差異較大，后續(xù)研究應(yīng)在更多地區(qū)、更多人群中開展。

綜上所述，目前國(guó)外關(guān)于PNPLA3 rs738409 多態(tài)性與冠心病相關(guān)性的研究整體偏少，且所得結(jié)論不一。本研究為國(guó)內(nèi)關(guān)于PNPLA3 與冠心病相關(guān)性的首次探討，但仍存在一定的不足。地域條件、樣本數(shù)量等條件限制，以及部分確診冠心病患者通過(guò)降脂藥物進(jìn)行臨床干預(yù)，均可能在一定程度上影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性。盡管本研究所得結(jié)論是陰性的，但仍可為后續(xù)的研究提供參考。

表4 PNPLA3 rs738409 G 等位基因非攜帶者與攜帶者的臨床特征比較Tab.4 Analysis of clinical characteristics in PNPLA3 rs738409 G allele carriers and non-carriers of the study population x±s