王超鵬 蔣麗君 陳富強(qiáng) 周美娟

南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院放射醫(yī)學(xué)系，廣東省熱帶病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州510515）

日光中的紫外線，尤其是中波紫外線（ultraviolet radiation b，UVB），是造成人體表皮細(xì)胞損傷最常見(jiàn)的環(huán)境因素之一。占表皮細(xì)胞90%的角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚表皮的重要組成部分，同時(shí)也是UVB的主要靶細(xì)胞［1］。UVB 可通過(guò)氧化應(yīng)激，DNA 損傷等引起輻射損傷［2-3］，甚至誘發(fā)皮膚癌［4］。

自噬，又稱“自食”，是機(jī)體細(xì)胞在生長(zhǎng)因子或營(yíng)養(yǎng)素缺乏、缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等有害刺激下所發(fā)生的自穩(wěn)過(guò)程，是真核生物中進(jìn)化保守的對(duì)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)、降解和重新利用的過(guò)程［5］。生理情況下，細(xì)胞自噬性降解可維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)，但外界因素誘導(dǎo)的自噬失調(diào)可能與腫瘤、感染、神經(jīng)退行性病變等疾病相關(guān)。既往研究中，UVB 對(duì)皮膚細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)研究較為透徹，但UVB對(duì)皮膚細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)研究較少。因此，闡明UVB 和自噬在皮膚慢性損傷中的作用及其機(jī)制尤為重要。本研究以HaCaT 細(xì)胞為研究對(duì)象，基于預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用半數(shù)紅斑劑量，即30 mJ/cm2UVB 照射為處理因素，深入探討UVB 對(duì)HaCaT 細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)效應(yīng)及自噬與凋亡的相互作用關(guān)系，以期為UVB 的輻射損傷治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 HaCaT 細(xì)胞培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、1 × 105U/L 的青霉素、100 mg/L 鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，PBS 洗滌兩次后加入0.25%胰酶消化，待細(xì)胞變圓后加入DMEM 終止消化，1 200 r/min 離心5 min，離心收集細(xì)胞，傳代后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞處理

1.3.1 紫外照射取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT 細(xì)胞 用PBS 洗滌兩次，加入一定量的PBS（其中6 cm 皿：1.9 mL；96 孔板：28 μL），置于距UVB 光源垂直距離40 cm 的紫外光源箱體指定位置，功率密度為165 μW/cm2，照射相應(yīng)時(shí)間。照射結(jié)束后吸棄PBS，加入完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT 細(xì)胞按每孔5 × 103個(gè)細(xì)胞接種于96 孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后，接受UVB 處理，對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)加入10 μL/孔CCK-8 溶液，37 ℃恒溫孵育2 h 后，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.3 透射電鏡檢測(cè)自噬小體 30 mJ/cm2UVB 處理24 h 后收集貼壁細(xì)胞。PBS 洗滌3 次后，將細(xì)胞刮下，1 200 r/min 離心5 min，吸棄上清后加入4%戊二醛固定過(guò)夜，經(jīng)漂洗、脫水、浸透、包埋，超薄切片后進(jìn)行透射電鏡觀察并拍照。

1.3.4 MDC 染色標(biāo)記自噬小體囊泡 30 mJ/cm2UVB 處理24 h 后，PBS 洗滌細(xì)胞2 次，加入0.05 mmol/L 的MDC 染料，37 ℃避光孵育30 min，PBS 緩沖液漂洗兩次，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。每孔至少選取3 個(gè)視野，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測(cè) 30 mJ/cm2UVB處理24 h后收集細(xì)胞。100 μL 預(yù)冷的1×Annexin V binding buffer 重懸細(xì)胞后，分別加入5 μL Annexin V FITC 和5 μL PI 混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μL 1×Annexin V binding buffer 混勻后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.6 Western Blot 檢測(cè)自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) HaCaT 細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%融合度時(shí)，接受UVB 照射。分別在照射后6、12、24、36、48 h 收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)煮沸變性后行SDSPAGE 凝膠電泳，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene，PVDF）膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 漂洗3 次后，加入相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，ECL 發(fā)光試劑盒檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。

注意不要遺漏三防門門洞四角部45°的構(gòu)造筋。內(nèi)外側(cè)每角放置1Φ 16 mm，L=1 000 mm的斜向鋼筋。當(dāng)墻厚D≤400 mm時(shí)，每角2Φ 16 mm；D﹥400 mm時(shí)，每角3Φ 16 mm。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，兩兩比較采用SNK 法，方差不齊時(shí)使用Games-Howell 法校正。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UVB 能夠誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞自噬

2.1.1 透射電鏡觀察自噬小體 30 mJ/cm2UVB 照射24 h 后，HaCaT 細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，內(nèi)含大量細(xì)胞器和折疊蛋白（圖1）。

圖1 透射電鏡觀察30 mJ/cm2 UVB 照射后HaCaT 細(xì)胞內(nèi)自噬小體的情況Fig.1 The changes of autophagosomes in HaCaT cells under TEM

2.1.2 MDC 染色觀察細(xì)胞自噬小體囊泡 與對(duì)照組相比，30 mJ/cm2UVB 照射HaCaT 細(xì)胞24 h后，MDC 染色可見(jiàn)HaCaT 細(xì)胞中的酸性自噬囊泡明顯增多，熒光強(qiáng)度加強(qiáng)，說(shuō)明UVB 能夠誘導(dǎo)Ha-CaT 細(xì)胞自噬（圖2）。

圖2 MDC 染色檢測(cè)細(xì)胞自噬Fig.2 Detection of autophagy by MDC staining

2.1.3 Western Blot 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)Western Blot 結(jié)果顯示，30 mJ/cm2UVB 照射后，LC3-Ⅱ、Beclin-1 以及SQSTM1 的蛋白表達(dá)水平顯著升高，其中LC3-Ⅱ、SQSTM1 在照后24 h 達(dá)到最高點(diǎn)，48 h 表達(dá)量下降，Beclin-1 在照后48 h 依然維持在較高水平（圖3）。

2.2 UVB 誘導(dǎo)了HaCaT 細(xì)胞保護(hù)性自噬

2.2.1 運(yùn)用3-MA抑制自噬后，增加了UVB誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞凋亡 3-MA 是一種經(jīng)典的Ⅲ型PI3K抑制劑，作用于Vps34 和PI3Kγ，會(huì)阻斷自噬體的形成［6］。運(yùn)用3-MA 抑制自噬后，LC3-Ⅱ蛋白水平表達(dá)下降（圖4C），自噬水平降低，UVB 對(duì)HaCaT細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用增加（P＜0.05，圖4A），細(xì)胞增殖減慢（P＜0.05，圖4B），凋亡蛋白Cleaved-PARP 表達(dá)增加（圖4C）。

圖3 Western Blot 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.3 Detection of autophagy-related Protein markers by Western Blot

圖4 運(yùn)用3-MA 抑制自噬對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.4 Inhibition of autophagy by 3-MA on cell proliferation and apoptosis

2.2.2 運(yùn)用siATG5 抑制自噬后增加了UVB 誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞凋亡 自噬相關(guān)基因ATG5 在自噬小體的形成中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，它與ATG12共同形成ATG5-ATG12 復(fù)合物，幫助自噬體膜伸展擴(kuò)張［7］。運(yùn)用ATG5 小干擾RNA（siATG5）抑制自噬后，LC3-Ⅱ蛋白水平表達(dá)下降（圖5C），自噬水平降低，UVB 對(duì)HaCaT 細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用增加（P＜0.05，圖5A），細(xì)胞增殖減慢（P＜0.05，圖5B），凋亡蛋白Cleaved-PARP 表達(dá)增加（圖5C）。

圖5 運(yùn)用siATG5 抑制自噬對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響Fig.5 Inhibition of autophagy by siATG5 on cell proliferation and apoptosis

2.3 UVB通過(guò)AMPK/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞自噬 30 mJ/cm2UVB 處理HaCaT 細(xì)胞24 h后，用Western Blot 檢測(cè)AMPK/mTOR 信號(hào)通路節(jié)點(diǎn)蛋白的表達(dá)水平見(jiàn)圖6。UVB 照射后，AMPK、p-ULK1、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)增加，p-mTOR蛋白表達(dá)降低，而總mTOR 和ULK1 蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯變化。運(yùn)用3-MA 和siATG5 抑制自噬后，AMPK、p-ULK1、Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)水平下降，p-mTOR 蛋白表達(dá)增加。

3 討論

UVB 是皮膚癌的主要原因之一［8］，其對(duì)皮膚的損傷作用被廣泛報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)UVB 能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞DNA 損傷、死亡受體激活、活性氧簇（ROS）等方式導(dǎo)致細(xì)胞死亡［9-10］。凋亡與自噬是細(xì)胞中存在的兩種程序性死亡方式，是正常的生理和病理的關(guān)鍵［11］。凋亡，又稱為Ⅰ型程序性死亡，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。自噬，又稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，是機(jī)體細(xì)胞面對(duì)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏、細(xì)胞器功能障礙及病原體入侵時(shí)的自穩(wěn)過(guò)程。目前通常認(rèn)為兩者呈如下關(guān)系：（1）細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)自噬抑制或推遲細(xì)胞凋亡的發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞的存活；（2）細(xì)胞自噬通過(guò)誘導(dǎo)凋亡基因的活化，加速凋亡進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞死亡；（3）二者雖有共同的上游通路，但功能獨(dú)立，共同維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。既往研究中，CAVINATO 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，自噬在UVB 誘導(dǎo)的皮膚成纖維細(xì)胞（HDF）衰老的早期階段被激活，阻斷細(xì)胞內(nèi)ROS的積累可抑制UVB 誘導(dǎo)的自噬。而CHEN 等［13］研究發(fā)現(xiàn)UVB 通過(guò)雷帕霉素（mTOR）非依賴性途徑下調(diào)ULK1 和ATG7 的表達(dá)，抑制表皮HEKs 細(xì)胞的自噬。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，UVB 能夠通過(guò)caspase-3、PARP 等凋亡通路誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞發(fā)生凋亡，并呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴關(guān)系。但UVB 對(duì)Ha-CaT 細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)效應(yīng)及其通路研究卻未闡明，因此，本研究就UVB 對(duì)HaCaT 自噬的誘導(dǎo)效應(yīng)及其與凋亡的關(guān)系展開(kāi)具體研究。

圖6 Western Blot 檢測(cè)AMPK/mTOR 通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)Fig.6 Detection of key proteins in AMPK/mTOR pathway by Western Blot

透射電鏡可以直觀的檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的自噬小體及自噬溶酶體的結(jié)構(gòu)形態(tài)和數(shù)量［14］。LC3-Ⅱ、Beclin-1、SQSTM1 是細(xì)胞自噬的標(biāo)志蛋白，也是目前公認(rèn)的自噬檢測(cè)生物標(biāo)志物。其中，Beclin-1 在自噬起始時(shí)發(fā)揮重要作用，是形成自噬體的必需分子之一。LC3B-Ⅱ則分布于自噬體內(nèi)膜和外膜上，其蛋白表達(dá)量可反映細(xì)胞自噬活性的強(qiáng)弱。SQSTM1，是一組由SQSTM1 基因編碼的泛素結(jié)合蛋白，通過(guò)與LC3-Ⅱ的C 端的LIR 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，共同參與自噬體與溶酶體的融合及降解［15］。

本研究采用半數(shù)紅斑劑量UVB（30 mJ/cm2）照射HaCaT 細(xì)胞，結(jié)果顯示：30 mJ/cm2UVB 照射后，HaCaT 細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，內(nèi)含大量細(xì)胞器和折疊蛋白。LC3B-Ⅱ、Beclin-1 和SQSTM1 的表達(dá)均增加，呈一定時(shí)間依賴關(guān)系。其中，LC3-Ⅱ和SQSTM1 在照后24 h 達(dá)到最高點(diǎn)，36 h 表達(dá)開(kāi)始下降。Beclin-1 在照后48 h 依然維持在較高水平。綜合分析，UVB 照射誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生了自噬。為了進(jìn)一步驗(yàn)證UVB 誘導(dǎo)的自噬對(duì)HaCaT 細(xì)胞生存的影響，本研究采用3-MA 和ATG5 小干擾RNA（siATG5）抑制UVB 誘導(dǎo)的自噬，觀察自噬在HaCaT 細(xì)胞生存中發(fā)揮的作用。研究發(fā)現(xiàn)，利用自噬工具藥3-MA 和siATG5 抑制自噬后，UVB 誘導(dǎo)的HaCaT 細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞增殖減慢，凋亡蛋白Cleaved-PARP 表達(dá)增加，這表明UVB誘導(dǎo)的自噬在HaCaT 細(xì)胞生存中發(fā)揮保護(hù)性作用。

既往研究［16］表明，AMPK/mTOR 通路在細(xì)胞自噬的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在對(duì)自噬的調(diào)控中，AMPK 和mTOR 既相互獨(dú)立，又具有上下游的關(guān)系。一方面，AMPK 可直接激活ULK1-Atg13-FIP200 復(fù)合體，促進(jìn)Beclin-1 蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)自噬發(fā)生；另一方面，AMPK 還可直接抑制mTOR 復(fù)合體1（mTOR complex 1，mTORC1）的活性，促進(jìn)自噬發(fā)生［17］。本研究中，UVB 照射引起AMPK、p-ULK1 蛋白表達(dá)增加，p-mTOR 蛋白表達(dá)量下降。運(yùn)用3-MA 和siATG5 抑制自噬后，與單獨(dú)照射組相比，AMPK、p-ULK1 蛋白表達(dá)量下降，p-mTOR 蛋白表達(dá)量增加，這表明UVB 照射也是通過(guò)AMPK/mTOR 通路誘導(dǎo)自噬發(fā)生，其可能的機(jī)制為：UVB照射誘導(dǎo)AMPK 表達(dá)增加，AMPK 表達(dá)增加抑制mTOR 蛋白的磷酸化，促進(jìn)ULK1 的磷酸化和Beclin-1 的表達(dá)增加，促進(jìn)HaCaT 細(xì)胞發(fā)生自噬。

綜上所述，UVB 能通過(guò)AMPK/mTOR 信號(hào)通路誘導(dǎo)HaCaT 細(xì)胞發(fā)生自噬，該自噬對(duì)HaCaT 細(xì)胞呈保護(hù)作用。有關(guān)其他自噬信號(hào)通路是否參與了UVB 誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞自噬，筆者將在后續(xù)工作中開(kāi)展相關(guān)研究。