付翁 楊錦 齊琦 王明陽 謝偉

包頭醫(yī)學院生物醫(yī)學研究中心與神經(jīng)科學研究所（內(nèi)蒙古包頭014040）

急性腦卒中、腦腫瘤或腦外傷是癲癇患者的常見病因，而藥物治療可能發(fā)展為藥物難治性癲癇，手術治療風險和創(chuàng)傷大、成本高［1］。重復經(jīng)顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）可有效治療某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病［2-5］。rTMS 常分為低頻（≤1 Hz）和高頻（≥5 Hz）兩類，高頻rTMS 可導致大腦皮層長時程增強作用，用于治療抑郁癥；相反，低頻rTMS 導致長時程抑制作用，是安全、有效治療癲癇的方式［6］。但其分子機制尚未完全明確，因此了解相關機制有助于加深對癲癇發(fā)生及rTMS 效應的認識，避免潛在的風險。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）及其特異性原肌球蛋白相關激酶B 受體（tropomyosin-related kinase B receptor，TrkB）與癲癇的發(fā)生和發(fā)展密切相關［7］。研究［8］表明，TrkB 受體在癲癇狀態(tài)下表達發(fā)生變化，隨之引起B(yǎng)DNF/TrkB 信號通路的抑制。而低頻rTMS 可激活BDNF/TrkB 信號通路并調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性［9］，但低頻rTMS 能否通過調(diào)控TrkB 受體和信號通路發(fā)揮其抗癲癇作用仍有待研究。因此本研究利用大鼠癲癇模型，使用低頻rTMS（1 Hz）對模型進行干預，之后檢測TrkB 受體、BDNF/TrkB 信號通路和癇樣放電的變化情況，從TrkB 受體和信號通路角度，揭示低頻rTMS 治療癲癇的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和主要試劑 健康成年雄性SD 大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購自內(nèi)蒙古大學實驗動物中心。兔源TrkB 單克隆抗體，購自美國Santa Cruz 公司；兔源磷酸化TrkB 單克隆抗體，購自美國CST 公司；鼠源β-actin 單克隆抗體，購自美國Santa Cruz公司；有芯玻璃電極，購自美國Sutter 公司；人工腦脊液、電極內(nèi)液所需藥品均購自美國Sigma 公司。

1.1.2 主要設備 經(jīng)顱磁刺激儀（OSF），購自武漢奧賽福醫(yī)療科技有限公司；蛋白電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（5800），中國Tanon 公司產(chǎn)品；振動切片機（Vibrating Microtome 5100mz），英國Campden 公司產(chǎn)品；電極拉制儀（P-97），美國Sutter 公司產(chǎn)品；膜片鉗放大器（Axopatch 200B amplifier），美國Molecular Devices 公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 匹羅卡品誘導構建癲癇大鼠模型 大鼠腹腔注射氯化鋰127 mg/kg。待24 h 后給予匹羅卡品20 mg/kg，給藥后觀察大鼠行為。若無癲癇發(fā)作或發(fā)作程度不夠時，每30 min 重復注射匹羅卡品10 mg/kg，但最大劑量為60 mg/kg。大鼠從第1 次大發(fā)作開始，持續(xù)1 h 視為模型制作成功，之后腹腔注射水合氯醛3 mL/kg 終止發(fā)作。未進行任何處理的大鼠作為對照組。

1.2.2 低頻rTMS 干預癲癇大鼠模型 將大鼠固定在合適的大鼠限制器中，使用直徑為6 cm 的圓形線圈緊貼大鼠的頭皮并與顱骨平行，采用OSF經(jīng)顱磁刺激儀進行rTMS 干預。刺激頻率為1 Hz，刺激強度為100%誘發(fā)麻醉大鼠后肢腓腸肌動作電位強度，為0.4 Tesla。連續(xù)進行14 d rTMS 干預，刺激參數(shù)為20 個脈沖寬度、70 μs 的單脈沖刺激為一串，共計20 串，每串間隔10 s。對照組和癲癇組大鼠固定在限制器中，線圈緊貼大鼠頭皮但未進行磁刺激作為假干預組。

1.2.3 Western Blot 檢測海馬組織TrkB 受體蛋白的表達 各組大鼠麻醉后斷頭取腦并分離海馬組織，使用加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑RIPA裂解液提取總蛋白，利用BCA 法測定蛋白濃度后，在12%的SDS-PAGE 中進行電泳并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，室溫封閉后加入一抗于4 ℃孵育過夜（兔抗大鼠TrkB 一抗1∶200 稀釋，兔抗大鼠磷酸化TrkB 一抗1∶1 000 稀釋，小鼠抗大鼠β-actin 一抗1∶1 000 稀釋），之后分別使用1∶5 000 稀釋的山羊抗兔、小鼠二抗于37 ℃孵育1 h。最終利用ECL 顯影液進行發(fā)光并檢測灰度值。

1.2.4 大鼠海馬腦片急性分離 大鼠麻醉后斷頭，彎鑷剝開顱骨并迅速取出大腦置于0～4 ℃的95%O2+5%CO2預先飽和的［人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF），120 mmol/L NaCl，2.5 mmol/L KCl，1.25 mmol/L NaH2PO4，2 mmol/L MgSO4，2 mmol/L CaCl2，26 mmol/L NaHCO3，10 mmol/L 葡萄糖，pH=7.4）］中冰凍，取出后進行修塊，置于切片槽中并使用振動切片機以海馬長軸垂直方向，將腦組織切成300 μm 厚的腦片，立即將腦片置于95%O2+5%CO2預先飽和的ACSF中孵育1 h，維持溫度在26 ℃。

1.2.5 膜片鉗檢測大鼠海馬神經(jīng)元放電 室溫孵育1 h 后將海馬腦片轉(zhuǎn)移至記錄槽中，使用配有紅外CCD 的正置顯微鏡在40 倍水鏡下尋找海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元。實驗前拉制有芯玻璃電極，電極尖端電阻為3～5 MΩ并充入電極內(nèi)液（130 mmol/L KCl，10 mmol/L EGTA，2 mmol/L MgCl2，10 mmol/L HEPES，1 mmol/L CaCl2，4 mmol/L MgATP，pH=7.3）。電極入液后，使其尖端與神經(jīng)元細胞膜形成高阻封接。施加負壓破膜后補償電容電流和串聯(lián)電阻，在電流鉗狀態(tài)下調(diào)至I=0 模式，采用pCLAMP 10.0 軟件來設定刺激方案、采集并儲存神經(jīng)元的放電活動，采用Clampfit 9.2 進行數(shù)據(jù)分析、制圖和統(tǒng)計放電頻率。

1.3 統(tǒng)計學方法 Western Blot 和膜片鉗數(shù)據(jù)結果以x ± s表示，多組之間的比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用t檢驗，應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 匹羅卡品誘導構建癲癇大鼠模型的鑒定 使用全細胞膜片鉗分別記錄對照組（Control）和癲癇組（Status Epilepticus）神經(jīng)元的自發(fā)放電活動。對照組神經(jīng)元放電偶然發(fā)生，頻率為（0.45±0.01）Hz（圖1A）。而癲癇組神經(jīng)元呈現(xiàn)高頻率、爆發(fā)式的放電（圖1B），與對照組相比其放電頻率（1.88 ±0.10）Hz顯著升高（P＜0.05，圖1D）。并且癲癇組神經(jīng)元放電的inter-event interval 累計分布曲線明顯左移（圖1C），以上結果提示經(jīng)匹羅卡品誘導成功構建癲癇大鼠模型。

圖1 膜片鉗記錄神經(jīng)元放電Fig.1 The discharges of neurons recorded by patch clamp

2.2 TrkB 受體蛋白在低頻rTMS 干預癲癇大鼠模型前后的表達變化情況 使用Western Blot 檢測各組全長型TrkB 受體（the full-length TrkB receptor，TrkB.FL）和截短型TrkB 受體（the truncated TrkB receptor，TrkB.T）蛋白表達的變化。與對照組相比，癲癇組TrkB.FL 受體表達降低（P＜0.05，圖2A）。而經(jīng)低頻rTMS 干預后（Status Epilepticus+rTMS），其與癲癇組相比TrkB.FL 受體表達升高（P＜0.05），但仍低于對照組（P＜0.05，圖2A）。在癲癇假干預組中（Status Epilepticus+Sham），TrkB.FL 受體表達與癲癇組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

與對照組相比，癲癇組TrkB.T 受體表達升高（P＜0.05）；經(jīng)低頻rTMS干預后，TrkB.T受體表達降低（P＜0.05），但仍高于對照組（P＜0.05，圖2B）。在癲癇假干預組中，TrkB.T 受體表達與癲癇組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）?？傊?，癲癇大鼠模型中TrkB.FL 受體表達降低，而TrkB.T 受體表達升高，但經(jīng)低頻rTMS 干預模型后，可上調(diào)低表達的TrkB.FL 受體，下調(diào)高表達的TrkB.T 受體。

圖2 低頻rTMS 干預癲癇大鼠模型前后TrkB 受體蛋白表達的變化Fig.2 Changes of TrkB receptor protein expression before and after low frequency rTMS intervention in epileptic rats

2.3 TrkB.FL 信號通路在低頻rTMS 干預癲癇大鼠模型前后的活性變化情況 實驗采用磷酸化的TrkB.FL 受體蛋白（phosphorylated TrkB.FL）與總TrkB.FL 受體蛋白（total TrkB.FL）的比值（pTrkB.FL/total TrkB.FL）代表TrkB.FL 信號通路的激活程度。與對照組相比，癲癇組磷酸化TrkB.FL 受體比值降低（P＜0.05，圖3）。經(jīng)低頻rTMS 干預后與癲癇組相比，磷酸化TrkB.FL 受體比值升高（P＜0.05，圖3）。但在癲癇假干預組中，磷酸化TrkB.FL 受體比值與癲癇組相比差異仍無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果表明TrkB.FL 信號通路活性在癲癇狀態(tài)下受到抑制，但經(jīng)低頻rTMS 干預后，TrkB.FL 信號通路可被重新激活。

2.4 低頻rTMS 干預癲癇大鼠模型前后神經(jīng)元放電的變化情況 上述實驗結果表明癲癇組神經(jīng)元放電頻率較對照組明顯升高，而癲癇組經(jīng)低頻rTMS 干預后，神經(jīng)元放電頻率（1.40 ± 0.13）Hz較癲癇組（1.88 ± 0.21）Hz 明顯降低（P＜0.05），但仍低于對照組（0.45±0.03）Hz（P＜0.05，圖4）。在癲癇假干預組中，神經(jīng)元放電頻率（1.84±0.36）Hz與癲癇組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結果提示低頻rTMS 干預可抑制癲癇大鼠的癇樣放電。

圖3 低頻rTMS 干預癲癇大鼠模型前后，磷酸化TrkB.FL受體蛋白（phosphorylated TrkB.FL）與總TrkB.FL 受體蛋白（total TrkB.FL）表達變化Fig.3 Changes in phosphorylated TrkB.FL receptor protein（phosphorylated TrkB.FL）and total TrkB.FL receptor protein（total TrkB.FL）before and after lowfrequency rTMS intervention in epileptic rats

圖4 低頻rTMS 干預癲癇大鼠模型前后，神經(jīng)元放電活動的變化Fig.4 Changes in neuronal discharges before and after lowfrequency rTMS intervention in epileptic rats

3 討論

研究表明低頻rTMS（90%rMT）可降低難治性癲癇患者發(fā)作間期癇樣放電頻率，還可以改善這些患者的心理狀況［10］；使用8 字形線圈低頻rTMS可有效治療小兒難治性癲癇［11］。而本實驗也表明大鼠癲癇模型經(jīng)低頻rTMS（1 Hz）干預后，癇樣放電頻率大幅度降低（圖4），則再一次證明低頻rTMS治療癲癇是有效的，但分子機制仍未有定論。

有證據(jù)表明TrkB 受體是癲癇形成過程中的一個重要分子，如敲除大鼠海馬TrkB 受體基因后，則癲癇點燃模型中的癲癇形成會被抑制［12］。TrkB 受體分為TrkB.FL 和TrkB.T 兩種亞型，但兩種亞型在癲癇中的表達并不平衡，在大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)下，TrkB.FL 表達和磷酸化的水平顯著降低，但TrkB.T表達并無改變［13］。而本實驗同樣發(fā)現(xiàn)兩種亞型表達失衡，即TrkB.FL表達下調(diào)而TrkB.T表達上調(diào)（圖2）。在大鼠原代神經(jīng)元癇樣放電模型中，使用翻譯抑制劑降低原本高表達的TrkB.T 后，模型的癇樣放電頻率顯著降低［14］。同樣，本研究采用低頻rTMS干預癲癇大鼠模型后，可上調(diào)低表達的TrkB.FL，下調(diào)高表達的TrkB.T（圖2），此外模型的自發(fā)放電頻率明顯下降（圖4）。該結果一方面說明維持TrkB受體亞型的表達平衡對癲癇的抑制至關重要；另一方面說明低頻rTMS 抗癲癇作用的機制很有可能是從調(diào)整TrkB 受體表達開始的。但TrkB 受體表達變化又直接影響TrkB 信號通路，所以TrkB 信號通路也有可能參與低頻rTMS抗癲癇的作用機制當中。

當BDNF與TrkB受體結合后，TrkB受體自身發(fā)生磷?；?，最終啟動TrkB信號通路，在神經(jīng)元分化、存活和突觸可塑性等方面發(fā)揮作用。正常情況下兩個TrkB.FL 同二聚體與BDNF 結合后可正常激活TrkB.FL信號通路，但TrkB.FL和TrkB.T異二聚體與BDNF結合后則抑制TrkB.FL信號通路。TrkB.FL信號通路與癲癇的形成與發(fā)展存在密切聯(lián)系，但在XIANG 等［15］和本研究中（圖3）均發(fā)現(xiàn)癲癇狀態(tài)下TrkB.FL信號通路受到抑制，而恰好TrkB.T表達增加，很可能造成TrkB.T與TrkB.FL異二聚體增多，最終導致TrkB.FL 信號通路被抑制，如果重新激活TrkB.FL信號通路，則癲癇有可能被抑制［14］。經(jīng)低頻rTMS干預癲癇大鼠模型后，原本高表達的TrkB.T 下調(diào)，可能減少了異二聚體的形成；同時上調(diào)了低表達的TrkB.FL，最終使癲癇狀態(tài)下被抑制的TrkB.FL 信號通路重新被激活，此外癇樣放電頻率明顯降低。