許影 高雅 楊春燕 朱東茂 張銀田 李威儒 平寶紅

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院1惠僑醫(yī)療中心，2血液科（廣州510515）

干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）主要由自然殺傷細(xì)胞（nature killer cells，NKs）和活化的T 細(xì)胞分泌，具有免疫激活、誘導(dǎo)免疫耐受、調(diào)節(jié)免疫抑制的功能［1］。IFN-γ 是促炎性因子中重要成分，在炎癥性疾病尤其移植物抗宿主?。╣raft-versus-host disease，GVHD）病理發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮核心作用［1-2］。IFN-γ可通過誘導(dǎo)吲哚胺2，3-二氧化酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）途徑調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的適應(yīng)性或固有性免疫反應(yīng)，也可調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stromal cells，MSCs）的免疫功能［1，3］。

MSCs 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用需要炎癥微環(huán)境中IFN-γ的激活［3］。IFN-γ預(yù)處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stromal cells，BMMSCs）不僅上調(diào)IL-6、IL-8 等炎癥抑制因子表達(dá)及分泌［4］，而且IFN-γ激活的BMMSCs 顯著預(yù)防和抑制GVHD 的發(fā)生、進(jìn)展［5］。目前臨床防治GVHD 的MSC 主要來源于骨髓［6］，但BMMSCs 的臨床應(yīng)用面臨許多挑戰(zhàn)，如采髓有創(chuàng)傷性，細(xì)胞活力受供者年齡等因素影響［4］。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic mesenchymal stem cell，hAMSC）來源于健康孕婦剖宮產(chǎn)后廢棄物——胎盤羊膜，易于獲得，數(shù)量豐富。免疫表型鑒定表明，hAMSCs與BMMSCs相似，具有免疫調(diào)節(jié)特性，hAMSCs 比BMMSCs 有更強(qiáng)的增殖能力及干細(xì)胞特性，可能為GVHD 的防治提供一種新的種子細(xì)胞來源［7-9］。但目前IFN-γ對hAMSCs 的生長、增殖以及免疫調(diào)節(jié)的影響少有報(bào)道。因此，本研究擬在hAMSCs 培養(yǎng)基中加入不同濃度IFN-γ，分析IFN-γ對hAMSCs 的增殖能力、凋亡情況及炎性因子分泌的影響，為GVHD 防治提供一個(gè)新策略。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑

1.1.1 胎盤組織 共兩份，均經(jīng)知情同意，獲取于南方醫(yī)院婦產(chǎn)科足月剖宮產(chǎn)的健康孕婦。無菌保存3 h 內(nèi)進(jìn)行分離。

1.1.2 主要試劑 α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、EDTA-胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）（Gibco），青霉素-鏈霉素雙抗、非必需氨基酸、L-谷氨酸（Sigma），人重組IFN-γ因子（Peprotech），流式熒光抗體（Gibco），CCK-8 試劑盒（Dojindo），SSEA-4 免疫熒光抗體（abcam），Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒（MultiSciences），PGE-2 試劑盒（elabscience）、sHLA-G 試劑盒（Exbio）。

1.1.3 主要儀器 流式細(xì)胞分析儀（BD LSRFortessa X-20），microplate reader（BioTekCytation5），F(xiàn)lowJo V10 software（FlowJo LLC），顯微鏡（Olympus CKX53）。

1.2 分離和培養(yǎng)hAMSCs 鈍性剝離新鮮胎盤的部分羊膜，剪成大小約6 cm × 6 cm 組織塊，0.25%胰蛋白酶-EDTA 37 ℃水浴消化2 次，分別為10、15 min，PBS 漂洗盡量去除羊膜上皮細(xì)胞，剪碎消化后的組織塊至大小約1 mm×1 mm，平鋪至培養(yǎng)瓶中靜置1 h 貼壁，加入適量α-MEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，隨后每3 天換液，待貼壁細(xì)胞生長密度為70%～80%時(shí)傳代，記為P1，傳代后貼壁細(xì)胞生長融合80%～90%時(shí)再傳代，記為P2，以此類推。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長形態(tài)。第3～6 代hAMSCs 用于本實(shí)驗(yàn)。

1.3 hAMSCs免疫表型鑒定 取第4代hAMSCs制成1×105/mL 單細(xì)胞懸液，在每管100 μL 的單細(xì)胞懸液中加入鼠抗人單克隆抗體CD90APC、CD73PE、CD34APC、CD45FITC、CD105 FITC、CD11bPE、HLADRPC7 各20 μL，室溫避光孵育30 min，PBS 洗滌重懸后，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.4 hAMSCs 免疫熒光檢測 取第4 代hAMSCs制作細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，0.2% Tritonx-100、5% BSA 通透封閉40 min，加入抗SSEA-4一抗，4 ℃濕盒孵育過夜，羊抗鼠IgG/Cy3 二抗室溫避光孵育1 h，DAPI 核染色，室溫避光孵育2 min，封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 hAMSCs增殖能力 按照IFN-γ凍干粉試劑說明書溶解、稀釋IFN-γ，最終濃度分別為10、30、50、70、100 ng/mL。含不同濃度IFN-γ的α-MEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)hAMSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/mL，按每孔100 μL 接種于96 孔板中，各組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，每天取1 組細(xì)胞，加入10 μL CCK-8 避光孵育2 h，酶標(biāo)儀測450 nm 處OD值，連續(xù)檢測6 d，繪制生長曲線。

1.6 細(xì)胞凋亡分析 取第5 代hAMSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 × 105/mL，含不同濃度IFN-γ的α-MEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，0.25%胰蛋白酶（無EDTA）消化3～4 min，PBS 洗滌后離心，500 μL Binding Buffer 重懸細(xì)胞沉淀，各管中分別加入5 μL Annexin V-APC and 5 μL PI，混勻室溫避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.7 細(xì)胞因子分析 調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/mL，不同濃度IFN-γ 的α-MEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)hAMSCs，培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA檢測PGE-2、sHLA-G 水平，紫外分光光度法檢測KYN 水平，具體操作均參考試劑說明書。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組差異比較用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hAMSCs 細(xì)胞形態(tài)及鑒定 組織塊法培養(yǎng)的原代hAMSCs 及傳代后的hAMSCs 均呈梭形、成纖維樣，克隆性增殖。hAMSCs 表達(dá)CD90、CD73、CD105，不表達(dá)CD34、CD45、CD19、CD11b、HLADR（圖1A）；及表達(dá)人胚胎表面抗原SSEA-4（圖1B）。

圖1 hAMSCs 免疫表型及免疫熒光鑒定Fig1 Identification of immunophenotype and immunofluorescence of hAMSCs

2.2 不同濃度IFN-γ 對hAMSCs 增殖的影響 隨著IFN-γ 濃度的增加，hAMSCs 增殖能力未受到明顯影響。無IFN-γ 組和含不同濃度IFN-γ 組中hAMSCs 的增殖從第1 天至第4 天，均快速生長，隨后生長速度減慢（圖2）。

圖2 不同濃度IFN-γ 對hAMSCs 增殖能力的影響Fig2 Effects of different concentration of IFN-γ on the proliferation of hAMSCs

2.3 IFN-γ 對hAMSCs 凋亡的影響 IFN-γ 濃度為100 ng/mL 培養(yǎng)hAMSCs 組與無IFN-γ 培養(yǎng)hAMSCs 組比較，hAMSCs 凋亡水平?jīng)]有差異（P=0.78）（圖3）。

2.4 IFN-γ 對hAMSCs 細(xì)胞因子分泌水平的影響 10 ng/mL 至100 ng/mL 濃 度 培養(yǎng)hAMSCs 時(shí)sHLA-G 水平均明顯升高（P＜0.001）（圖4A）；10 ng/mL IFN-γ 組和無IFN-γ 組相比PEG-2 分泌水平無差別（P=0.068），30 ng/mL IFN-γ、50 ng/mL IFNγ 和無IFN-γ 組相比PEG-2 分泌水平升高（P＜0.05），70 ng/mL IFN-γ、100 ng/mL IFN-γ 和無IFN-γ組相比PEG-2 分泌水平升高（P＜0.01）（圖4B）；10 ng/mL 至100 ng/mL 濃度培養(yǎng)hAMSCs 時(shí)上清中KYN 水平均明顯升高（P＜0.001），提示IDO 酶活性較無IFN-γ 組明顯增強(qiáng)（圖4C）。

3 討論

圖3 100 ng/mL IFN-γ 對hAMSCs 的凋亡影響Fig3 Apoptosis of hAMSCs stimulated with 100 ng/mL IFN-γ

圖4 IFN-γ 對hAMSCs 炎性因子分泌水平的影響Fig4 Effect of IFN-γ on the level of inflammatory factors secreted by hAMSCs

50年前IFN-γ 作為病毒抑制蛋白首次被Frederick Wheelock 發(fā)現(xiàn)，由NKs、Th1、細(xì)胞毒CD8+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌的重要促炎癥因子，在炎癥性疾病如GVHD 的起始、發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用［1-2］。IFN-γ在臨床上用來抗病毒、抗腫瘤，目前越來越多的研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ具有免疫調(diào)節(jié)作用。IFN-γ能夠通過IDO 代謝途徑對免疫細(xì)胞及MSC 等發(fā)揮直接或間接免疫激活、免疫抑制或誘導(dǎo)免疫耐受作用。MSCs 發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用需要炎癥環(huán)境中IFN-γ的激活。IFN-γ激活的BMMSCs 分泌及免疫調(diào)節(jié)能力增強(qiáng)，有效防治GVHD，且隨著IFN-γ濃度增加BMMSCs 的免疫抑制作用增強(qiáng)［3-5］。本研究結(jié)果中，未經(jīng)IFN-γ處理的hAMSCs 具有弱IDO酶活性，分泌低水平細(xì)胞因子PGE-2、sHLA-G，經(jīng)IFN-γ處理的hAMSCs 分泌PGE-2、sHLA-G 水平提高，IDO 酶活性增強(qiáng)，隨著IFN-γ濃度的增加，hAMSCs 的IDO 酶活性及分泌PGE-2、sHLA-G 分泌功能增強(qiáng)，表明IFN-γ的刺激能增強(qiáng)hAMSCs 的免疫調(diào)節(jié)能力。IFN-γ激活的MSCs 能上調(diào)MSCs 表面B7-H1 表達(dá)，通過STAT-1 信號(hào)通路影響MSCs 的免疫抑制功能，在MSCs 的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的協(xié)同作用［10］，但I(xiàn)FN-γ增強(qiáng)hAMSCs 免疫調(diào)節(jié)功能的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

hAMSCs 來源于胎盤羊膜，易于獲得，數(shù)量豐富，具有MSCs 的生物學(xué)特征，低免疫源性及免疫調(diào)節(jié)作用，已經(jīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域及自身免疫疾?。?，11-12］。hAMSCs 可通過分泌可溶性因子發(fā)揮固有性和適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)作用。hAMSCs 可通過IDO酶、sHLA-G、白介素-10（interleukin-10，IL-10）、TGF-β1、PGE-2 等炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)CD4+/CD8+T 細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫耐受作用，調(diào)節(jié)成熟樹突狀細(xì)胞（mature dendritic cells，mDCs）轉(zhuǎn)變成耐受性樹突狀細(xì)胞（tolerated dendritic cells，tDCs），進(jìn)一步通過sHLA-G 誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫抑制性調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）。本實(shí)驗(yàn)中結(jié)果表明，hAMSCs 具有IDO 酶活性，分泌sHLA-G、PGE-2 細(xì)胞因子的能力，但I(xiàn)FN-γ激活后的hAMSCs 對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用仍待研究。研究表明，IFN-γ不影響人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cordderived mesenchymal stromal cells，hUC-MSCs）的增殖能力。與既往報(bào)道一致，本研究中不同濃度IFN-γ組中hAMSCs 的增殖能力無明顯變化，100 ng/mL IFN-γ組hAMSCs 無凋亡情況，結(jié)果表明IFN-γ不影響hAMSCs 的增殖，不誘導(dǎo)hAMSCs 凋亡。

綜上所述，hAMSCs 不僅能用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，越來越多的研究聚焦在其免疫調(diào)節(jié)作用，尤其關(guān)注對GVHD 的臨床應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明促炎癥因子IFN-γ 在不影響hAMSCs 生長、增殖的情況下，能夠提高PGE-2、sHLA-G 的分泌水平，增強(qiáng)IDO 酶活性，IFN-γ 在hAMSCs 微環(huán)境中可以發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用，為hAMSCs 防治GVHD 提供理論依據(jù)。