許艷 劉如明 王諾鑫 肖建輝

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，遵義市醫(yī)藥生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（貴州遵義563003）

衰老是生命發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)自然規(guī)律。衰老及衰老相關(guān)慢性疾病給國(guó)家和社會(huì)發(fā)展帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。研究表明，干細(xì)胞的衰老是機(jī)體衰老的根本原因；此外，衰老導(dǎo)致干細(xì)胞的增殖與分化能力降低，阻礙其在臨床治療中的應(yīng)用。因此，探究干細(xì)胞衰老的分子機(jī)制對(duì)于延緩機(jī)體衰老及促進(jìn)干細(xì)胞臨床應(yīng)用十分重要。現(xiàn)將近年來(lái)對(duì)干細(xì)胞衰老相關(guān)信號(hào)及分子機(jī)制的研究綜述如下。

1 干細(xì)胞的衰老

干細(xì)胞具有自我更新與多向分化的潛能，是再生醫(yī)學(xué)的核心組成部分，已被應(yīng)用于造血系統(tǒng)疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及免疫系統(tǒng)疾病等多種疾病的治療［1］。但是，如同體細(xì)胞一樣，干細(xì)胞也會(huì)衰老，并影響其增殖、分化及組織修復(fù)功能［2］。一方面，干細(xì)胞的衰老是機(jī)體衰老和功能障礙的重要驅(qū)動(dòng)因素，與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)［3］，譬如在特發(fā)性肺纖維化患者中可觀察到間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老，線粒體功能下降及DNA 損傷等；此外，間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老還可能是導(dǎo)致骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)化為白血病的重要原因［4-5］。另一方面，干細(xì)胞的衰老阻礙了其作為種子細(xì)胞在臨床治療中的應(yīng)用。TURINETTO 等［6］報(bào)道，在細(xì)胞治療過(guò)程中，需要體外擴(kuò)增大量的干細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)移植，然而，體外長(zhǎng)期培養(yǎng)易導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老，喪失其修復(fù)功能。因此，研究干細(xì)胞衰老的分子機(jī)制對(duì)于解開(kāi)機(jī)體衰老之謎以及促進(jìn)干細(xì)胞的臨床研究有重要的意義。

干細(xì)胞衰老具有以下特征：與體細(xì)胞衰老相同的是，細(xì)胞形態(tài)變得大而扁平，衰老相關(guān)標(biāo)志物β-半乳糖苷酶活性升高，細(xì)胞出現(xiàn)不可逆的增殖阻滯，細(xì)胞周期抑制基因表達(dá)上調(diào)［7］；而與體細(xì)胞不同的是，衰老還會(huì)影響干細(xì)胞的分化潛能，表現(xiàn)為成骨分化潛能下降，成脂分化潛能增強(qiáng)［8-9］。細(xì)胞衰老主要有兩種類型：復(fù)制性衰老和病理性衰老。復(fù)制性衰老指細(xì)胞隨著分裂次數(shù)的增加，會(huì)逐漸呈現(xiàn)出衰老狀態(tài)，屬于正常衰老；而病理性衰老指外界因素誘發(fā)的細(xì)胞衰老，其中外界因素主要包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）和輻射等［10-11］。對(duì)于干細(xì)胞的衰老機(jī)制，傳統(tǒng)的研究包括端粒酶活性及端粒縮短、氧化損傷、DNA 損傷、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡以及線粒體功能障礙等［12］，多為細(xì)胞水平上的機(jī)制。隨著干細(xì)胞衰老研究的深入，近年來(lái)，干細(xì)胞衰老相關(guān)機(jī)制逐漸轉(zhuǎn)為分子水平，如Nrf2 轉(zhuǎn)錄因子、Sirtuin 家族、Wnt/β-catenin 信號(hào)通路和p53/p21 信號(hào)通路等（表1）。本文主要綜述了近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與干細(xì)胞衰老相關(guān)的信號(hào)及分子機(jī)制，以期為建立新型抗干細(xì)胞衰老的策略及促進(jìn)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供思路。

2 干細(xì)胞衰老的分子機(jī)制

2.1 核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor，Nrf2）與干細(xì)胞衰老 Nrf2 是一種可以激活抗氧化基因的誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子，其活性主要由Keap1 蛋白負(fù)性調(diào)節(jié)［13］。Nrf2 具有調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用，并以此來(lái)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)各種生理過(guò)程，包括細(xì)胞的增殖、分化以及干性維持等［14-16］。

表1 干細(xì)胞衰老相關(guān)分子及信號(hào)調(diào)節(jié)途徑Tab.1 Stem cell senescence-related molecules and signal regulation pathways

研究［17］表明，Nrf2 可以延緩氧化應(yīng)激誘發(fā)的干細(xì)胞衰老，其作用主要是通過(guò)與抗氧化反應(yīng)原件（在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)細(xì)胞保護(hù)酶的順式作用原件）結(jié)合，上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)水平，從而降低細(xì)胞內(nèi)的ROS 含量。此外，Nrf2 還可以通過(guò)調(diào)節(jié)p53/p21 信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮其抗氧化作用。SHIN等［18］發(fā)現(xiàn)，Nrf2 蛋白表達(dá)的上調(diào)可通過(guò)降低細(xì)胞周期抑制因子p53 和p21 蛋白的表達(dá)，緩解細(xì)胞增殖阻滯，從而逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激誘發(fā)的間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老。另有研究報(bào)道，Nrf2 可與衰老相關(guān)sirtuin 家族成員Sirt6 蛋白及RNA 聚合酶Ⅱ形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，共同調(diào)節(jié)血紅素單加氧酶HO-1 的表達(dá)，延緩氧化應(yīng)激誘發(fā)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老［19］。這些研究表明，Nrf2 在調(diào)控干細(xì)胞的衰老過(guò)程中，除了通過(guò)調(diào)節(jié)p53/p21 信號(hào)通路之外，還可與Sirt6 相互作用。目前，Nrf2 抗衰老作用的相關(guān)研究主要針對(duì)氧化應(yīng)激誘發(fā)的干細(xì)胞衰老，而在復(fù)制性衰老及外界其他影響因素誘發(fā)的干細(xì)胞衰老中的作用，尚未見(jiàn)報(bào)道。

2.2 Sirtuin 家族與干細(xì)胞衰老 Sirtuin 家族最早在酵母中被發(fā)現(xiàn)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種生理過(guò)程，包括細(xì)胞凋亡、分化、糖原異生等。Sirtuin 家族成員在p53/p21、NF-κB、FoxO、PGC-1、mTOR 等衰老相關(guān)分子機(jī)制中均扮演了重要角色，其中Sirt1、Sirt2、Sirt3、Sirt6 等家族成員與細(xì)胞衰老密切相關(guān)。

Sirt1 是一種NAD 依賴性的組蛋白去乙?；福赏ㄟ^(guò)對(duì)組蛋白及其他細(xì)胞因子進(jìn)行去乙?；瘉?lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老、代謝等生理過(guò)程。研究表明，Sirt1 具有維持干細(xì)胞功能，延緩細(xì)胞衰老的作用［20］。ZHOU 等［21］報(bào)道，在H2O2誘發(fā)的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的早衰過(guò)程中，抑制Sirt1 的表達(dá)會(huì)上調(diào)p16 及p21 的表達(dá)水平，導(dǎo)致人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的早衰。此外，LIU 等［22］發(fā)現(xiàn)，Sirt1 可通過(guò)促進(jìn)p53 蛋白的泛素化降解來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞自噬能力，從而逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激誘發(fā)的人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老。表明Sirt1 在不同來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老中均發(fā)揮著重要作用。

Sirt2 主要參與細(xì)胞周期的調(diào)控。馬珊珊等［23］發(fā)現(xiàn)，Sirt2 的表達(dá)隨人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老而下調(diào)，且過(guò)表達(dá)Sirt2 可有效抑制人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老，促進(jìn)其增殖，但具體分子機(jī)制尚不明確。

Sirt3 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)于哺乳動(dòng)物線粒體中，并與哺乳動(dòng)物壽命相關(guān)的sirtuin 家族成員，具有延緩干細(xì)胞衰老的作用［24］。JUNG 等［25］報(bào)道，Sirt3 通過(guò)下調(diào)細(xì)胞線粒體內(nèi)的ROS 水平來(lái)延緩間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老，且Sirt3 的表達(dá)受EphB2/c-Src 信號(hào)通路與Nrf2 基因的正向調(diào)節(jié)。

Sirt6 在DNA 修復(fù)、端粒酶功能、基因組穩(wěn)定性和細(xì)胞衰老中起重要作用［26］。研究表明，Sirt6 隨骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老，表達(dá)顯著降低［27］；此外，ZHAI 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，敲減Sirt6 基因可導(dǎo)致人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老，使其增殖、遷移及氧化應(yīng)激抵抗能力受損。這表明Sirt6 可調(diào)節(jié)干細(xì)胞的衰老過(guò)程，有助于恢復(fù)衰老干細(xì)胞的活力。

2.3 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路與干細(xì)胞衰老 Wnt/βcatenin 信號(hào)通路是Wnt 信號(hào)通路中的經(jīng)典通路，參與干細(xì)胞的增殖、凋亡等生命過(guò)程［29］。在干細(xì)胞的衰老過(guò)程中，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)節(jié)p53/p21 信號(hào)通路、促炎因子的表達(dá)、mTOR 信號(hào)通路以及c-Myc 基因發(fā)揮作用。研究表明，在氯化鋰誘發(fā)的造血干細(xì)胞的衰老過(guò)程中，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的抑制可降低p53 及p21 的蛋白表達(dá)，減少ROS 的產(chǎn)生及DNA 損傷，從而緩解細(xì)胞衰老［30］。馬蓉潔等［31］報(bào)道，Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過(guò)增加促炎因子的分泌來(lái)調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的衰老?？梢?jiàn)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在不同干細(xì)胞的衰老中均起到重要調(diào)節(jié)作用。此外，另有研究表明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因c-Myc，是調(diào)控細(xì)胞周期與衰老的重要轉(zhuǎn)錄因子，其過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的衰老［32］。因此，c-Myc 也可能在干細(xì)胞的衰老過(guò)程中起到一定的調(diào)節(jié)作用。這些研究表明，調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以作為延緩干細(xì)胞衰老的潛在手段。

2.4 腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activatedprotein kinase，AMPK）與干細(xì)胞衰老 AMPK 即AMP 依賴的蛋白激酶，是生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子。研究表明，AMPK的破壞會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞的衰老枯竭，而激活A(yù)MPK可促進(jìn)衰老間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成纖維細(xì)胞，使其疤痕修復(fù)能力增強(qiáng)［33］。這表明了AMPK是恢復(fù)衰老干細(xì)胞年輕活力的重要靶標(biāo)。

AMPK 是細(xì)胞自噬，凋亡及增殖的潛在調(diào)節(jié)因子，在干細(xì)胞的衰老過(guò)程中，AMPK 主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬來(lái)發(fā)揮其調(diào)控作用。WHITE 等［34］報(bào)道，AMPK 通過(guò)對(duì)其下游靶標(biāo)蛋白p27kip1進(jìn)行磷酸化，保持細(xì)胞自噬與凋亡的平衡，從而減輕骨骼肌干細(xì)胞的衰老。BORODKINA 等［35］發(fā)現(xiàn)，AMPK 的活性受細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子的負(fù)調(diào)控，Ca2+離子水平降低會(huì)引起線粒體內(nèi)能量失衡，從而激活A(yù)MPK，使其磷酸化，促進(jìn)細(xì)胞自噬來(lái)防止人子宮內(nèi)膜來(lái)源干細(xì)胞的早衰。此外，AMPK 還被細(xì)胞內(nèi)Alpl 基因調(diào)控，Alpl 基因的缺失會(huì)導(dǎo)致AMPK 失活，進(jìn)而上調(diào)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞p16 以及p53 的表達(dá)水平，導(dǎo)致細(xì)胞衰老及衰老相關(guān)疾病的發(fā)生［36］?？梢?jiàn)，AMPK 在細(xì)胞內(nèi)受多種因素的調(diào)控，且在不同干細(xì)胞的衰老過(guò)程中，激活A(yù)MPK 均能起到延緩細(xì)胞衰老的作用。

2.5 p53/p21 信號(hào)通路與干細(xì)胞衰老 p53/p21 信號(hào)通路也參與了細(xì)胞衰老過(guò)程的調(diào)節(jié)。研究表明，敲減腫瘤抑制因子p53 后，可下調(diào)p21 的表達(dá)，抑制細(xì)胞自噬，減輕間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的衰老［37］。但p21 基因不是p53 誘發(fā)細(xì)胞衰老的唯一途徑，KIM 等［38］發(fā)現(xiàn)在成纖維細(xì)胞中，p53 可以同時(shí)調(diào)節(jié)p21 蛋白和蛋白激酶B，而P21 和蛋白激酶B 分別調(diào)控細(xì)胞周期及ROS 水平，從而誘發(fā)細(xì)胞衰老。

調(diào)控p53/p21 信號(hào)通路是延緩干細(xì)胞衰老的有效方法。研究表明，膽固醇及氫氣均通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)ROS 的積累，下調(diào)p53 和p21 蛋白的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)細(xì)胞增殖阻滯，延緩骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老［39-40］。在干細(xì)胞的衰老過(guò)程中，p53/p21 信號(hào)通路也受多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)。上文已提到Nrf2、Sirt1、AMPK 及Wnt/β-catanin 信號(hào)通路皆可通過(guò)調(diào)節(jié)p53/p21 信號(hào)通路來(lái)調(diào)控干細(xì)胞的衰老。此外，NFκB 信號(hào)的激活也會(huì)上調(diào)p53 和p21 蛋白的表達(dá)水平，導(dǎo)致人牙髓干細(xì)胞的衰老［41］。因此，在干細(xì)胞衰老的信號(hào)分子調(diào)控過(guò)程中，p53/p21 信號(hào)通路是各調(diào)節(jié)途徑潛在交互作用的重要節(jié)點(diǎn)。

2.6 其他信號(hào)分子與干細(xì)胞衰老 Nanog 蛋白因具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制與DNA 損傷修復(fù)的作用，也在細(xì)胞衰老過(guò)程中扮演了重要角色。研究表明，Nanog 蛋白通過(guò)下調(diào)p27 蛋白（控制細(xì)胞從G1 期進(jìn)入S 期的細(xì)胞周期依賴性蛋白酶抑制因子）的表達(dá)，抑制小鼠成纖維細(xì)胞的衰老［42］。SHAHINI 等［43］發(fā)現(xiàn)，Nanog 可逆轉(zhuǎn)間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老，恢復(fù)其肌源性分化潛能。

MicroRNAs 是一種小的非編碼RNA 片段，其可通過(guò)調(diào)節(jié)p53/p21 或pRB/p16 信號(hào)途徑來(lái)調(diào)控細(xì)胞衰老過(guò)程，因此，microRNAs 被認(rèn)為是衰老的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑［44］。目前已報(bào)道多個(gè)microRNA 具有調(diào)節(jié)干細(xì)胞衰老的作用，如miR-27b、miR-195 及miR-495，但它們?cè)诟杉?xì)胞中調(diào)控衰老的方式均有不同。miR-27b 通過(guò)上調(diào)衰老間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)p16及MAPK3 的表達(dá)，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老［44］。miR-195則通過(guò)抑制端粒酶的活性，導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老，使其增殖與分化潛能喪失［45］。miR-495 被報(bào)道也參與了間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)，其主要通過(guò)抑制細(xì)胞周期及促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)誘發(fā)間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老［46］。這些研究表明了microRNAs 在干細(xì)胞的衰老中主要起促進(jìn)作用。

此外，Notch 信號(hào)通路的激活可降低p16 及p21 蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化，防止間充質(zhì)干細(xì)胞在長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)老化［47］。JIN 等［48］報(bào)道，在缺氧培養(yǎng)環(huán)境中，多梳抑制復(fù)合物BMI1 可通過(guò)下調(diào)MKP-1 表達(dá)，激活p38 MAP 激酶，使環(huán)氧合酶-2 的表達(dá)上調(diào)，并刺激前列腺素PGE2 的生成，從而增強(qiáng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力，緩解衰老狀態(tài)。YANG 等［49］發(fā)現(xiàn)在D-半乳糖誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老中，激活A(yù)KT/mTOR 通路可減少細(xì)胞內(nèi)ROS 的積累，抑制間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

現(xiàn)代社會(huì)，人口老齡化日益加重，由衰老引發(fā)的相關(guān)疾病極大的降低了人們的生存質(zhì)量，造成了社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)急劇增長(zhǎng)，已成為影響社會(huì)發(fā)展的嚴(yán)重問(wèn)題。因此，延緩衰老成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。機(jī)體干細(xì)胞能夠維持體細(xì)胞的不斷更新，其衰老枯竭可能是生命體衰老的根本原因。因此，延緩干細(xì)胞的衰老是抗衰老研究的重要突破口。盡管目前對(duì)干細(xì)胞衰老的認(rèn)識(shí)已取得一定進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)并闡明多個(gè)信號(hào)分子及多條信號(hào)途徑與干細(xì)胞的衰老密切相關(guān)（表1），但仍然存在以下一些問(wèn)題亟待解決：（1）是否存在新的衰老信號(hào)分子或信號(hào)通路？（2）干細(xì)胞衰老往往涉及多種信號(hào)通路，如何闡明各信號(hào)通路間的交互作用？（3）干細(xì)胞衰老和機(jī)體衰老間的精密作用機(jī)制到底如何？（4）不同干細(xì)胞衰老的機(jī)制不盡相同，造成這種差異的根本原因是什么？但筆者相信，隨著干細(xì)胞衰老研究的不斷深入和抗衰老策略的持續(xù)開(kāi)發(fā)，加快干細(xì)胞的臨床應(yīng)用以及實(shí)現(xiàn)延緩人類衰老的目標(biāo)正漸行漸近。