吳于青 姜國強 宗佩蘭

江西省胸科醫(yī)院結(jié)核科（南昌330006）

超敏反應(yīng)是結(jié)核病患者在治療過程中常見不良反應(yīng)之一，約占抗結(jié)核藥物不良反應(yīng)的15%［1-3］；目前臨床上對于抗結(jié)核藥物超敏反應(yīng)患者識別致敏藥物主要依靠藥物激發(fā)試驗［4］，但有再次引起超敏反應(yīng)甚至過敏性休克的可能，不僅延長患者住院時間，更有患者因此放棄治療，不利于我國結(jié)核病的防控。由于抗結(jié)核藥物是聯(lián)合應(yīng)用，如何快速、安全、準確的找出致敏藥物是臨床醫(yī)師急需解決的難題。目前對于抗結(jié)核藥物超敏反應(yīng)診斷體外檢測方法常用的有藥物斑貼試驗［5］和藥物淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗（drug lymphocyte transformation test，DLTT），但敏感性都太低，甚至DLTT 被認為沒有意義［6-7］。所以臨床有必要采用其他的體外檢測方法進行驗證。由于抗結(jié)核藥物超敏反應(yīng)主要為遲發(fā)型超敏反應(yīng)，由抗原特異性T 細胞介導，在致敏藥物刺激后，藥物特異性的T 淋巴細胞活化并在其表面表達多個活化標記，如CD25、CD69、CD71、CD40L 等，對這些活化標記的檢測可以判斷淋巴細胞的活化情況，從而識別出致敏藥物。

本實驗通過對抗結(jié)核藥物超敏反應(yīng)患者檢測可疑藥物刺激前后外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中CD69、CD40L 分子的表達變化，據(jù)此來識別可能的致敏藥物，并將結(jié)果與藥物激發(fā)試驗比較，評價其在識別此類患者致敏藥物中的敏感性與特異性，為臨床尋找有價值的抗結(jié)核藥物超敏反應(yīng)體外檢測方法。

1 對象與方法

1.1 研究對象 抗結(jié)核治療過程中出現(xiàn)超敏反應(yīng)的初治肺結(jié)核患者，根據(jù)臨床表現(xiàn)及實驗室檢查符合藥物超敏反應(yīng)診斷［8-9］，并由2 名專科醫(yī)師共同診斷。最終納入26 例患者為病例組，男18 例，女8 例［1］，平均年齡（40.3 ± 4.6）歲，抗結(jié)核治療方案均為2H（異煙肼）R（利福平）Z（吡嗪酰胺）E（乙胺丁醇）/4HR。對照組為10 例抗結(jié)核治療2 個月未出現(xiàn)超敏反應(yīng)的初治肺結(jié)核患者，男7 例，女3 例，平均年齡（39.2±5.7）歲。所有入選患者在治療過程中除服用抗結(jié)核藥物外未服用其他任何藥物，未使用免疫抑制劑。本研究經(jīng)江西省胸科醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均簽訂知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 完全RPMI-1640培養(yǎng)基（含新生牛血清，雙抗）（凱基生物，Cat：KGM31800S-500）；人外周血淋巴細胞分離液：（Solarbio，貨號：P8900）；植物血球凝集素（PHA）（aladdin，Lot：C1418057）；異煙肼片（云鵬制藥，國藥準字：H14020769）；吡嗪酰胺膠囊（沈陽紅旗制藥有限公司；國藥準字H20122352）；鹽酸乙胺丁醇膠囊（沈陽紅旗制藥有限公司；國藥準字H21021909）；利福平膠囊（上海延安藥業(yè)有限公司；國藥準字H31020036）；CD40L（BD Biosciences，555699）；CD69（BioLegend，310905）；快速瑞氏染液（KGA225，凱基生物）；CO2培養(yǎng)箱（BPN-80CWCUV，上皓莊儀器有限公司）；離心機（TD4A常州中提實驗儀器）標準型雙人單面超凈工作臺（SW-CJ-2FD）；三目倒置顯微鏡（XDZ-103，上海領(lǐng)成生物科技有限公司）；顯微鏡（CX41，OLYMPUS）；NovoCyteTM流式細胞儀（艾森生物（杭州）有限公司，NovoCyte 2060R）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗藥物的制備 取患者所用可疑藥物的單次劑量，用5 mL 雙蒸水劇烈震蕩溶解，再用0.22 μm 濾器過濾除菌，用RPMI 1640 培養(yǎng)液等比稀釋。

1.3.2 PBMC 分離、細胞鑒定及培養(yǎng) 采用密度梯度離心法從患者肝素抗凝的血標本中分離外周血單個核細胞（PBMC），1×PBS 洗滌后，重懸于2 mL RPMI 1640 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清+青鏈霉素）并計數(shù)，同時用快速瑞氏染色法對細胞鑒定后，調(diào)整細胞濃度至1 × 106/mL（部分用于檢測藥物刺激前PBMC中CD69、CD40L的表達）。在96孔板中，每孔加入1×105/100 μL，分別設(shè)置陰性對照孔（相同濃度的藥物溶解介質(zhì)50 μL+培養(yǎng)液50 μL+細胞100 μL）、陽性對照孔（5 μg/mL 的PHA 50 μL+培養(yǎng)液50 μL+細胞100 μL）、異煙肼孔（異煙肼50 μL+培養(yǎng)液50 μL+細胞100 μL）、利福平孔（利福平50 μL+培養(yǎng)液50 μL+細胞100 μL）、吡嗪酰胺孔（吡嗪酰胺50 μL+培養(yǎng)液50 μL+細胞100 μL）和乙胺丁醇孔（乙胺丁醇50 μL+培養(yǎng)液50 μL+細胞100 μL），每組均設(shè)3 個復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)。

1.3.3 流式細胞儀檢測分析 離心獲取細胞沉淀，然后重懸調(diào)整細胞濃度為每管1 × 106/mL，取細胞懸液100 μL，各加入2 種不同熒光標記抗體各20 μL（FITC 標記抗人CD40L 單抗+ FITC 標記抗人CD69 單抗），混勻，冰上避光孵育30 min；1 000 r/min 離心10 min，獲取有核細胞，PBS 洗滌2 次后棄上清，加入1 mL PBS 將細胞懸浮，然后加入0.4 mL 1%多聚甲醛于4 ℃固定30 min，然后用流式細胞儀測試后分析結(jié)果。

1.4 藥物激發(fā)試驗 病例組患者在抗過敏治療超敏反應(yīng)消退后進行藥物激發(fā)試驗，找出致敏藥物。

1.5 統(tǒng)計學方法 根據(jù)檢測結(jié)果繪制受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線），找出最佳的檢測閾值。采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，用t檢驗比較組間差異，結(jié)果以（x ± s）表示。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞鑒定 如圖1所示，單核細胞漿呈灰藍色，胞漿中顆粒呈細小淡紫紅色或藍紫色。

圖1 瑞氏染色細胞鑒定Fig.1 Rayleigh staining cell identification

2.2 患者PBMC 中CD40L 和CD69 的表達 在藥物刺激孵育前，病例組和對照組兩組患者的PBMCS中CD40L和CD69的表達差異無統(tǒng)計學意義（t=0.55，P＞0.05）。兩組患者的PBMCs 分別與抗結(jié)核藥物異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇共孵育6 h 后用流式細胞儀檢測CD40L 和CD69 的表達，并根據(jù)后期藥物激發(fā)試驗結(jié)果將流式細胞檢測結(jié)果分為致敏藥物組和非致敏藥物組；與對照組相比，致敏藥物組患者PBMCs 中表達CD40L、CD69 的細胞比例明顯升高（t=14.21，P＜0.05），而非致敏藥物組PBMC 中表達CD40L、CD69 的細胞比例差異無統(tǒng)計學意義（t=1.53，P＞0.05），同時致敏藥物組與非致敏藥物組相比差異有統(tǒng)計學意義（t=15.24，P＜0.05）。見表1。

表1 患者PBMC 經(jīng)可疑藥物刺激6 h 后CD40L 與CD69 表達比較Tab.1 Comparison of CD40L and CD69 expression in patients with PBMC stimulated by suspicious drugs for 6 hours ±s，%

表1 患者PBMC 經(jīng)可疑藥物刺激6 h 后CD40L 與CD69 表達比較Tab.1 Comparison of CD40L and CD69 expression in patients with PBMC stimulated by suspicious drugs for 6 hours ±s，%

注：與非致敏藥物組比較，*t=15.24，*P＜0.05

組別對照組致敏藥物組非致敏藥物組例數(shù)10 26 78（CD69+CD40L-）+（CD69-CD40L+）+（CD69+CD40L+）t 值P 值12.43±4.16 43.37±8.85*15.22±5.57 14.21 1.53＜0.05＞0.05

2.3 繪制ROC 曲線 根據(jù)檢測結(jié)果通過SPSS 軟件繪制ROC 曲線，判斷Cut-off 值為35%時具有較好的敏感度和特異度。計算方法：靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）=73.08%，特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）=90.00%。見圖2。

2.4 CD69、CD40L 檢測在識別患者致敏藥物的靈敏度與特異度 根據(jù)ROC 曲線結(jié)果，在抗結(jié)核藥物刺激患者外周血單個核細胞后，當流式細胞儀檢測的（CD69+CD40L-）+（CD69-CD40L+）+（CD69+CD40L+）細胞總數(shù)比例≥35%時，該方法檢測致敏藥物的靈敏度=73.08%，特異度=90.00%（表2）。圖3可見1 例對照組患者的PBMCS 在4 種抗結(jié)核藥物分別刺激后，表達的CD69+、CD40L+細胞比例均在35%以內(nèi)；圖4可見1 例抗結(jié)核藥物超敏反應(yīng)患者的PBMCS 在利福平膠囊刺激后，（CD69+CD40L-）+（CD69-CD40L+）+（CD69+CD40L+）細胞總數(shù)明顯升高，后經(jīng)藥物激發(fā)試驗證實為利福平過敏。

圖2 CD69+/CD40L+T 細胞比例識別抗結(jié)核藥物誘導超敏反應(yīng)中致敏藥物的ROC 曲線Fig.2 CD69/CD40L T cell ratio recognition of antituberculous drug induced hypersensitivity by ROC curve

表2 CD69、CD40L 分子檢測對抗結(jié)核藥物誘導超敏反應(yīng)致敏藥物識別的價值Tab.2 The value of CD69，CD40L molecular detection in the identification of antituberculotic drug induced hypersensitivity 例

3 討論

圖3 對照組在藥物刺激后PBMC 細胞中兩種抗體表達情況Fig.3 Expression of two antibodies in PBMC cells after drug stimulation in control group

圖4 1 病例組患者在藥物刺激后PBMC 細胞中兩種抗體表達情況后經(jīng)DPT 證實對利福平過敏Fig.4 In one case，the expression of two antibodies in PBMC cells after drug stimulation was confirmed by DPT as an allergy to rifampicin

抗結(jié)核藥物導致的超敏反應(yīng)主要表現(xiàn)為Ⅳ型（遲發(fā)型）超敏反應(yīng)［10-11］，是由T 細胞介導；藥物作為抗原或半抗原初次接觸T 細胞后引起T 細胞活化，形成藥物特異性T 細胞克隆長期存留于組織和血液中。當記憶性T 細胞再次接觸致敏藥物后便迅速活化，產(chǎn)生不同的炎癥因子而引起各種臨床表現(xiàn)。CD69 分子是T 淋巴細胞的早期活化標記，淋巴細胞在受到致敏藥物的刺激并活化后，淋巴細胞表面CD69 表達明顯增加，因此可用來評價個體細胞免疫應(yīng)答的功能和是否對該刺激藥物過敏［15］，說明通過檢測該分子在藥物誘導的遲發(fā)型超敏反應(yīng)患者外周血淋巴細胞表面的表達變化的可用于遲發(fā)型超敏反應(yīng)的診斷和識別致敏藥物。研究表明，在機體的細胞免疫中，當抗原提呈細胞（APC）把抗原提呈給幼稚T 細胞并形成MHC-TCR復(fù)合物時，T 淋巴細胞表面的CD40L 分子表達上調(diào)，在復(fù)合物形成后的四小時內(nèi)，T 細胞表面的CD40L 與抗原提呈細胞表面的CD40 結(jié)合，并刺激抗原提呈細胞產(chǎn)生協(xié)同刺激分子，在抗原和協(xié)同刺激信號的雙重作用下，T 細胞被激活，成為針對此抗原的殺傷性T 細胞，產(chǎn)生相應(yīng)的細胞因子和發(fā)揮效應(yīng)功能［12-13］。流式細胞法已廣泛用于T 細胞表面分子或細胞因子的檢測［14］，因此，通過檢測這些表面分子便可了解T 細胞的活化狀態(tài)，從而幫助識別出致敏藥物。

本研究運用流式細胞術(shù)檢測抗結(jié)核藥物超敏反應(yīng)患者外周血PBMCs 中CD69 與CD40L 的表達，根據(jù)后期患者進行藥物激發(fā)試驗的結(jié)果對流式細胞結(jié)果進行分組，分為致敏藥物組和非致敏藥物組，發(fā)現(xiàn)經(jīng)藥物刺激后致敏藥物組PBMCs中表達CD69+與CD40L+的細胞比例明顯增高（43.37 ± 8.85）%，與對照組（12.43 ± 4.16）%、非致敏藥物刺激組（15.22±5.57）%比較差異均存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而對照組與非致敏藥物刺激組患者比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示正常情況下藥物特異性T 淋巴細胞處于靜止狀態(tài)，并沒有明顯的活化。而經(jīng)過特異性抗原刺激后T 淋巴細胞活化，研究表明2 h 后即可檢測到細胞膜表面CD69+與CD40L+表達上調(diào)，6～8 h 后達到高峰，所以本次實驗中藥物與PBMCs 孵育時間選擇為6 h。根據(jù)ROC 曲線，在CD69+或CD40L+細胞比例的Cut-off 值為35%時，該檢測識別致敏藥物的敏感性為73.08%，特異性為90.00%，提示抗結(jié)核藥物超敏反應(yīng)患者外周血單個核細胞經(jīng)可疑的致敏藥物刺激后，通過檢測CD69+、CD40L+水平對識別此類患者的致敏藥物有一定的臨床價值，并且敏感性較DLTT 明顯升高，考慮DLTT 敏感性低的原因在于：在PBMCs 中，即使有藥物特異性的T 細胞出現(xiàn)，DLTT 的T 細胞并不足以被檢測到細胞分裂，所以會產(chǎn)生假陰性的結(jié)果，而T 細胞在抗原刺激活化后，表面形貌產(chǎn)生變化，增高增大，細胞表面的CD40L、CD69 等分子表達短時間內(nèi)迅速增加聚集，因此將其作為T 細胞活化表征來作為檢測標記敏感性高且更有診斷價值。但因本次研究樣本量較少，同時藥物與T 細胞共刺激的時間選擇多長，檢測的敏感性才最高有待于擴大樣本量進一步研究驗證。

總之，藥物超敏反應(yīng)的體外檢測方法種類繁多，不同的體外檢測方法對不同種類藥物的敏感性及特異性均不相同，對于抗結(jié)核藥物誘導的超敏反應(yīng)致敏藥物的識別哪些體外檢測方法最佳有待于進一步研究。