徐曉南，王夢琳，張 丁

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院口腔科，北京 100730

牙周膜是圍繞牙根并連接牙與牙槽骨的致密結(jié)締組織[1]，是感應(yīng)力和生物刺激的重要結(jié)構(gòu)，對維持牙周環(huán)境穩(wěn)定和信號的傳導(dǎo)起著重要作用。健康牙周組織可以維持骨代謝的動態(tài)平衡，但炎癥微環(huán)境中骨平衡被打破，骨吸收大于骨沉積，骨量進(jìn)行性吸收[2]，慢性牙周炎患者常表現(xiàn)為牙槽骨吸收，牙齒松動移位，出現(xiàn)牙間隙和早接觸[3]，牙周病的治療中常常需要正畸醫(yī)師配合治療關(guān)閉牙間隙，消除合干擾。認(rèn)識炎癥對牙周組織改建的作用機制對于正畸醫(yī)生在臨床上合理判斷牙周炎患者正畸治療風(fēng)險及正確選擇適應(yīng)證尤為重要。

促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞激酶受體(erythropoietin producing hepatocyte kinase receptors，Eph)是酪氨酸激酶受體家族中最大的亞族[4]，目前在人類基因組中已發(fā)現(xiàn) Eph 家族蛋白有14種受體[EphA(A1～A8)，EphB(B1～B6)]，8種配體[ephrinA(A1～A5)，ephrinB(B1～B3)]。Eph和ephrin 配體間的雙向信號傳導(dǎo)依賴于細(xì)胞的接觸，可以影響細(xì)胞骨架和細(xì)胞與基質(zhì)的附著[5]。在炎癥反應(yīng)中，Eph/ephrin 能松懈內(nèi)皮或上皮屏障，促進(jìn)白細(xì)胞的滲透和向組織的遷徙[6- 7]，目前的研究多局限在肺損傷模型[8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Eph 家族可以通過調(diào)控成骨-破骨耦聯(lián)活動參與骨改建過程[9]，EphB4/ephrinB2可以抑制骨吸收、促進(jìn)骨形成，EphA2/ephrinA2則促進(jìn)骨吸收、抑制骨形成，Eph/ephrin 在炎癥狀態(tài)骨吸收過程中承擔(dān)重要角色，但目前對 Eph 家族在炎癥牙槽骨改建作用的研究較少。

本研究通過在體外構(gòu)建人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblasts，hPDLFs)炎癥模型，觀察了炎癥微環(huán)境中牙周膜成纖維細(xì)胞EphB4、ephrinB2、EphA2、ephrinA2在mRNA和蛋白水平隨時間的變化趨勢，探討了腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-β)對hPDLFs Eph家族表達(dá)的影響，為進(jìn)一步深入研究Eph家族蛋白在炎癥環(huán)境中引起牙槽骨改建的具體作用機制提供生物理論基礎(chǔ)。

材料和方法

主要材料和儀器hPDLFs(美國ScienCell公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(美國Gibico公司)，炎癥因子(TNF-α、IL- 1β，美國 Peprotech公司)，Trizol(美國Ambion)，PCR相關(guān)試劑盒(美國Promega公司)，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(美國Jackson公司)，EA2、ERA2、EB4、ERB2抗體(兔來源，英國 Abcam公司)，酶標(biāo)儀(美國Varioskan Flash公司)，分光光度計(中國美譜達(dá)公司)，7500fast實時熒光定量基因擴增儀(美國 Applied Biosystems abi公司)，恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo scientific公司)，生物安全柜(美國Bakes公司)，倒置相差顯微鏡(德國Leica公司)。

hPDLFs的培養(yǎng)采用完全培養(yǎng)基(89% DMEM+10% FBS+1% PS)培養(yǎng)hPDLFs，倒置相差顯微鏡在100倍下觀察hPDLFs的生長情況和形態(tài)特征，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶80%～90%傳代，實驗用第5代細(xì)胞。

體外炎癥模型建立將hPDLFs消化離心后制成細(xì)胞懸液，以2×104/ml的細(xì)胞密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至80% 左右時分別加入10 ng/ml TNF-α和10 ng/ml IL- 1β炎癥刺激，設(shè)立空白對照組(0 h)，培養(yǎng)時間為1、2、6、12、24 h。

Real-time PCR檢測Eph受體和ephrin配體mRNA的表達(dá)變化Trizol法提取細(xì)胞總RNA，采用分光光度計測OD260/OD280、OD260/OD230，判斷RNA純度和濃度，以DEPC水為空白對照，OD260/OD280=1.8～2.2，OD260/OD230 >2用于后續(xù)實驗。PCR所用引物采用Primer軟件設(shè)計(表1)。使用Promega公司RT-PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，95℃預(yù)變性2 min，95℃ 3 s，60℃延伸30 s，熱循環(huán)49次。采用2-△△CT法進(jìn)行相對定量分析，以GAPDH為內(nèi)參基因，檢測待測樣品中目的基因的表達(dá)水平。

Western blot觀察Eph受體及ephrin配體的蛋白表達(dá)變化采用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)提取細(xì)胞蛋白，按照BCA法測定蛋白濃度，以RIPA調(diào)整蛋白濃度，樣品終濃度為1 μg/μl，加入5×蛋白樣品緩沖液，95℃ 5 min。根據(jù)目的蛋白的相對分子質(zhì)量，配制10% 分離膠，5%濃縮膠，蛋白樣品以每孔10 μg上樣，濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓120 V，通過預(yù)染蛋白marker來確定電泳停止時間。300 mA恒流90 min將電泳膠的蛋白轉(zhuǎn)移至PVCF膜，將膜完全浸沒于5% BSA-TBST中，水平搖床孵育1 h(RT)進(jìn)行封閉。之后5% BSA-TBST稀釋一抗(EA2、ERA2、EB4、ERB2、GAPDH)，4℃水平搖床孵育過夜。次日洗膜后室溫孵育二抗山羊抗兔IgG 40 min，將TBST漂洗好的膜置于暗盒，在膜表面滴加ECL反應(yīng)3 min，膠片曝光顯影，應(yīng)用軟件Gel Image system ver.4.00對圖像進(jìn)行灰度分析，計算目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值間的比值。

表1 PCR相關(guān)引物Table 1 The related primers of PCR

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，實驗重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVE)，P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義，應(yīng)用Graphpad Prism軟件繪制數(shù)據(jù)圖。

結(jié) 果

hPDLFs形態(tài)學(xué)觀察在倒置顯微鏡下觀察hPDLFs的形態(tài)，結(jié)果顯示實驗所用第5代細(xì)胞生長情況良好，細(xì)胞貼壁生長，貼壁后初期呈星形，逐漸成長為梭形，胞漿豐滿，彼此交聯(lián)接觸(圖1)。

炎癥因子刺激下hPDLFs Eph受體和ephrin配體mRNA的表達(dá)情況在10 ng/ml TNF-α和10 ng/ml IL- 1β刺激下，hPDLFs細(xì)胞膜上的Eph受體和ephrin配體在mRNA水平發(fā)生時間依賴性變化(圖2)，兩種刺激引起的變化趨勢相似。TNF-α刺激hPDLFs 24 h內(nèi)，ephrinA2 mRNA隨刺激時間增加表達(dá)量逐漸升高(F=57.229，P<0.05)，且1 h內(nèi)就有明顯變化；IL- 1β刺激組在6 h時才出現(xiàn)明顯升高(F=13.257，P<0.05)；24 h時 TNF-α組的表達(dá)量明顯高于 IL- 1β組(P<0.05)。EphB4 mRNA表達(dá)在 TNF-α作用1 h時出現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象，之后呈時間依賴性下降趨勢(F=20.141，P<0.05)；IL- 1β組在短時間內(nèi)有小波動，1 h后較 TNF-α組緩慢的下降，24 h時的表達(dá)量兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。EphA2(F=2.444，P>0.05)及 ephrinB2 mRNA表達(dá)量(F=3.048，P>0.05)在24 h內(nèi)有小幅度變化，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

hPDLFs：人牙周膜成纖維細(xì)胞

hPDLFs：human periodontal ligament fibroblast

A.貼壁初期；B.6 d

A. initial stage；B.6 d

圖1hPDLFs的形態(tài)(×100)

Fig1Morphology of hPDLFs(×100)

TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL- 1β：白細(xì)胞介素1β；Eph：促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞激酶受體；組內(nèi)與0 h比較，aP<0.05；同時刻組間比較，bP<0.05

TNF-α：tumor necrosis factor-α；IL- 1β：interleukin- 1β；Eph：erythropoietin-producing hepatocyte kinase receptors；aP<0.05 compared with 0h within the group；bP<0.05 compared with different group at the same time

圖2炎癥因子對hPDLFs Eph家族基因表達(dá)的影響

Fig2Effects of inflammatory factors on gene expression of hPDLFs Eph family

TNF-α刺激下hPDLFs Eph受體和ephrin配體蛋白的表達(dá)情況Western blot檢測結(jié)果顯示，ephrinA2 和EphB4蛋白水平與基因表達(dá)基本趨勢一致，但蛋白水平的表達(dá)變化稍滯后于基因水平的變化。隨刺激時間增加，ephrinA2的蛋白量逐漸增加(F=5.921，P>0.05)，EphB4在6 h內(nèi)蛋白表達(dá)增加，6 h后呈下降趨勢，降至24 h時明顯低于0 h表達(dá)量(F=83.72，P<0.05)(圖3)。

IL- 1β刺激下hPDLFs Eph受體和ephrin配體蛋白的表達(dá)情況Western blot檢測結(jié)果顯示，ephrinA2和EphB4的蛋白水平與基因表達(dá)趨勢一致，隨刺激時間增加，ephrinA2的蛋白量逐漸增加(F=23.731，P<0.05)，EphB4在短時間內(nèi)蛋白表達(dá)量增加，6 h后逐漸下降，降至24 h時的表達(dá)量仍明顯高于0 h(F=47.339，P<0.05)(圖4)。

討 論

目前研究常采用單一炎性因子或多種因子共同刺激實驗細(xì)胞構(gòu)建體外細(xì)胞炎癥模型[10]，其中以TNF-α和IL最為常用。TNF-α是一種內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，刺激黏附分子的分泌和趨化因子的產(chǎn)生[11]，可以誘導(dǎo)花生四烯酸代謝產(chǎn)物包括前列腺素E2產(chǎn)生，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶同時激活破骨細(xì)胞，導(dǎo)致牙周組織破壞[12]。有學(xué)者比較不同質(zhì)量濃度的TNF-α對牙周膜干細(xì)胞成骨能力的影響，發(fā)現(xiàn)濃度越高抑制成骨能力越強，質(zhì)量濃度為10 ng/ml時，成骨抑制效果最顯著[13]。IL- 1β是免疫應(yīng)答過程中的協(xié)調(diào)細(xì)胞因子，當(dāng)受到炎癥刺激時，IL- 1β可以影響細(xì)胞凋亡、增殖和分化，促進(jìn)血管形成，增加吞噬細(xì)胞的募集，調(diào)控免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[14]。本研究中采用高濃度IL- 1β(10 ng/ml)和TNF-α(10 ng/ml)分別刺激牙周膜成纖維細(xì)胞構(gòu)建炎癥模型，比較了兩種炎癥因子引起牙周膜成纖維細(xì)胞Eph家族表達(dá)變化的差異。

以往在內(nèi)皮和上皮細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，炎癥早期階段，EphA2和ephrinB2過表達(dá)，炎癥晚期時EphB4表達(dá)降低，引起細(xì)胞間信號傳導(dǎo)的轉(zhuǎn)變發(fā)生炎癥反應(yīng)[8，15]。本研究結(jié)果顯示，炎癥因子刺激24 h內(nèi)，ephrinA2基因表達(dá)和蛋白表達(dá)均呈遞增趨勢，EphB4的表達(dá)在短時間內(nèi)出現(xiàn)升高，之后呈時間依賴性遞減趨勢，EphA2和ephrinB2的表達(dá)無明顯變化。這種差異可能是由于外胚間充質(zhì)來源的 hPDLFs在炎癥微環(huán)境中的應(yīng)答行為與上皮和內(nèi)皮細(xì)胞不同有關(guān)。

Mr：相對分子質(zhì)量；與0 h相比，aP<0.05

Mr：relative molecular mass；aP<0.05 compared with 0 h

圖3炎癥因子TNF-α對hPDLFs中Eph家族蛋白表達(dá)的影響

Fig3Effects of TNF-α on protein expression of Eph family in hPDLFs

與0 h相比，aP<0.05

aP<0.05 compared with 0 h

圖4炎癥因子IL- 1β對hPDLFs中Eph家族蛋白表達(dá)的影響

Fig4Effects of IL- 1β on protein expression of Eph family in hPDLFs

2006年，Zhao等[16]和Mao等[17]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞上ephrinB2配體介導(dǎo)的反向信號可抑制破骨細(xì)胞的形成，EphB4受體介導(dǎo)的正向信號可以增強成骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收[18]。Wang等[19]在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，在炎癥微環(huán)境中EphB4的表達(dá)減少，抑制成骨活性，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，延遲骨再生。EphA2/ephrinA2雙向傳導(dǎo)作用可以促進(jìn)骨吸收，同時抑制成骨細(xì)胞形成[20]。Gao 等[21]在實驗中發(fā)現(xiàn)，牙周病致病菌牙齦卟啉單胞菌的脂多糖可以上調(diào)EphA2的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，抑制成骨細(xì)胞分化。Irie等[22]通過體外誘導(dǎo)實驗證明，ephrinA2介導(dǎo)的反向信號可以顯著促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成，EphA2的正向信號發(fā)揮抑制成骨細(xì)胞分化的效應(yīng)。本研究結(jié)果與以上研究相符，牙周膜細(xì)胞在TNF-α及IL- 1β刺激下，促進(jìn)骨吸收的ephrinA2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)呈時間依賴性增強，而促進(jìn)骨形成的EphB4則在短時間表達(dá)應(yīng)激增高后呈下降趨勢。此結(jié)果解釋了炎癥環(huán)境中骨吸收強于骨形成，骨平衡被打破，牙槽骨進(jìn)行性吸收的臨床現(xiàn)象。

有學(xué)者在體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)，敲除Efnb2(編碼ephrinB2配體)基因的小鼠破骨細(xì)胞分化強，但其骨組織表型與野生型小鼠無明顯差異。Zhao等[16]認(rèn)為這可能是因為在破骨細(xì)胞分過程中，ephrinB1 介導(dǎo)的反向信號與ephrinB2 相似或者有其他的補償因子可以維持體內(nèi)的骨平衡。在Wang等[19]研究在炎癥環(huán)境下阻斷 ephrinB2 配體的表達(dá)，結(jié)果并不影響骨改建和骨再生的情況，作者認(rèn)為在炎癥狀態(tài)下存在其他信號因子可以補償 ephrinB2 的功能。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果相似，hPDLFs 在炎癥刺激下 ephrinB2的表達(dá)無變化，可能是因為其他補償信號因子較早做出應(yīng)答，或受旁分泌等影響。本研究結(jié)果顯示hPDLFs 在炎癥刺激 24 h 內(nèi)，ephrinA2 隨刺激時間增加表達(dá)增強，而 EphA2 的表達(dá)并無明顯變化，可推測在炎癥微環(huán)境初期，hPDLFs 通過細(xì)胞膜上ephrinA2 介導(dǎo)的反向信號朝破骨向分化。近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，牙周膜細(xì)胞 ephrinA2 在 LPS 刺激 24 h 內(nèi)顯著高表達(dá)[23]，與本研究結(jié)果一致，48 h 后 EphA2 的表達(dá)開始顯著增加，該作者提出牙周膜細(xì)胞在炎癥環(huán)境初期 ephrinA2 介導(dǎo)的反向信號促進(jìn)骨吸收，之后通過 EphA2 正向信號抑制骨形成的可能。本研究在 24 h 內(nèi)未觀察到 EphA2 基因和蛋白水平的表達(dá)變化，在后續(xù)實驗中需觀察更長時間的表達(dá)情況。

本研究中，IL- 1β和TNF-α兩種炎癥因子引起 hPDLFs中Eph家族基因和蛋白的表達(dá)變化趨勢相似，但 TNF-α作用下 Eph 受體和 ephrin 配體的基因應(yīng)答更早，變化趨勢更顯著。TNF-α 被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的啟動物質(zhì)，是其他促炎因子的上游因子[24]，能直接抑制成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化形成，最終導(dǎo)致骨形成不足[25]。IL- 1β則 不能直接促進(jìn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化，有研究證實，IL- 1β經(jīng)成骨細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子促進(jìn)破骨細(xì)胞活化，通過成骨細(xì)胞產(chǎn)生信號傳遞至破骨細(xì)胞產(chǎn)生骨吸收[26]，其主要作用是延長破骨細(xì)胞壽命增強破骨細(xì)胞活性，從而增加其吸收骨的能力[27]。本研究中 IL- 1β和TNF-α兩組間的差別可能與以上所述有關(guān)。

本研究僅觀察到炎癥因子可以引起牙周膜Eph 受體和ephrin 配體表達(dá)變化的現(xiàn)象，說明炎性因子對hPDLFs的作用有Eph受體和ephrin配體的參與，Eph受體和ephrin配體表達(dá)的變化是否會影響牙槽骨骨代謝的平衡，其具體作用機制還需要進(jìn)一步深入研究。目前只研究了炎癥對hPDLFs Eph4大亞族的影響，那么力和炎癥共同作用下，Eph家族會做出怎樣的應(yīng)答，力學(xué)信號是否能夠拮抗炎癥因子的作用都需要更多更深入的研究，本研究的發(fā)現(xiàn)為深入研究Eph家族蛋白在炎癥環(huán)境中引起牙槽骨改建的具體作用機制提供了初步的生物理論基礎(chǔ)。

綜上，炎癥因子TNF-α和IL- 1β均可引起hPDLFs Eph受體和ephrin配體的表達(dá)變化，ephrinA2隨刺激時間增加呈上升趨勢，Eph4呈時間依賴性降低，兩者引起Eph受體和ephrin配體的表達(dá)變化趨勢一致，但TNF-α的作用更顯著。