張慧敏 朱文烽 龐曉平 周鵬 陳方亮

阿爾茨海默?。ˋD）是一種慢性神經(jīng)退行性疾病，是造成老年人癡呆最主要的原因[1]。根據(jù)2014年的報(bào)道，全球大約有4千多萬(wàn)AD患者，預(yù)計(jì)到2050年，患者將增加至3倍[2]。AD的發(fā)生為患者及其家庭造成沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此AD的預(yù)防和治療成為當(dāng)下急需解決的醫(yī)療和社會(huì)問(wèn)題。各國(guó)癡呆診療指南均推薦膽堿酯酶抑制劑作為一線治療藥物，而膽堿酯酶抑制劑也在臨床中使用最為廣泛，代表性藥物為多奈哌齊[3-4]。APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠是目前最常用來(lái)評(píng)價(jià)AD治療藥物藥效以及考察藥物作用機(jī)制的動(dòng)物模型。因此本研究選用APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠，評(píng)價(jià)不同劑量多奈哌齊對(duì)該模型小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用，為進(jìn)一步研發(fā)新藥提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性9月齡APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠80只、同齡野生型小鼠20只均購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所（合格證號(hào)：0022834，201400204），并于 SPF 級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，光照時(shí)間為 8:00～20:00，室溫 20～26℃，濕度40%～70%。飼養(yǎng)期間小鼠自由進(jìn)食和飲水，手術(shù)前后單獨(dú)飼養(yǎng)。飼料購(gòu)于中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK-（軍）2002-001]。

1.2 儀器及試劑 Morris水迷宮（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）；跳臺(tái)（BW-YLS-3TB，上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；水浴鍋（HH.S，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；培養(yǎng)箱（XT5107，杭州雪中炭恒溫技術(shù)有限公司）；光度計(jì)（Ultrospec 6300pro，通用電氣醫(yī)療集團(tuán)生命科學(xué)部）；顯微鏡（NIB900-FL，Nexcope）；多奈哌齊（日本衛(wèi)才制藥公司，規(guī)格：5mg/片，批號(hào)：140355A），其溶液以蒸餾水為溶媒，現(xiàn)用現(xiàn)配，配制終濃度分別為0.1、0.3、0.6mg/ml，按小鼠每 10g體重 0.1ml劑量給藥。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組和給藥 小鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)房適應(yīng)1周后，將APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組、轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊1mg/kg組、轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊3mg/kg組和轉(zhuǎn)基因小鼠多奈哌齊6mg/kg組，每組20只，并以20只野生型基因小鼠作為野生型對(duì)照組。各組小鼠灌胃給藥1次/d（野生型小鼠對(duì)照組、轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組予等量蒸餾水），每周連續(xù)給藥5d，12周后進(jìn)行Morris水迷宮和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)。在水迷宮和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)前1h繼續(xù)給予實(shí)驗(yàn)藥物，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)期間每天觀察并記錄小鼠的一般狀態(tài)和飲食情況，實(shí)驗(yàn)開始前以及實(shí)驗(yàn)開始后每隔2周稱體重并記錄。

1.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮由一金屬圓柱形水池和自動(dòng)顯示、記錄裝置，以及安全島（平臺(tái)）組成。水池分為4個(gè)象限（東、南、西、北），平臺(tái)放置于第二象限的中心。水溫保持在（24±2）℃，水中加入牛奶，使水不透明，平臺(tái)位于水面以下1.0cm。每只小鼠每天接受2次訓(xùn)練，每次分別從兩個(gè)不同的入水點(diǎn)開始，2次訓(xùn)練間隔4h，記錄潛伏期（找到平臺(tái)的時(shí)間）。如果小鼠在60s內(nèi)未找到平臺(tái)，則潛伏期以60s計(jì)算。無(wú)論在60s內(nèi)找到平臺(tái)與否，均讓小鼠在平臺(tái)上停留30s。連續(xù)訓(xùn)練6d，最后1d訓(xùn)練24h后進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)，移去平臺(tái)，小鼠自由游泳60s尋找平臺(tái)，記錄小鼠第一次穿過(guò)平臺(tái)所在位置的時(shí)間和穿越平臺(tái)的次數(shù)。

1.3.3 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 小鼠跳臺(tái)裝置為1個(gè)長(zhǎng)方形反射箱，大小為10cm×10cm×30cm，用黑色塑料板分隔成為5間。底面為不銹鋼網(wǎng)柵，網(wǎng)柵間距為0.5cm。每間左后角放置一高3.2cm、直徑4.5cm的橡膠站臺(tái)。小鼠位于站臺(tái)上可免受電擊，當(dāng)小鼠跳下站臺(tái)時(shí)，則遭受到36伏電擊懲罰。本實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行3d，第1天為適應(yīng)階段，將小鼠面向墻角輕輕放置于站臺(tái)上，首先讓動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境5min，網(wǎng)柵不通電。第2天為學(xué)習(xí)階段，將小鼠面向墻角輕輕放置于站臺(tái)上，然后通以36伏交流電，持續(xù)3min。若動(dòng)物跳下站臺(tái)則受電擊，其正常反應(yīng)應(yīng)該是跳回站臺(tái)以躲避傷害性刺激，多數(shù)動(dòng)物可能會(huì)再次或多次跳至網(wǎng)柵上，受到電擊后又迅速跳回站臺(tái)。記錄每只小鼠受到電擊的次數(shù)（即錯(cuò)誤次數(shù)）。第3天為實(shí)驗(yàn)階段，即記憶保持實(shí)驗(yàn)。將小鼠放置于站臺(tái)上，通電觀察，并記錄第一次跳下站臺(tái)的潛伏期和3min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示。多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多奈哌齊對(duì)APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠一般狀態(tài)的影響 給藥前后APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠活動(dòng)良好，飲食正常。體重保持均勻，各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05），見表 1。

2.2 多奈哌齊對(duì)APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

2.2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示，隨著訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)，各組小鼠尋找到隱蔽平臺(tái)的潛伏期均逐漸縮短，轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠與野生型小鼠比較，尋找到隱蔽平臺(tái)的潛伏期顯著延長(zhǎng)（P＜0.05），提示轉(zhuǎn)基因小鼠有明顯的學(xué)習(xí)記憶功能缺失。而多奈哌齊不同劑量給藥組的潛伏期均逐漸縮短，但與轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。

訓(xùn)練階段結(jié)束后，進(jìn)行平臺(tái)探索實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠第一次穿越原平臺(tái)所在位置的時(shí)間較野生型小鼠明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），而穿越平臺(tái)次數(shù)比野生型小鼠

表1 多奈哌齊對(duì)APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠體重的影響（g）

表2 多奈哌齊對(duì)APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能（潛伏期）影響（s）

明顯減少（P＜0.01），提示APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)空間記憶功能的明顯損害。與轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組比較，無(wú)論是在穿越平臺(tái)時(shí)間還是在穿越次數(shù)上，多奈哌齊不同劑量給藥組均無(wú)明顯改善，見表3。

表3 多奈哌齊對(duì)APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能（穿越平臺(tái)）影響

2.2.2 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn) 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型對(duì)照組與轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠的潛伏期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。多奈哌齊不同劑量給藥組的潛伏期與野生型對(duì)照組與轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M相比較均無(wú)明顯改變（見表4）。野生型對(duì)照組的錯(cuò)誤次數(shù)僅為0.6±0.2，而轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)為2.6±1.6，與野生型小鼠對(duì)照組相比具有增加的趨勢(shì)，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），提示轉(zhuǎn)基因小鼠有一定程度的記憶缺失。給予多奈哌齊后，小鼠的錯(cuò)誤次數(shù)均有減低，但個(gè)體差異較大，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 多奈哌齊對(duì)APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能（跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)）影響

3 討論

AD是老年人中最常見的認(rèn)知功能進(jìn)行性下降的疾病，是發(fā)生在中樞神經(jīng)的一種病因復(fù)雜的原發(fā)性神經(jīng)退行性疾病[5]。由于AD的發(fā)病是多因素交叉引起，病理及生化的改變是多方面的，眾多的學(xué)者在研究過(guò)程中，形成了各自不同的假說(shuō)，其中Aβ淀粉樣肽學(xué)說(shuō)是目前大家對(duì)AD比較公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制[6]。而APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型是經(jīng)典的AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型之一，此模型可穩(wěn)定表達(dá)人類突變基因APP和PS1，引起細(xì)胞外淀粉樣蛋白的沉積[7]，其優(yōu)勢(shì)是將兩個(gè)易感基因結(jié)合在一起，從而縮短病理變化時(shí)間，并使病理特征多樣化，能夠較好的模擬AD患者早期病理和行為特征[8]以及AD患者膽堿能系統(tǒng)的改變。多奈哌齊是目前臨床使用較廣泛的抗AD藥物之一[9]，本研究考查多奈哌齊對(duì)APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶改善作用。

在經(jīng)典的學(xué)習(xí)記憶實(shí)驗(yàn)-水迷宮實(shí)驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠具有明顯的學(xué)習(xí)記憶缺失，但多奈哌齊對(duì)APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能缺失無(wú)明顯改善作用，提示在此動(dòng)物模型中多奈哌齊治療AD的作用沒(méi)有達(dá)到預(yù)期效果。

跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)是一種抑制性被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)，在記憶研究中，動(dòng)物模型最重要的特點(diǎn)是抑制模仿活動(dòng)或?qū)W習(xí)習(xí)慣。被動(dòng)回避實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物學(xué)會(huì)去掉某種特定的行為而逃避某種厭惡的事情。跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M小鼠第一次穿越原平臺(tái)的時(shí)間較野生型小鼠明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），而穿越平臺(tái)次數(shù)比野生型小鼠明顯減少（P＜0.01），長(zhǎng)期給予多奈哌齊不同劑量給藥組均不能縮短轉(zhuǎn)基因小鼠第一次穿越平臺(tái)的時(shí)間；多奈哌齊不同劑量給藥組的跳臺(tái)潛伏期與兩對(duì)照組相比較均無(wú)明顯改變，但跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)均有減低，且個(gè)體差異較大，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，經(jīng)典行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，多奈哌齊并不能改善APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。多奈哌齊主要通過(guò)增加AD患者腦內(nèi)乙酰膽堿水平而發(fā)揮學(xué)習(xí)記憶改善作用，在東莨菪堿誘導(dǎo)的小鼠癡呆模型中，多奈哌齊顯示了良好的學(xué)習(xí)記憶改善作用[10]。但APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶缺失主要是由于APP和PS1基因突變引起的細(xì)胞外淀粉樣蛋白沉積引起，多奈哌齊可能并不能改善APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的Aβ淀粉樣斑塊沉積而發(fā)揮抗AD作用。但在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，多奈哌齊不同劑量給藥組的跳臺(tái)潛伏期與兩對(duì)照組相比較雖沒(méi)有明顯改變，但跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)均有減低，提示APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠可能也伴有膽堿能系統(tǒng)功能的紊亂，但并不是引起APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠AD的主要原因。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示多奈哌齊不能改善APP/PS1-AD轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能缺失。同時(shí)，本研究也提示了AD的發(fā)病是機(jī)制的復(fù)雜，至今并沒(méi)有哪一種假說(shuō)能夠完全地解釋AD的發(fā)生、發(fā)展。